蒲參膠囊對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

曹美靜,閆 晨,郝麗娜

武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院 (天津 300162)

心肌缺血/再灌注損傷( Myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI)是指在心肌較長時(shí)間缺血后恢復(fù)血液灌注對(duì)心肌造成嚴(yán)重的組織損傷，功能下降和明顯的障礙，甚至對(duì)正常的機(jī)體造成難以治愈或者不可逆的一系列心血管疾病[1-4]，包括循環(huán)障礙，代謝異常，血壓下降，心肌水腫，心功能異常等，常見于冠心病，心肌梗死和冠脈介入治療的病人中[5]，由于機(jī)制復(fù)雜，且尚未闡明，目前對(duì)MI/RI并沒有十分有效的預(yù)防和治療手段，本研究采用蒲參膠囊，探討其對(duì)MI/RI的保護(hù)作用。

材料與方法

1 材 料

1.1 動(dòng)物: 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重200～240 g，SPF級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXX(京)2007-0001

1.2 藥物與試劑:超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；大鼠腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α) 檢測試劑盒(上海銳聰科技發(fā)展有限公司)；大鼠白細(xì)胞介素-6 ( Interleukin-6，IL-6) ELISA 檢測試劑盒(上海百蕊生物科技有限公司)

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組與給藥：將雄性SD 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，復(fù)方丹參滴丸陽性藥組( 600 mg/kg ) ，蒲參膠囊(10、20、40 mg/kg) 組，每組6只，每日大鼠2 ml灌胃，療程連續(xù)12 周。假手術(shù)組，模型組在12周期間給予等體積的生理鹽水，所有大鼠在12 周實(shí)驗(yàn)期間均標(biāo)準(zhǔn)飲食。

2.2 急性心肌缺血再灌注模型的制備：雄性SD大鼠稱重，用戊巴比妥鈉溶液采用腹腔注射進(jìn)行麻醉，麻醉后的大鼠在無菌條件下，仰臥位，固定于手術(shù)臺(tái)，脖頸正中切開后進(jìn)行氣管插管，然后連接呼吸機(jī)，記錄心電圖，待呼吸、心電圖穩(wěn)定后，于大鼠左側(cè)肋骨2～4肋骨間開胸，拉開胸腔，小心剝離組織和心包膜，露出心臟，在左冠脈支根部以下約2～3 mm 的位置進(jìn)針穿線，不結(jié)扎，等待穩(wěn)定10 min后，結(jié)扎30 min，以結(jié)扎處遠(yuǎn)端心肌顏色變?yōu)榛野?、ST段抬高1/2作為模型制備成功的標(biāo)志，再灌注45 min。結(jié)扎前，結(jié)扎30 min后，再灌注45 min后記錄心電圖，假手術(shù)組僅進(jìn)針穿線但不結(jié)扎左冠脈前降支。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠腹主動(dòng)脈取血，離心取上清液-20℃保存?zhèn)溆?；取大鼠心臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，置于液氮保存[6-10]。

2.3 大鼠血清中LDH 和CK活性的測定： 取大鼠血清，按照試劑盒測定方法測定各樣本中LDH和CK的活性。

2.4 大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)觀察： 取大鼠心臟，分離一部分，常規(guī)HE染色，與光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠心肌病理組織學(xué)的改變。

2.5 大鼠心肌SOD，MDA、IL- 6和TNF- α的活性測定:去大鼠血清，按照試劑盒測定方法測定各樣本中SOD，MDA、IL- 6和TNF- α的活性。

結(jié) 果

1 蒲參膠囊對(duì)MI/RI大鼠血清LDH 和CK活性的影響 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中LDH和CK含量顯著提高(P<0. 05)，丹參滴丸組血清中LDH和CK含量顯著提高(P<0. 05)，蒲參膠囊低、中劑量組血清中LDH和CK含量顯著提高(P<0. 05)，蒲參膠囊高劑量組血清中LDH和CK含量沒有顯著變化；與模型組比較，丹參滴丸組血清中LDH和CK含量顯著降低(P<0. 05)，蒲參膠囊低中高劑量組血清中LDH和CK含量隨著蒲參膠囊的劑量升高而顯著降低(P<0. 05)。

表1 蒲參膠囊對(duì)MI/RI大鼠血清LDH 和CK活性的影響

注：與假手術(shù)組相比，*P<0. 05；與模型組相比，#P<0. 05

2 蒲參膠囊對(duì)MI/RI大鼠心肌細(xì)胞SOD，MDA、IL- 6和TNF- α活性的影響 見表2。與假手術(shù)組相比，模型組MDA活性顯著提高，SOD活性顯著下降(P<0.05)，丹參滴丸組MDA活性顯著下降，SOD活性顯著提高(P<0.05)，蒲參膠囊中、高劑量組MDA活性顯著下降，SOD活性顯著提高(P<0.05)，低劑量組MDA活性顯著提高，SOD活性顯著下降(P<0.05)；與模型組相比，丹參滴丸組MDA活性顯著下降，SOD活性顯著提高(P<0.05)；與模型組相比，蒲參膠囊中、高劑量組MDA活性顯著下降，SOD活性顯著提高(P<0.05)，低劑量組MDA和SOD活性提高不顯著。

與假手術(shù)組相比，模型組IL-6和TNF-α活性顯著提高(P<0.05)，丹參滴丸組IL-6和TNF-α活性顯著提高(P<0.05)，蒲參膠囊中、低劑量組IL-6和TNF-α活性顯著提高(P<0.05)，高劑量組TNF-α活性顯著提高(P<0.05)，IL-6活性沒有顯著變化；與模型組相比，丹參滴丸組IL-6和TNF-α活性顯著下降(P<0.05)；蒲參膠囊低、中、高劑量組IL-6和TNF-α活性顯著下降(P<0.05)。

3 蒲參膠囊對(duì)MI/RI大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)的影響 在光鏡下檢查證實(shí)，假手術(shù)組大鼠心肌結(jié)構(gòu)清晰、形態(tài)正常，無異常病理表現(xiàn)；模型組心肌病理形態(tài)學(xué)產(chǎn)生一定的變化，主要表現(xiàn)為心肌結(jié)構(gòu)變性、萎縮和壞死，心肌纖維束間距明顯拉大、結(jié)構(gòu)稀疏；丹參滴丸組間質(zhì)輕度增生，單核細(xì)胞浸潤；蒲參膠囊低劑量組仍然表現(xiàn)為心肌結(jié)構(gòu)空泡變性，局部萎縮，中、高劑量組心組織結(jié)構(gòu)相對(duì)正常，心肌細(xì)胞未見異常，僅單核細(xì)胞浸潤(圖1)。

表2 蒲參膠囊對(duì)MI/RI大鼠心肌細(xì)胞SOD，MDA、IL-6和TNF-α活性變化

注：與假手術(shù)組相比，*P<0. 05；與模型組相比，#P<0. 05

A:假手術(shù)組，B:模型對(duì)照組，C: 丹參滴丸組，D: 蒲參膠囊10 mg/kg組，E:蒲參膠囊20 mg/kg組，F(xiàn):蒲參膠囊40 mg/kg組

討 論

蒲參膠囊由何首烏、蒲黃、丹參、川穹、赤芍、山楂、澤瀉組成，對(duì)高血脂、冠心病有治療作用，其藥理學(xué)作用主要體現(xiàn)在活血化瘀、胸悶憋氣、心悸怔忪方面[11-13]，符合MI/RI的證候。近年來，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)糖尿病，腎病和血脂異常等疾病具有突出的治療效果，但其對(duì)MI/RI的研究尚未發(fā)現(xiàn)，因此本研究對(duì)此進(jìn)行探討。

LDH和CK是顯示心肌功能的重要指標(biāo)[14-16]，臨床用來作為心肌疾病的診斷，當(dāng)心肌受到損傷時(shí)，心肌炎性細(xì)胞浸潤、細(xì)胞充血、心肌纖維斷裂等損傷，血液中LDH和CK含量會(huì)顯著提高，本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清中LDH和CK含量顯著提高，表明心肌缺血再灌注對(duì)正常大鼠的心肌功能造成了嚴(yán)重的損害，經(jīng)蒲參膠囊提前預(yù)防治療后，低中高劑量組大鼠血清中LDH和CK含量明顯下降，其中高劑量組血清中LDH和CK含量沒有明顯變化，該結(jié)果表明心肌缺血再灌注對(duì)心肌造成了嚴(yán)重?fù)p傷，經(jīng)蒲參膠囊提前干預(yù)可以恢復(fù)心肌功能，對(duì)心肌損傷有一定的保護(hù)作用。

自由基氧化損傷在MI/RI中扮演重要的角色，內(nèi)源性的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)在維持心肌正常的功能中有重要作用[17-19]，研究證實(shí)，MI/RI后心肌細(xì)胞SOD活性顯著下降，MDA含量顯著提高，表明心肌缺血再灌注損傷對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激能力和平衡造成了破壞，經(jīng)蒲參膠囊干預(yù)后，低中高劑量組大鼠心肌細(xì)胞SOD活性顯著提高，MDA含量顯著下降，表明蒲參膠囊具有恢復(fù)人體抗氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)的能力，恢復(fù)心肌細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激的能力，減輕脂質(zhì)過氧化損傷，細(xì)胞過氧化損傷會(huì)造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，通過蒲參膠囊干預(yù)，可以增強(qiáng)機(jī)體維持心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整的能力。

炎癥反應(yīng)會(huì)趨化大量的炎性因子[20-22]，對(duì)心肌細(xì)胞的完整性造成破壞，破壞內(nèi)皮細(xì)胞，本研究顯示心肌缺血再灌注后，心肌細(xì)胞炎性IL-6和TNF-α活性顯著提高，經(jīng)蒲參膠囊干預(yù)后，低中高劑量組大鼠心肌細(xì)胞炎性IL-6和TNF-α活性顯著下降，表明蒲參膠囊具有降低MI/RI中炎性反應(yīng)的作用，維持內(nèi)皮細(xì)胞完整性，改善微循環(huán)，保持心肌的正常功能。

最后通過心肌組織病理學(xué)研究也顯示提前給予較長時(shí)間的蒲參膠囊后，會(huì)顯著改善心肌缺血再灌注損傷中心肌纖維結(jié)構(gòu)改變以及炎性浸潤，心肌病理形態(tài)顯著改善，從而說明蒲參膠囊對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用和對(duì)心肌功能的保護(hù)。

通過本研究證實(shí)，蒲參膠囊對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能是提高心肌細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力，降低心肌脂質(zhì)過氧化，降低心肌細(xì)胞炎性反應(yīng)，保護(hù)心肌細(xì)胞完整性，維持心肌細(xì)胞功能的完整運(yùn)行。

[1] 王彩歌. 心肌缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展[J]．世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，7(8):734-736.

[2] O’Donnell CJ，Nabel EG. Genomics of cardiovascular[J]．N Engl J Med，2011，365(22) : 2098-2109.

[3] 孟增慧，楊承志.小鼠心肌缺血再灌注損傷模型制備及心肌梗死面積評(píng)價(jià)方法學(xué)比較[J]．中國心血管雜志，2014，19( 2) : 123-125.

[4] Liao XL，Hu XX，Chang FJ，etal. A simple modificationresults in greater success in the models of coronary arteryligation and myocardial ischemia in mice[J]. J Cardiovasc Pharmacol,2013, 61(5):430.

[5] 王 嬌，張如意，羅金花，等．中老年糖尿病高危人群血脂異常現(xiàn)狀調(diào)查[J]．中國糖尿病雜志，2014，22(7) : 606-609.

[6] 汪夢霞，廖錦華，馬 達(dá)，等. 大鼠在體心肌缺血再灌注模型的建立[J]．臨床醫(yī)學(xué)工程，2013，20(5):533-535.

[7] 韓乃巍. 丹參對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國基層醫(yī)藥, 2013,12(24):3732-3734.

[8] Alberto D，Pedro A，Russel J. Cardio protection and pharmacological therapies in acute myocardial infarction：challenges in the current era [J]. World J Cardiol，2014,96(6):100-106.

[9] Chai Q，Liu J. Early stage effect of ischemic preconditioning for patients undergoing on-pump coronary artery bypass grafts surgery：systematic review and meta-analysis [J]. Pak J Med Sci，2014，30(3):642-648.

[10] 張瑞斌，王淑芳，朱 斌. 蒲參膠囊對(duì)糖尿病大鼠腎臟PAI-1及MMP-9的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2012,13(9):814-816.

[11] 陳 路，李瑋瑋，劉春慧. 心肌缺血再灌注損傷的中醫(yī)藥研究進(jìn)展及其模型的制備[J].中國生化藥物雜志,2015,35(9):174-176.

[12] 張銘暉，劉春麗. 蒲參膠囊對(duì)2 型糖尿病合并血脂異?；颊咛侵x及血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志2016,25(26)2905-2908.

[13] 沈曉璞，李 冀. 心肌缺血再灌注損傷的中醫(yī)研究進(jìn)展[J].陜西中醫(yī),2017,38(2):271-272.

[14] Zhou MX，F(xiàn)u JH，Zhang Q，etal. Effect of hydroxy safflower yellow A on myocardial apoptosis after acute myocardial infarction in rats[J]. Genet Mol Resh,2015,14(2): 3133-3141.

[15] Rohrbach S, Troidl C, Hamm C. Ischemia and reperfusion related myocardialinflammation:a network of cells and mediators targeting the cardiomyocyte[J].Iubmb Life， 2015,67(2):110-119.

[16] 李勝志，柴劍波，于 海，等.桂枝甘草湯及其各組分對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠血清中LDH、CK及心肌Ca2+含量的影響[J].陜西中醫(yī),2011,32(5):625-626.

[17] Karmakar S, Choudhury SR, Banik NL,etal. Induction of mitochondrial pathways and endoplasmic reticulum stress for increasing apoptosis in ectopic and orthotopic neuroblastoma xenografts[J]．J Cancer Ther,2011,2(2):77-90.

[18] 余 帆，徐彤彤，佐 妍，等. 不同劑量瘦素對(duì)2 型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響研究[J].中國全科醫(yī)學(xué),2014,17 (3) :299-303.

[19] 劉 慧,張 薇,盧少平. 槲皮素在大鼠心肌損傷中的抗氧化作用[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2017,46(8):995-996.

[20] 王 強(qiáng)，施洪飛 紅芪復(fù)方預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國新藥與臨床雜志，2016,35(9):659-664.

[21] 鄭亞萍，劉春杰. 白芍總苷對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2016,22(17):108-112.

[22] 樊維娜,孫經(jīng)武. 木犀草素預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的影響[J].陜西中醫(yī)，2015,36(11):1558-1560.