顆粒細(xì)胞端粒長(zhǎng)度預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能及妊娠率的臨床研究

李楠 唐妮 韋立紅 李忻琳 林忠

柳州市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心（廣西柳州545001）

人類輔助生育技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）已經(jīng)歷了30多年的發(fā)展，獲得了一系列的突破性進(jìn)展，成為不孕不育夫婦治療的首選［1］。移植高質(zhì)量的胚胎將可以決定臨床妊娠率，因此胚胎質(zhì)量是決定胚胎移植成功的關(guān)鍵因素。目前臨床上主要應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法篩選胚胎，形態(tài)學(xué)評(píng)估由于其無創(chuàng)，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，成為目前實(shí)驗(yàn)室胚胎選擇的常規(guī)方法［2］。該方法是指在倒置顯微鏡下，對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的胚胎進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)分，將評(píng)分結(jié)果好的胚胎用于移植［3］。但是該方法存在缺陷，如胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分并不能全面地反映胚胎的發(fā)育潛能，過多依賴于實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員的主觀判斷標(biāo)準(zhǔn)，觀察時(shí)間過短，數(shù)據(jù)之間缺乏聯(lián)系，同時(shí)缺少客觀可量化的指標(biāo)等［4］，都有可能影響最終臨床妊娠率（pregnancy rate，PR）。因此如何提高預(yù)測(cè)早期胚胎發(fā)育潛能的能力和臨床妊娠率成為ART面臨的巨大問題，發(fā)現(xiàn)新的胚胎發(fā)育潛能標(biāo)記物成為胚胎學(xué)家的研究熱點(diǎn)［5］。

卵母細(xì)胞顆粒細(xì)胞作為卵母細(xì)胞生存的主要內(nèi)環(huán)境，對(duì)卵母細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和成熟起到非常重要的作用［6］。卵丘顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞形成卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，與卵母細(xì)胞間存在著廣泛的細(xì)胞間連接，參與卵泡的募集、發(fā)育和優(yōu)勢(shì)化，保證卵母細(xì)胞正常的成熟分裂過程。相互交換物質(zhì)、促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育、成熟［7］。端粒（telomere）是線狀染色體末端的DNA重復(fù)序列（TTAGGG），隨著細(xì)胞分裂而逐漸縮短到一定程度后細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡。端粒的功能包括維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性，防止染色體被核酸酶降解及染色體間相互融合，防止染色體結(jié)構(gòu)基因在復(fù)制時(shí)丟失，細(xì)胞的凋亡也受到端粒和端粒酶調(diào)控［8］。隨著細(xì)胞分裂，端粒不斷縮短，當(dāng)端?？s短至其閾值時(shí)細(xì)胞凋亡。研究卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞端粒，將為成熟卵母細(xì)胞、優(yōu)質(zhì)胚胎選擇提供客觀、準(zhǔn)確且無創(chuàng)的方法，從而提高妊娠率［9］。LIU等［10］建立了敲除小鼠端粒酶基因的模型，研究其代數(shù)與繁殖力的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著代數(shù)增加，獲卵數(shù)、受精率、優(yōu)胚率和種植率逐漸降低。YAMADA等［11］研究認(rèn)為高齡小鼠卵母細(xì)胞質(zhì)量下降的原因與胞質(zhì)內(nèi)活性氧基團(tuán)的積累有關(guān)。隨著年齡增加，端粒逐漸縮短，活性氧基團(tuán)累積越多，會(huì)破壞染色體的穩(wěn)定而影響繁殖能力。國(guó)內(nèi)有文章顯示卵丘顆粒細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與卵母細(xì)胞的成熟度和妊娠結(jié)局密切相關(guān)，具有較高的臨床研究?jī)r(jià)值［12］。但是仍然需要大樣本多中心的研究數(shù)據(jù)。

本研究選擇2015年1月至2017年6月在柳州市婦幼保健院生殖健康助孕中心行ICSI-ET的患者，通過測(cè)定患者顆粒細(xì)胞端粒的相對(duì)長(zhǎng)度，研究不同年齡組的端粒長(zhǎng)度與臨床妊娠結(jié)局的關(guān)系，為臨床胚胎移植時(shí)選擇最具發(fā)育潛能的胚胎提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年10月至2017年6月在柳州市婦幼保健院生殖健康助孕中心行ICSI-ET的患者納入本研究。所選患者之間女方年齡、不孕年限、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案等方面比較，差異均無顯著性（P＞0.05），見表1。

表1 入選患者基本信息Tab.1 Demographic data for couples undergoing ARTs

1.2 控制性超促排卵 所有患者均采用柳州市婦幼保健院生殖健康助孕中心常規(guī)的促排卵方案。在月經(jīng)周期的第4天開始促排，根據(jù)B超監(jiān)測(cè)和血清雌二醇（Estradiol，E2）水平調(diào)整藥物劑量，當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑達(dá)18 mm時(shí)肌肉注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）（Serono，德國(guó)）10 000 U，34～36 h后在B超引導(dǎo)下取卵［13］。

1.3 ICSI與胚胎培養(yǎng) 精液收集及處理方法按照我中心常規(guī)處理方法簡(jiǎn)述如下，男方通過手淫法取精，液化后使用Isolate密度梯度離心法（Irvine，America）對(duì)精液進(jìn)行梯度離心，G-IVF授精液（Vitro Life，Sweden）上游法處理精液。

卵子放入G-IVF中2～5 h后，經(jīng)過酶消化后去除顆粒細(xì)胞，行ICSI授精，轉(zhuǎn)入序貫培養(yǎng)液Cook，觀察受精情況并進(jìn)行原核評(píng)分。第3天觀察胚胎分裂情況即常規(guī)評(píng)估胚胎。根據(jù)患者簽署知情同意書的情況將剩余胚胎進(jìn)行繼續(xù)囊胚培養(yǎng)或冷凍。培養(yǎng)至第5天或第6天觀察囊胚形成情況進(jìn)行將囊胚移植或者冷凍。

胚胎培養(yǎng)及受精所用液體均在CO2培養(yǎng)箱（6.0%CO2、37℃、100%濕度環(huán)境）中平衡過夜［14］。

1.4 胚胎移植及妊娠判斷 將胚胎轉(zhuǎn)移至移植導(dǎo)管在B超引導(dǎo)下移植入患者子宮。胚胎移植后D15檢測(cè)血hCG，D35超聲檢查見妊娠囊和心血管波動(dòng)判定為臨床妊娠。

1.5 顆粒細(xì)胞的采集與保存 經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵，將卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞放入G-IVF中2～5 h后，經(jīng)過酶消化后去除顆粒細(xì)胞，將顆粒細(xì)胞混合，在PBS緩沖液中1 500 r/s×5 min，反復(fù)離心洗滌3次后將所收集的顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中，將收集顆粒細(xì)胞的EP管置于-80℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 提取顆粒細(xì)胞的DNA和檢測(cè)端粒長(zhǎng)度

1.6.1 DNA提取 DNA提取試劑盒（DNeasy Tissue Kit，Qiagen，Inc.Mississauga，Ontario，Canada）用于提取顆粒細(xì)胞中的DNA。簡(jiǎn)述如下，將顆粒細(xì)胞沉淀中加入Protease K 20 μL、Buffer AL 200 μL，混勻后56℃水浴10 min。加入無水乙醇200 μL/管，混勻后轉(zhuǎn)移入Spin Colunm，室溫下以13 200 r/min離心2.5 min。棄濾液，將Spin Column移入清潔收集管中，加 AWl液 600 μL，室溫下以 13 200 r/min離心2.5 min。棄濾液，將Spin Column移入另一清潔收集管中加AW2液600 μL，室溫下以13 200 r/min離心2.5 min。棄濾液，將Spin Column轉(zhuǎn)移入已標(biāo)患者姓名的新1.5 mL離心管中，加Buffer AE 300 μL，室溫下以13 200 r/min離心2.5 min。核對(duì)標(biāo)本姓名及編碼，收集離心管內(nèi)液體（即提出的DNA），用超微量分光光度計(jì)測(cè)定OD260和OD280，-20℃保存?zhèn)溆谩ＨNA溶液1 μL分別測(cè)260、280 nm波長(zhǎng)下的光密度（OD）值，然后計(jì)算OD260nm/OD280nm的比值。

1.6.2 引物的設(shè)計(jì)、合成與端粒長(zhǎng)度檢測(cè) 引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)，由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成，PCR反應(yīng)引物序列見表2。

表2 引物序列Tab.2 Primers sequences

1.6.3 QRT-PCR反應(yīng)體系及條件 QRT-PCR購買北京康為世紀(jì)公司試劑盒，PCR儀為ABI7500。按照表3的反應(yīng)體系進(jìn)行試驗(yàn)。具體反應(yīng)條件及步驟如下，（1）第一步：（預(yù)變性）94℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；（2）第二步：（PCR反應(yīng)）94℃ 15 s、58℃ 30 s、72℃30 s、83 ℃ 20 s（測(cè)定熒光），40個(gè)循環(huán)；（3）第三步：（溶解曲線分析）95℃ 20 s、65℃ 15 s、95℃ 0 s，1個(gè)循環(huán)。每次qRT-PCR反應(yīng)均重復(fù)3次，根據(jù)CAWTHON等［15］的公式計(jì)算端粒長(zhǎng)度：T/S相對(duì)比值=2-（△Cts-Ctc）=2-△△Ct。注：△Cts=Ct（telomeres）sample-Ct（36B4）sample，△Cts=Ct（telomeres）calibrator-Ct（36B4）calibrator。

表3 反應(yīng)體系Tab.3 Reaction system

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，使用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料兩組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，將卵母細(xì)胞顆粒細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與臨床妊娠率之間進(jìn)行單因素Logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同年齡組別顆粒細(xì)胞端粒長(zhǎng)度差異的研究 低齡組顆粒細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與高齡組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（4.69±0.88vs.3.78±0.69，P＜0.05）。隨著年齡增加，顆粒細(xì)胞端粒長(zhǎng)度呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。

2.2 低齡組和高齡組患者妊娠者與未妊娠者端粒長(zhǎng)度比較 見表4，低齡組高發(fā)育潛能胚胎的卵母細(xì)胞顆粒細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度大于低發(fā)育潛能胚胎（P＜0.05）。見表5，高齡組高發(fā)育潛能胚胎的卵母細(xì)胞顆粒細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度大于低發(fā)育潛能胚胎（P＜0.05）。

表4 低齡組（≤35歲組）卵母細(xì)胞顆粒細(xì)胞端粒長(zhǎng)度及胚胎發(fā)育情況比較Tab.4 Effects of telomere length in granulosa cells of patients with different age on ICSI treatment ±s

表4 低齡組（≤35歲組）卵母細(xì)胞顆粒細(xì)胞端粒長(zhǎng)度及胚胎發(fā)育情況比較Tab.4 Effects of telomere length in granulosa cells of patients with different age on ICSI treatment ±s

胚胎發(fā)育情況妊娠組（高發(fā)育潛能的胚胎）未妊娠組（低發(fā)育潛能的胚胎）顆粒細(xì)胞端粒長(zhǎng)度（T/S值）4.69±0.78 3.25±0.56

表5 高齡組（＞35歲組）卵母細(xì)胞顆粒細(xì)胞端粒長(zhǎng)度及胚胎發(fā)育情況比較Tab.5 Effects of telomere length in granulosa cells of patients with different age on ICSI treatment ±s

表5 高齡組（＞35歲組）卵母細(xì)胞顆粒細(xì)胞端粒長(zhǎng)度及胚胎發(fā)育情況比較Tab.5 Effects of telomere length in granulosa cells of patients with different age on ICSI treatment ±s

胚胎發(fā)育情況妊娠組（高發(fā)育潛能的胚胎）未妊娠組（低發(fā)育潛能的胚胎）顆粒細(xì)胞端粒長(zhǎng)度（T/S值）4.09±0.93 2.92±0.84

2.3 端粒長(zhǎng)度與臨床妊娠率的相關(guān)性分析 見表6，Logistic回歸顯示端粒長(zhǎng)度與臨床妊娠率（≤35歲組和＞35歲組）有關(guān)。

表6 Logistic邏輯回歸分析端粒長(zhǎng)度與臨床妊娠率的關(guān)系Tab.6 Logistic analysis of pregnancy rate according to different age

3 討論

端粒是染色體末端一種特殊的帽狀結(jié)構(gòu)，由重復(fù)串聯(lián)的TTAGGG序列和酶構(gòu)成［9］，在維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性，防止染色體被核酸酶降解及染色體間相互融合，防止基因在復(fù)制時(shí)丟失等方面起到重要作用。端粒是細(xì)胞的“生命時(shí)鐘”，細(xì)胞每分裂一次，端粒DNA就會(huì)減少一定的數(shù)目，當(dāng)端粒長(zhǎng)度縮短到極限時(shí)細(xì)胞就會(huì)停止分裂，失去保護(hù)染色體末端的能力，進(jìn)而出現(xiàn)染色體變性、溶解，引起細(xì)胞衰老或死亡。端粒除了受年齡影響外，還受如端粒酶活性、環(huán)境因素等因素的影響。

卵泡的發(fā)育及成熟是一個(gè)高度復(fù)雜而有序的過程。卵泡發(fā)育的過程是卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞相互作用、共同成熟的過程。顆粒細(xì)胞作為卵母細(xì)胞生存的內(nèi)環(huán)境，參與卵泡的募集、發(fā)育，在卵母細(xì)胞成熟過程中互相作用，提供營(yíng)養(yǎng)，保證卵母細(xì)胞正常的成熟。GUO等［16］研究證明端粒越長(zhǎng)其所對(duì)應(yīng)的卵母細(xì)胞發(fā)育潛力越強(qiáng)，而端粒長(zhǎng)度較短的卵母細(xì)胞發(fā)育的胚胎質(zhì)量較差，同時(shí)顆粒細(xì)胞凋亡較多則不利于卵母細(xì)胞的成熟。FESAHAT等［17］研究顯示，通過利用模式生物大鼠研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞端粒酶長(zhǎng)度縮短可能導(dǎo)致卵泡發(fā)生閉鎖。顆粒細(xì)胞中特定的基因與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和胞核成熟密切相關(guān)。若顆粒細(xì)胞的端粒因缺乏端粒酶而不斷縮短，最終會(huì)阻礙卵母細(xì)胞成熟。在細(xì)胞分裂過程中會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基（ROX），ROX對(duì)鳥嘌呤特別敏感，ROX會(huì)結(jié)合到染色體末端的端粒上，大量的氧化反應(yīng)會(huì)引起顆粒細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)受損，引起顆粒細(xì)胞染色體斷裂，細(xì)胞衰老、凋亡。顆粒細(xì)胞的凋亡信號(hào)經(jīng)過縫隙連接進(jìn)入卵母細(xì)胞而影響卵母細(xì)胞的成熟。

端粒與女性生殖能力密切相關(guān)。隨著女性年齡得增加，卵巢功能呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。細(xì)胞復(fù)制次數(shù)隨著年齡而增多，所獲得卵母細(xì)胞的質(zhì)量也呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，染色體異常率增加，女性的生殖能力顯著下降。本研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與年齡呈負(fù)相關(guān)，與其他研究結(jié)果相似。其原因?yàn)轭w粒細(xì)胞凋亡率增加，導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，胚胎發(fā)育能力下降，胚胎移植后妊娠率降低［18］。也有學(xué)者研究了大鼠卵泡閉鎖與端粒酶之間關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)端粒酶活性降低導(dǎo)致端粒縮短，進(jìn)而引起卵泡閉鎖，卵母細(xì)胞成熟率下降［19］，提示顆粒細(xì)胞的凋亡與卵母細(xì)胞的成熟、受精能力及早期胚胎質(zhì)量密切相關(guān)。在2000年HOST等［20］的研究也得到相似的結(jié)果。CHENG等［21］對(duì)顆粒細(xì)胞與胚胎發(fā)育能力的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較長(zhǎng)端粒的顆粒細(xì)胞有利于形成優(yōu)質(zhì)成熟的卵母細(xì)胞和高質(zhì)量胚胎。

高質(zhì)量的胚胎的顆粒細(xì)胞端粒長(zhǎng)度要大于低質(zhì)量胚胎的顆粒細(xì)胞端粒長(zhǎng)度，且具有較高的妊娠率。因此顆粒細(xì)胞中端粒長(zhǎng)度可以在某種程度上反映卵母細(xì)胞和胚胎中的受精及發(fā)育潛能。BUTTS等［22］研究發(fā)現(xiàn)，卵巢儲(chǔ)備不好的女性其端粒長(zhǎng)度要明顯小于較儲(chǔ)備正常的女性。在卵巢功能減弱的患者也得到相似規(guī)律。因此，端粒與生殖能力存在密切的相關(guān)性。KEEFE等［23］通過追蹤IVF妊娠結(jié)局的研究發(fā)現(xiàn)，妊娠組較高齡者的端粒長(zhǎng)度要大于未妊娠組。國(guó)內(nèi)學(xué)者也有進(jìn)行相關(guān)的研究，對(duì)不同年齡段患者妊娠和未妊娠者顆粒細(xì)胞端粒進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，高齡組妊娠者顆粒細(xì)胞端粒較長(zhǎng)，但是在低齡組妊娠和未妊娠患者中無此差異［24］，與本研究結(jié)果相似。本研究首次在臨床應(yīng)用中使用顆粒細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與形態(tài)學(xué)評(píng)分法相結(jié)合，在一定程度上提高了預(yù)測(cè)早期胚胎發(fā)育的能力，改善了臨床妊娠率。

綜上所述，端粒在女性的生殖與卵巢功能中起重要作用，與生殖能力存在密切的相關(guān)性。顆粒細(xì)胞的凋亡程度直接影響卵泡發(fā)育和胚胎質(zhì)量，調(diào)控顆粒細(xì)胞端?？s短的信息通過某種作用機(jī)制影響卵母細(xì)胞，從而對(duì)胚胎質(zhì)量及最終臨床妊娠結(jié)局產(chǎn)生影響。如何加深對(duì)顆粒細(xì)胞與胚胎質(zhì)量之間分子機(jī)制的研究，延緩端粒縮短，改善卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量，還有待進(jìn)一步研究。

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