抗扎伊爾型埃博拉病毒單克隆抗體的制備和鑒定

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埃博拉病毒病(Ebola virus disease)是由埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)感染所致的一種急性傳染病，病死率可高達(dá)90%[1]。EBOV自1976年在前扎伊爾的一個(gè)村莊被發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)引起多次暴發(fā)流行[1]。2013年底，埃博拉疫情在幾內(nèi)亞開始流行，并很快蔓延到利比里亞、塞拉利昂和尼日利亞等西非國家[2]，2014年8月8日，世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布，西非暴發(fā)的埃博拉疫情是國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件。

埃博拉病毒屬于絲狀病毒科埃博拉病毒屬[3]，埃博拉病毒屬包括扎伊爾埃博拉病毒(Zaire ebolavirus，ZEBOV)、蘇丹埃博拉病毒(Sudan ebolavirus，SEBOV)、雷斯頓埃博拉病毒(Reston ebolavirus，REBOV)、塔伊森林埃博拉病毒(Tai Forest ebolavirus，TAFV)和本迪布焦埃博拉病毒(Bundibugyoe ebolavirus，BEBOV)等6種病毒[4-5]，其中本迪布焦型、扎伊爾型和蘇丹型曾造成非洲的埃博拉暴發(fā)流行。埃博拉病毒基因組是線性、單股負(fù)鏈的RNA，大小約19 kb，相對分子質(zhì)量為4.2×106Da[6-7]。埃博拉病毒RNA基因組可編碼7種病毒蛋白，包括 VP30、VP35、 RNA依賴性RNA聚合酶、NP、VP40、糖蛋白、VP24[8-10]。與病毒結(jié)構(gòu)蛋白(VP30, VP35, RNA-dependent RNA polymerase)和膜蛋白(VP40、glycoprotein and VP24)相比，NP蛋白在埃博拉病毒中豐度高，檢測靈敏度強(qiáng)，是疾病診斷與監(jiān)測中的靶標(biāo)分子。由于NP靶蛋白C末端110個(gè)氨基酸片段具有很強(qiáng)的抗原性，因此可成為制備單克隆抗體的候選靶基因[11]。

2014-2016年西非的埃博拉出血熱疫情主要是由扎伊爾型埃博拉病毒引起的。由于當(dāng)?shù)蒯t(yī)療條件滯后，不能及時(shí)、有效地進(jìn)行病毒感染的診斷，對患者處理不當(dāng)，導(dǎo)致疫情廣泛傳播[12]。隨著貿(mào)易全球化、氣候變暖、人類活動(dòng)范圍的擴(kuò)大等，增加了自然或人為感染EBOV的概率，盡管我國還未有埃博拉病毒輸入性感染的病例，但開展特異性好和安全的現(xiàn)場快速診斷技術(shù)研究對埃博拉病毒病的早期診斷和預(yù)防尤為重要。由于埃博拉病毒是危害等級為一類病原微生物，國內(nèi)沒有原發(fā)或輸入病例，且暫無可分離培養(yǎng)埃博拉病毒的生物安全四級實(shí)驗(yàn)室，很難得到流行毒株。因此本研究依據(jù)文獻(xiàn)合成扎伊爾型埃博拉病毒核蛋白多肽免疫動(dòng)物，進(jìn)行細(xì)胞融合并篩選雜交瘤細(xì)胞，制備單克隆抗體，構(gòu)建4種埃博拉病亞型真核表達(dá)載體(pFLAG-CMV-Zaire-NP, pFLAG-CMV-Reston-NP, pFLAG-CMV-Tai Forest-NP、pFLAG-CMV-Sudan-NP)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)重組核蛋白，并以重組核蛋白為抗原對制備的抗扎伊爾型病毒核蛋白的單克隆抗體進(jìn)行特異性鑒定，為埃博拉病毒病的現(xiàn)場快速診斷方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 大腸埃希菌DH5α、HEK293T細(xì)胞均為中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)研究院未知病原分析室保存；pFLAG-CMV-Zaire-NP、pFLAG-CMV-Reston-NP、pFLAG-CMV-Tai Forest-NP、pFLAG-CMV-Sudan-NP質(zhì)粒由生工生物工程有限公司依據(jù)我們提供的核酸序列合成；質(zhì)粒提取試劑盒購自QIAGEN公司；DMEM購自北京康徹賽爾生物公司；胎牛血清購自CLESON公司；X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent 購自Roche公司；30%丙烯酰胺購自北京普利萊公司；抗Flag標(biāo)簽小鼠單抗購自北京銳抗生物公司；IRDye 800CW 羊抗鼠IgG購自LI-COR公司；緩沖鹽等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2扎伊爾型埃博拉病毒NP優(yōu)勢抗原表位預(yù)測和抗原多肽合成 通過生物信息學(xué)軟件DNAstar Protean預(yù)測埃博拉病毒NP氨基酸序列(ZEBOV-NP)的二級結(jié)構(gòu)、親疏水性及抗原性，并用BLAST進(jìn)行同源性分析，篩選優(yōu)勢抗原表位，進(jìn)而送上海生物技術(shù)公司人工合成多肽免疫原。

1.3 扎伊爾型埃博拉病毒單克隆抗體的制備

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫 將人工合成的扎伊爾型NP多肽免疫原與弗氏完全佐劑乳化后，皮下多點(diǎn)注射6～8周齡BALB/c小鼠。每隔2周免疫1次，加強(qiáng)免疫3次。融合前3 d經(jīng)腹腔注射加強(qiáng)免疫一次。

1.3.2細(xì)胞融合 用正常小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞，在聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)的作用下進(jìn)行細(xì)胞融合。融合細(xì)胞終止后離心并棄掉上清，加入預(yù)溫的選擇培養(yǎng)基HAT (1%谷氨酰胺+1%氯霉素和卡那霉素+2% HAT+20%血清)，繼續(xù)培養(yǎng)，約7～10 d，當(dāng)有融合細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)，進(jìn)行篩選克隆。

1.3.3雜交瘤細(xì)胞的篩選 將融合后的細(xì)胞鋪于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)7 d后，倒置相差顯微鏡下可觀察到細(xì)胞較大，渾圓透亮，融合細(xì)胞集落呈葡萄串狀，即雜交瘤細(xì)胞。未融合細(xì)胞逐漸死亡，裂解。吸取有雜交瘤細(xì)胞生長的細(xì)胞孔的培養(yǎng)上清，間接ELISA檢測抗體分泌。將陽性克隆孔用有限稀釋法進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)過細(xì)胞單克隆株的篩選，共得到能分泌抗扎伊爾型核蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞12株，編號分別為ZNP1F12、ZNP2G4、ZNP3B3、ZNP3F10、ZNP5E3、ZNP6E1、ZNP12C3、ZNP4F2、ZNP14E2、ZNP15F11、ZNP9G8、ZNP7D5。

1.3.4小鼠腹水的制備 取8～10周 BALB/c小鼠腹腔注射滅菌液體石蠟，7 d后每只小鼠腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，待注射后7～10 d，小鼠腹部明顯隆起時(shí)收集腹水，離心收集上清，傳統(tǒng)正辛酸-飽和硫酸銨法提取腹水單抗[13-14]，紫外分光光度法測量蛋白濃度。

1.3.5腹水效價(jià)測定與單克隆抗體分型 采用間接ELISA方法檢測腹水效價(jià)。將含單克隆抗體的腹水上清從1∶1 600開始用PBS連續(xù)倍比稀釋(按照1∶2)，加到包被有埃博拉病毒NP抗原多肽的KLH的板上，每個(gè)樣品平行做兩份，PBS為陰性對照。加入終止液，酶標(biāo)儀測定OD450的吸光值，陽性反應(yīng)的最大稀釋度為所測樣品的效價(jià)。采用小鼠單抗快速分型試劑盒(Pierce Rapid Isotyping Kits-Mouse)對單克隆抗體亞型進(jìn)行鑒定。

1.4抗扎伊爾型埃博拉病毒單克隆抗體的特異性鑒定

1.4.1埃博拉病毒真核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)埃博拉病毒四型NP基因序列，用OVERLAP方法形成模板DNA，再用PCR方法得到雙鏈DNA，亞克隆到pFlag-CMV-2載體，構(gòu)建4種埃博拉病毒高效表達(dá)的重組質(zhì)粒(pFLAG-CMV-Zaire-NP、pFLAG-CMV-Reston-NP、pFLAG-CMV-Tai Forest-NP、pFLAG-CMV-Sudan-NP)，將4種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α菌株，并用含Amp的平皿篩選重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒測序正確后，用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent高效真核轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞，培養(yǎng)24～48 h后收集細(xì)胞。

1.4.2埃博拉病毒真核表達(dá)蛋白的鑒定 提取4種轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞總蛋白，并以未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞作為陰性對照，100 ℃加熱5 min后離心收集上清液，并用BCA微量蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度，取10 μg細(xì)胞的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，經(jīng)含5%的脫脂牛奶TBST溶解封閉過夜后，分別與加入一抗(鼠源性Flag單克隆抗體)和二抗(羊抗鼠IgG)孵育后，用LI-COR Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描條帶后進(jìn)行圖像分析。

1.4.3抗體特異性的鑒定 用4種埃博拉病毒真核表達(dá)的重組蛋白作為抗原，1.3.4中小鼠腹水單抗為一抗，用免疫印跡法鑒定單抗的特異性，并篩選出能夠分泌高特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

2 結(jié) 果

2.1根據(jù)扎伊爾型埃博拉病毒核蛋白抗原表位預(yù)測結(jié)果設(shè)計(jì)抗原多肽 通過DNAStar Protean軟件分析ZEBOV NP氨基酸序列N或C末端抗原峰，表明EBOV-NP最主要的抗原峰集中在C端的420～739 aa區(qū)間，呈連續(xù)高峰，其N端僅有少量的抗原高峰。通過BLAST對所選的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，選取特異性較好的氨基酸肽段。根據(jù)生物信息軟件預(yù)測分析結(jié)果設(shè)計(jì)了ZEBOV NP特異性抗原多肽(aa611-630: YRDHSEKKELPQDEQQDQDH)。

2.2腹水效價(jià)測定 通過間接ELISA方法檢測所制備腹水效價(jià)(見表1)，表明雜交瘤細(xì)胞株腹水抗體效價(jià)分別介于1∶104～1∶105。使用小鼠單抗分型試劑盒對扎伊爾型細(xì)胞株分泌的抗體型別進(jìn)行檢測，如表1：其中有1株IgG2a型(ZNP9G8)，2株IgM型(ZNP3B3、ZNP4F2)，2株IgG2b型(ZNP14E2、ZNP3F10)，其余7株為IgG1型。

表1 埃博拉病毒NP單克隆抗體分型及腹水效價(jià)測定
Tab.1 IsotyPes and antibody titers of aseite fiuid of Ebola virus NP-specific mAbs

單抗株克隆編號單抗型別腹水(滴度)OD450ZNP1F12IgG11∶4.096×1050.26ZNP2G4IgG11∶8.192×1050.26ZNP3B3IgM1∶1.624×1050.29ZNP3F10IgG2b1∶1.024×1050.25ZNP5E3IgG11∶4.096×1050.26ZNP6E1IgG11∶5.120×1040.26ZNP12C3IgG11∶2.560×1040.28ZNP4F2IgM1∶2.048×1050.22ZNP14E2IgG2b1∶2.048×1050.33ZNP15F11IgG11∶4.096×1050.29ZNP9G8IgG2a1∶8.192×1050.22ZNP7D5IgG11∶4.096×1050.20

2.3埃博拉病毒4種亞型NP重組質(zhì)粒的構(gòu)建和真核重組表達(dá)蛋白的鑒定 4種重組表達(dá)質(zhì)粒的DNA測序結(jié)果表明插入的序列完全正確，成功構(gòu)建了4種埃博拉病毒NP蛋白的重組質(zhì)粒。將構(gòu)建成功的4種埃博拉病毒NP重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，Western blot鑒定4種NP融合蛋白的表達(dá)。如圖1：埃博拉病毒四種亞型的NP融合蛋白分子量大小介于95～120 kDa之間，均檢測到一條特異性蛋白印跡條帶，而未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的對照組無相應(yīng)條帶出現(xiàn)。說明埃博拉病毒4種亞型的NP重組蛋白真核表達(dá)成功。

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：Zaire-NP； 2：Reston-NP；3： Tai Forest-NP；4： Sudan-NP；5：對照圖1 免疫印跡法檢測四種埃博拉病毒真核重組蛋白的表達(dá)Fig.1 Detection of eukaryotic recombinant protein of four Ebola virus by Western blot

2.4抗扎伊爾型埃博拉病毒NP蛋白的單克隆抗體特異性的鑒定 為獲得特異性較高單抗細(xì)胞株，將轉(zhuǎn)染表達(dá)的Zaire-NP、Reston-NP、Tai Forest-NP、Sudan-NP蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉，與收集的陽性克隆細(xì)胞上清一起4 ℃過夜孵育，分別對獲得的12株抗EBOV NP單克隆細(xì)胞株進(jìn)行免疫印跡分析。如圖2所示，有9株(ZNP1F12、ZNP2G4、ZNP3B3、ZNP5E3、ZNP6E1、ZNP12C3、ZNP4F2、ZNP9G8、ZNP7D5)與其他型別Reston-NP、Tai Forest-NP、Sudan-NP抗原另存在不同程度的交叉反應(yīng)(圖2)，特異性不強(qiáng)。另外3株(ZNP3F10、ZNP14E2、ZNP15F11)單克隆細(xì)胞株只與Zaire-NP抗原產(chǎn)生反應(yīng)，與外3種亞型的埃博拉病毒NP蛋白抗原無交叉反應(yīng)，表明這3株細(xì)胞分泌的單克隆抗體特異性較高。

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：Zaire-NP； 2：Reston-NP；3： Tai Forest-NP；4： Sudan-NP圖2 免疫印跡法檢測抗扎伊爾型單克隆抗體的特異性Fig.2 Detection of the specificity of monoclonal antibodies against Zaire Ebola virus by Western blot

3 討 論

本研究依據(jù)扎伊爾型埃博拉病毒核蛋白序列合成多肽免疫小鼠，成功制備出抗扎伊爾型埃博拉病毒單克隆抗體，并對制備單克隆抗體進(jìn)行了效價(jià)測定和單抗分型。同時(shí)用4種埃博拉病毒亞型重組載體(pFLAG-CMV-Zaire-NP、pFLAG-CMV-Reston-NP、pFLAG-CMV-Tai Forest-NP、pFLAG-CMV-Sudan-NP)的真核表達(dá)蛋白為抗原對單克隆抗體的特異性和交叉反應(yīng)進(jìn)行鑒定，最終成功篩選出特異性高的抗扎伊爾型單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞3株，這3株細(xì)胞分泌的抗體效價(jià)高，且都屬于IgG型抗體，相對IgM型抗體較穩(wěn)定，效價(jià)不易下降。

現(xiàn)有的埃博拉病毒的檢測技術(shù)包括病毒的分離培養(yǎng)、IgM和IgG抗體的檢測、熒光定量PCR、恒溫核酸檢測技術(shù)、免疫組化及免疫熒光等技術(shù)等[15]。然而，埃博拉病毒分離培養(yǎng)需生物安全四級實(shí)驗(yàn)室，分離培養(yǎng)時(shí)間長，并且埃博拉病毒傳染性強(qiáng)，潛伏期短，病情進(jìn)展快，病死率高，急需建立快速檢測方法；而IgM和IgG抗體的檢測及免疫組化技術(shù)等方法需要高效價(jià)和特異性好的單克隆抗體，因此制備出特異性高的埃博拉單克隆抗體并篩選出能分泌埃博拉單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞尤為重要。

目前已知的埃博拉病毒屬的5個(gè)種中，扎伊爾型對人致病性最強(qiáng)，致死率為60%～90%；蘇丹型、本迪布焦型次之，致死率為40%～60%[10]；雷斯頓、塔伊森林型對黑猩猩致病性強(qiáng)，但對人致病性較弱，至今尚無引起疾病或死亡的報(bào)道。單克隆抗體制備過程長和工作量大，埃博拉病毒抗體特異性的鑒定當(dāng)然最好是選擇4種亞型的埃博拉活病毒，但埃博拉病毒屬于危害等級為一類的病原微生物生物，操作需在生物安全P4級實(shí)驗(yàn)室完成，因此在活毒株來源有限條件下，利用基因工程技術(shù)合成重組NP蛋白是目前實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行埃博拉免疫學(xué)研究的主要途徑。然而在實(shí)際應(yīng)用中，抗體最終識別的是病毒的天然蛋白，因此對抗原的設(shè)計(jì)要求更加嚴(yán)格，根據(jù)多肽序列設(shè)計(jì)原則，本研究設(shè)計(jì)的ZEBOV-NP抗原肽段純度較高，與載體蛋白偶聯(lián)后免疫效果良好。而重組蛋白真核表達(dá)是獲取大量目的蛋白的途徑，并且哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的外源性蛋白的生物學(xué)活性最高，其抗原性更接近天然蛋白，因此利用真核表達(dá)的蛋白抗原代替不易得到的強(qiáng)毒性活病毒來鑒定抗體的特異性在抗體制備研究中應(yīng)用廣泛，準(zhǔn)確可靠[16-17]。本研究成功制備效價(jià)高和特異性好的抗扎伊爾型埃博拉病毒抗體，為建立快速檢測埃博拉病毒的方法奠定基礎(chǔ)。