廣西HIV-1 B亞型假病毒的構(gòu)建

黃春湲 王洪 梁浩 葉力 梁冰玉 蔣俊俊 陳榮鳳 寧傳藝廖艷研 余軍 黃頡剛

人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）具有很強(qiáng)的復(fù)制能力，能引起獲得性免疫缺陷綜合征，對(duì)全球的公共衛(wèi)生來(lái)說(shuō)是一個(gè)巨大的威脅［1］。隨著抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療的廣泛應(yīng)用，HIV耐藥性毒株也隨之增多［2］，甚至有些新感染患者攜帶的HIV病毒已經(jīng)對(duì)目前獲批準(zhǔn)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物產(chǎn)生耐藥性［3-4］。假病毒（pseudovirus）是指一種反轉(zhuǎn)錄病毒能夠整合另外一種不同種類病毒的囊膜糖蛋白，從而形成具有外源性病毒的囊膜，而基因組保持著反轉(zhuǎn)錄病毒本身基因組特性的病毒［5-6］，在耐藥檢測(cè)方面的優(yōu)點(diǎn)逐漸突顯。隨著HIV假病毒相關(guān)研究的發(fā)展，有關(guān)我國(guó)HIV-1不同亞型的假病毒構(gòu)建逐漸增多［7］。但目前國(guó)內(nèi)針對(duì)HIV-1 B亞型構(gòu)建假病毒的研究甚少，而關(guān)于廣西HIV-1 B亞型假病毒的構(gòu)建尚未見(jiàn)有報(bào)道。廣西HIV-1 B亞型主要是泰國(guó)B亞型，與包括泰國(guó)、緬甸及云南德宏在內(nèi)的B亞型毒株序列十分接近［8］。王茂鵬等［9］用于制備的HIV-1 B 亞型假病毒的包膜來(lái)源于HIV-1 B亞型病毒急性感染人類的血漿，且文中并未說(shuō)明該假病毒在全國(guó)范圍的通用性。因此，本實(shí)驗(yàn)預(yù)期構(gòu)建針對(duì)廣西HIV-1 B亞型的假病毒系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞 pNL4-3.Luc.R-.E-由廣西藥用植物園研究所吳無(wú)畏教授惠贈(zèng)；pcDNA TM3.1（+）購(gòu)自Invitrogen公司；pSV-EGFP質(zhì)粒、293t細(xì)胞、TZM-bl細(xì)胞由本室自存；感受態(tài)細(xì)胞DH5α（TIANGEN）為用大腸桿菌DH5α菌株經(jīng)特殊工藝處理得到的。

1.1.2 主要試劑 High Pure Viral RNA Kit高純度病毒RNA提取試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司；Prime-ScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeSTAR?MaxDNA Polymerase PCR擴(kuò)增試劑盒、DNA純化試劑盒、T4 DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自廣州欣研生物科技有限公司；GenJet轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Signagen公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 巢式PCR擴(kuò)增和env基因片段的鑒定 用Roche High Pure Viral RNA Kit試劑盒從HIV-1 B亞型患者血漿樣本中提取病毒RNA。用Takara PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板。用巢式PCR的方法擴(kuò)增HIV-1env基因，引物序列：第一輪上游env1F：5′-TAGAGCCTTGGAAGCATCCAGGAAGTCAG-3′，下游env1R：5′-TAGCCCTTCCAGTCCCCCCTTTTCTTTTA-3′；第二輪上游env2F：5′-CCCAAGCTTGCCACCATGAGAGTGATGGAGATCAGG-3′，下游env2R：5′-CGGGATCCTTATAGCAAAGCCCTTTCCAAGC-3′。為了進(jìn)一步驗(yàn)證病毒株為B亞型，參照文獻(xiàn)［10］，對(duì)HIV-1 pol區(qū)基因全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序，對(duì)所獲得的pol序列采用MEGA 5.03軟件構(gòu)建部分毒株Neighor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分型驗(yàn)證。env區(qū)兩輪擴(kuò)增體系為50 μL：25 μL PrimeSTAR?MaxDNA Polymerase（2×）、1.5 μL上游引物、1.5 μL下游引物、5 μL cDNA 模板/第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物，RNase Free ddH2O補(bǔ)足50 μL。兩輪擴(kuò)增條件為：98℃10 s；55 ℃ 5 s，72 ℃ 2 min 30 s，35 cycles；72 ℃ 10 min，4℃保溫。瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物。

1.2.2 pcDNA3.1-env重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用HindⅢ、BamHⅠ分別雙酶切env基因片段和載體pcDNATM3.1（+），對(duì)所得反應(yīng)液進(jìn)行DNA純化并測(cè)定濃度后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。將重組載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，鋪板、挑取單個(gè)生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行培養(yǎng)。收集菌液采用質(zhì)粒小量提取試劑盒進(jìn)行pcDNA3.1-env重組質(zhì)粒的小量提取并用Nano drop 2000測(cè)定所得質(zhì)粒濃度，經(jīng)雙酶切瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.2.3 pNL4-3.EGFP.E-R-重組骨架質(zhì)粒的構(gòu)建自行設(shè)計(jì)含有NotⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)的EGFP基因擴(kuò)增引物，引物序列上游EGFP-F：5′-GCGGCCGCAATCGATGTACCGCGGGCCCGG-3′，下游 EGFPR：5′-CTCGAGTCTAGAGTCGCGGCCGCTCTTGTACAG-3′。采用PrimeSTAR?MaxDNA Polymerase進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃ 10 s；55℃ 5 s，72℃1 min，35 cycles；72 ℃ 10 min，4 ℃保溫。用NotⅠ、XhoⅠ分別雙酶切EGFP基因片段和骨架質(zhì)粒pNL4-3.Luc.E-R-，然后進(jìn)行DNA純化、轉(zhuǎn)化及重組質(zhì)粒的擴(kuò)增，并采用質(zhì)粒小量提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，經(jīng)雙酶切瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 重組質(zhì)粒外源性基因的表達(dá)驗(yàn)證 （1）將獲得的pcDNA3.1-env質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞。以24孔板為例：轉(zhuǎn)染前1 d以（2.0～3.0）× 105/孔種板，轉(zhuǎn)染前1 h給細(xì)胞換液，把稀釋后的pcDNA3.1-env質(zhì)粒和稀釋后的GenJet轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行混合，室溫孵育15～30 min后加入24孔板中，混勻；5～8 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后棄上清，PBS清洗1次，加入RIPA裂解液反復(fù)吹打以收集細(xì)胞蛋白，離心取上層液；采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，蛋白定量后采用Western blot法檢測(cè)env基因表達(dá)，并使用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行掃描，獲取圖像。（2）將獲得的重組骨架質(zhì)粒pNL4-3.EGFP.E-R-轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞，轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)方法步驟同上，最后采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞EGFP表達(dá)情況。

1.2.5 假病毒的獲得 將重組骨架質(zhì)粒pNL4-3.EGFP.E-R-與重組包膜質(zhì)粒pcDNA3.1-env共同轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞中：轉(zhuǎn)染前1 d以（2.0～ 3.0）×105/孔種板；轉(zhuǎn)染前1 h給細(xì)胞換液，把稀釋后的質(zhì)粒DNA（骨架質(zhì)粒與包膜質(zhì)粒質(zhì)量比為1∶2）和稀釋后的GenJet轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行混合，室溫孵育15～30 min后移至24孔板中，混勻；5～8 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集上清，假病毒即存在上清液中；用0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾后-80℃保存或進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 假病毒感染TZM-b1細(xì)胞 感染前1天將TZM-b1細(xì)胞以（8.0～10.0）×104/孔種于24孔板；感染前換液，每孔加入DMEM完全培養(yǎng)基300 μL，200 μL 假病毒液，5 μL 的 polybrene（1 μg/μL），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)；48 h后通過(guò)熒光顯微鏡觀察EGFP表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 重組骨架質(zhì)粒pNL4-3.EGFP.E-R-的鑒定及EGFP基因表達(dá)驗(yàn)證 重組骨架質(zhì)粒pNL4-3.EGFP.E-R-經(jīng)雙酶切電泳驗(yàn)證的結(jié)果見(jiàn)圖1，所得片段大小符合預(yù)期，約為740 bp左右。將獲得的重組骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293t細(xì)胞中，48 h后通過(guò)熒光顯微鏡觀察重組質(zhì)粒EGFP表達(dá)情況見(jiàn)圖2，外源性EGFP基因成功克隆至重組骨架質(zhì)粒中并能正常表達(dá)。

圖1 重組骨架質(zhì)粒pNL4-3.EGFP.E-R-鑒定電泳圖Fig.1 The electrophoretogram of recombinant plasmid pNL4-3.EGFP.E-R-

圖2 pNL4-3.EGFP.E-R-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞熒光表達(dá)Fig.2 The fluorescent expression of 293t cells transfected with plasmid pNL4-3.EGFP.E-R-

2.2 重組pcDNA3.1-env質(zhì)粒的獲得及鑒定

2.2.1env全長(zhǎng)基因片段的獲得 部分樣本的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖3所示，在指示帶3 000 bp附近為擴(kuò)增陽(yáng)性樣本，即env基因片段。圖中顯示7份陽(yáng)性擴(kuò)增樣本，其中，17、20、23號(hào)樣本條帶單一且清晰，可直接用于克隆；8、16號(hào)條帶較弱，并出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，需進(jìn)行凝膠回收后方可進(jìn)行克隆；2、9號(hào)條帶很弱，需稀釋后重新擴(kuò)增以增加目的基因量。經(jīng)HIV-1 pol區(qū)序列Genotyping初步分型和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)驗(yàn)證，病毒為HIV-1 B亞型（圖4）。

圖3 HIV-1 env基因擴(kuò)增電泳圖Fig.3 The electrophoretogram of HIV-1 env gene

圖4 廣西壯族自治區(qū)不同亞型HIV-1感染者基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析圖Fig.4 Phylogenetic tree analysis of the gene sequences of HIV-1 infected individuals from different subtypes in Guangxi Zhuang Autonomous Region

2.2.2 重組pcDNA3.1-env質(zhì)粒的獲得及鑒定 獲得重組pcDNA3.1-env質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切、凝膠電泳鑒定陽(yáng)性克隆。結(jié)果如圖5所示，以8號(hào)樣本為例，圖中5.5 kb左右條帶為載體pcDNA3.1條帶，3 kb左右條帶為克隆到載體中的env全長(zhǎng)基因，共獲得4個(gè)陽(yáng)性克隆，8-5為假陽(yáng)性克隆。

圖5 pcDNA3.1-env重組質(zhì)粒鑒定電泳圖Fig.5 The electrophoretogram of recombinant plasmid pcDNA3.1-env

2.2.3env蛋白的鑒定 通過(guò)Western blot驗(yàn)證重組載體中env基因表達(dá)的正確性。如圖6所示，前4個(gè)泳道為陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)染組，均表達(dá)gp160蛋白，即env蛋白；5號(hào)泳道為骨架質(zhì)粒單轉(zhuǎn)染組（陰性對(duì)照），未見(jiàn)env蛋白表達(dá)。從HIV-1感染者血漿樣本中提取的病毒RNA，通過(guò)擴(kuò)增并經(jīng)電泳鑒定共獲得8份陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物。分別將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pcDNATM3.1（+）中，每個(gè)樣本挑取5～10個(gè)克隆進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，共獲得10個(gè)陽(yáng)性克隆。

圖6 Western blot檢測(cè)env基因重組質(zhì)粒表達(dá)包膜蛋白Fig.6 Western blot detection of env gene expression from recombinant plasmids

2.3 攜帶EGFP基因的重組HIV-1假病毒具有單輪感染性活力 將克隆陽(yáng)性的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-env與重組骨架質(zhì)粒pNL4-3.EGFP.E-R-共同轉(zhuǎn)染到293t細(xì)胞，重組骨架質(zhì)粒pNL4-3.EGFP.E-R-單轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞作為對(duì)照，經(jīng)48 h后收集細(xì)胞上清液。將收集的上清進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，即把上清與TZM-b1共培養(yǎng)48 h后用熒光顯微鏡檢測(cè)熒光表達(dá)情況。結(jié)果如圖7所示，共轉(zhuǎn)染組上清與TZM-bl細(xì)胞共培養(yǎng)后可以觀察到熒光，骨架質(zhì)粒單轉(zhuǎn)染組上清與TZM-bl細(xì)胞共培養(yǎng)后無(wú)熒光表達(dá)。同時(shí)，收集感染TZM-b1細(xì)胞48 h后上清并加入到新的TZM-b1細(xì)胞中進(jìn)行第二輪感染，共培養(yǎng)48 h后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中熒光表達(dá)，結(jié)果如圖8所示未見(jiàn)有熒光表達(dá)，表明獲得的重組假病毒只具有單輪感染性。

圖7 重組假病毒感染TZM-b1細(xì)胞48 h后熒光表達(dá)情況Fig.7 The fluorescent expression of TZM-b1 cells infected with recombinant pseudovirus at 48 h post-infection

圖8 TZM-b1細(xì)胞上清液第二輪感染TZM-b148h后熒光表達(dá)情況Fig.8 The fluorescent expression of TZM-b1 cells with second round infection by supernatant in TZM-b1 cell culture of first round infection at 48 h post-infection

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，廣西HIV-1患者耐藥發(fā)生率高于全國(guó)水平，不同亞型HIV-1流行株的耐藥發(fā)生率不同［11］，且鑒于耐藥性毒株對(duì)廣西艾滋病防控和治療的種種危害，提高對(duì)HIV-1耐藥性變化的關(guān)注尤為重要。目前，檢測(cè)HIV-1耐藥的方法主要是基因型耐藥性檢測(cè)及表型耐藥性檢測(cè)?；蛐湍退帣z測(cè)僅能作為間接證據(jù)來(lái)評(píng)估樣本的耐藥性，在出現(xiàn)復(fù)雜組合耐藥位點(diǎn)時(shí)，其對(duì)耐藥性的判定未能考慮到耐藥位點(diǎn)間相互作用的效應(yīng)［12］。表型耐藥檢測(cè)則能很好地克服基因型檢測(cè)的這些缺點(diǎn)，可以直接得出直觀的耐藥性數(shù)據(jù)，是目前檢測(cè)耐藥的金標(biāo)準(zhǔn)。但傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法耗時(shí)耗力，在分離病毒的過(guò)程中忽視了選擇效應(yīng)的作用。而基于重組病毒技術(shù)的假病毒法表型檢測(cè)大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，簡(jiǎn)化了操作步驟，可以避免活病毒檢測(cè)法培養(yǎng)病毒時(shí)發(fā)生的基因突變，并且這種技術(shù)還可以和基因型耐藥檢測(cè)結(jié)果結(jié)合起來(lái)分析［13］。

針對(duì)不同亞型的毒株構(gòu)建表型耐藥檢測(cè)假病毒有助于HIV-1患者的耐藥檢測(cè)。目前已有大量研究［7，9］針對(duì)我國(guó)HIV-1不同亞型毒株假病毒進(jìn)行構(gòu)建，而此前并沒(méi)有關(guān)于廣西HIV-1 B亞型假病毒構(gòu)建的報(bào)道。廣西地區(qū)目前流行的HIV-1毒株有CRF01_AE、CRF08_BC、CRF07_BC、B亞型，B亞型占據(jù)了一定的比例［11，14］，較四川、貴州等地［15-16］的比例不同；而B(niǎo)亞型是歐美流行的優(yōu)勢(shì)毒株，在20世紀(jì)80年代傳入我國(guó)云南靜脈吸毒人群，隨著時(shí)間的推移發(fā)生變異，并在我國(guó)廣泛流行開(kāi)來(lái)。從地理位置來(lái)看，廣西流行的B亞型毒株，與包括泰國(guó)、緬甸及云南德宏在內(nèi)的B亞型毒株間存在密切關(guān)系，流行時(shí)間短于云南而稍長(zhǎng)于內(nèi)地其他?。?］。鑒于廣西B亞型與我國(guó)其他地區(qū)B亞型有差異，本研究將HIV-1骨架載體pNL4-3.Luc.E-R-改造為攜帶EGFP基因的重組骨架質(zhì)粒，并與自行構(gòu)建的表達(dá)HIV-1 B亞型env基因的表達(dá)性pcDNA3.1-env重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞中成功獲得了具有單輪感染活性的假病毒。但是，這套系統(tǒng)對(duì)于表型耐藥檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，本研究成功構(gòu)建了一種以EGFP為報(bào)告基團(tuán)的廣西HIV-1 B亞型假病毒系統(tǒng)，具有單輪感染活性?？刹捎么讼到y(tǒng)進(jìn)行人群隊(duì)列耐藥性監(jiān)測(cè)，并同時(shí)結(jié)合基因型耐藥檢測(cè)的方法，綜合分析解釋廣西HIV-1 B亞型感染者耐藥性的演變，為制定更加科學(xué)合理的預(yù)防耐藥發(fā)生的干預(yù)措施提供理論依據(jù)，也為構(gòu)建多種HIV-1基因亞型假病毒提供了參考。

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