外周血結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)和胸水腺苷脫氨酶活性檢測(cè)在結(jié)核性胸腔積液診斷中的應(yīng)用評(píng)價(jià)*

韓利梅，李 新，穆清爽，努爾阿米娜·鐵力瓦爾迪，張 慧，古力鮮·馬合木提

新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸科 (烏魯木齊 830063)

結(jié)核病是全球性質(zhì)的重大傳染性疾病之一 。世界衛(wèi)生組織2004年的報(bào)告顯示，結(jié)核病的確診率僅約37%，即使在發(fā)達(dá)國(guó)家也僅有50%[1]。尤其是對(duì)于結(jié)核性胸膜炎(Tuberculous pleurisy,TBP)等肺外結(jié)核，診斷與鑒別診斷比較困難，極易造成誤診、漏診和延遲診斷，TBP診斷主要依靠檢驗(yàn)與檢查手段，然而胸部檢查敏感性較差。雖然經(jīng)皮胸膜活檢具有較高的敏感度，但其盲目性較大，加之取材有限，極易誘發(fā)氣胸等并發(fā)癥。外科胸腔鏡花費(fèi)大、無(wú)菌操作要求高，且視野有限，極易發(fā)生漏診[2，3]。因此迫切需要尋找一種快速、準(zhǔn)確、可靠的診斷方法。在胸腔積液的生化檢測(cè)中，ADA活性檢測(cè)被認(rèn)為是診斷結(jié)核性胸膜炎較為準(zhǔn)確的指標(biāo)[4]。目前，外周血T-SPOT.TB開始作為新的診斷結(jié)核感染方法廣泛應(yīng)用,該種檢測(cè)方法具有較高敏感度和特異度[5]。本研究旨在胸腔積液患者進(jìn)行以上兩種方法檢測(cè)，進(jìn)一步明確其對(duì)于結(jié)核性胸腔積液的診斷價(jià)值。

資料與方法

1 一般資料 選取2015年1月至2016年11月在我院住院的122例胸腔積液患者，將納入患者根據(jù)癥狀、結(jié)核分歧桿菌培養(yǎng)、痰涂片抗酸染色、病理學(xué)檢驗(yàn)以及臨床抗結(jié)核反應(yīng)，將所有納入患者分為結(jié)核組(n=52例)和非結(jié)核組(n=72例)，兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2 研究方法

2.1 胸腔積液ADA檢測(cè)：胸腔穿刺采集胸腔積液，中量和少量積液者在B超定位下進(jìn)行穿刺取積液，取5 ml胸腔積液于無(wú)菌試管中，離心10 min后取上清液進(jìn)行ADA水平測(cè)定。試劑盒由美國(guó)貝克曼公司生產(chǎn)，并采用同一公司的生化分析儀進(jìn)行結(jié)果分析， ADA>45 U/L作為診斷臨界值。

2.2 T-SPOT.TB檢測(cè)：采集患者外周血5 ml置于肝素抗凝管中，分離單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)過(guò)兩次洗滌與重懸后加入相應(yīng)的培養(yǎng)液制成細(xì)胞稀釋液，留待備用。試劑盒來(lái)自英國(guó)OXFD公司，試驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

根據(jù)A孔和B孔來(lái)判斷反應(yīng)結(jié)果：①陰性對(duì)照孔如果出現(xiàn)的斑點(diǎn)數(shù)為0～5，那么陽(yáng)性結(jié)果設(shè)定：要求A孔或B孔出現(xiàn)的斑點(diǎn)數(shù)減去陰性對(duì)照孔出現(xiàn)的斑點(diǎn)數(shù)的數(shù)值應(yīng)≥6；②如果陰性對(duì)照孔發(fā)現(xiàn)的斑點(diǎn)數(shù)≥6，那么陽(yáng)性結(jié)果設(shè)定：要求出現(xiàn)在A孔或B孔的斑點(diǎn)數(shù)要超過(guò)或等于陰性對(duì)照孔出現(xiàn)斑點(diǎn)數(shù)的2倍。

2.3 其他檢測(cè)：所有納入患者行痰分歧桿菌培養(yǎng)、痰涂片抗酸染色、組織病理學(xué)檢查。

結(jié) 果

1 外周血T-SPOT.TB與ADA檢測(cè)結(jié)果比較 結(jié)核組的外周血T-SPOT.TB與ADA陽(yáng)性率均明顯高于非結(jié)核組(P<0.01)，結(jié)核組外周血斑點(diǎn)平均數(shù)與ADA活性也高于非結(jié)核組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1，表2。

2 ROC曲線分析 ROC曲線可以用來(lái)分析各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)對(duì)于結(jié)核性胸腔積液的診斷效果，由圖1及表3分析得出，A、B孔斑點(diǎn)平均數(shù)ROC曲線下的面積(AUC)>0.9，ADA的AUC為0.846，可見A、B孔斑點(diǎn)平均數(shù)的診斷價(jià)值較高。A、B孔斑點(diǎn)平均數(shù)的敏感性為98.00%，特異性73.60%，ADA的敏感性91.80%，特異性82.60%。

表1 兩組患者T-SPOT.TB與ADA陽(yáng)性率比較[例(%)]

表2 兩組患者外周血斑點(diǎn)平均數(shù)與ADA活性比較

圖1 外周血A、B孔斑點(diǎn)平均數(shù)及ADA的ROC曲線

檢測(cè)指標(biāo)AUC95%C.I.P截點(diǎn)敏感性(%)特異性(%)A孔斑點(diǎn)平均數(shù)0.9210.859^0.971<0.01098.0073.60B孔斑點(diǎn)平均數(shù)0.9190.862^0.967<0.01098.0073.60ADA(U/L)0.8460.781^0.918<0.012891.8082.60

3 外周血T-SPOT.TB與ADA互補(bǔ)關(guān)系 結(jié)核組中4例患者外周血T-SPOT.TB陰性，但有3例ADA檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。非結(jié)核組中有12例外周血T-SPOT.TB為陽(yáng)性，但有10例ADA檢測(cè)為陰性。

討 論

TBP屬于最常見的肺外結(jié)核病，主要與結(jié)核分枝桿菌及其他代謝產(chǎn)物浸及高敏狀態(tài)的胸膜腔所致[4]。TBP主要表現(xiàn)為胸腔積液所致的局部癥狀(胸痛、呼吸困難、干咳等)與全身中毒癥狀(出汗、畏寒、發(fā)熱、盜汗、食欲不振等)，積液少時(shí)僅有氣促、胸悶等癥狀，大量積液形成后可壓迫肺、縱隔與心，加重呼吸困難，且隨著積液形成與聚集的增加，呼吸困難癥狀越為明顯，甚至可導(dǎo)致端坐呼吸與發(fā)紺[5]。目前，臨床主要采用胸膜活組織檢查、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)、胸腔積液細(xì)菌學(xué)檢查(結(jié)核分枝肝菌培養(yǎng)與抗酸染色涂片)與胸腔積液生物化學(xué)檢查等。其中胸膜活組織檢查具有較多方式，但其各有缺陷；結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)所使用的結(jié)核菌素純蛋白衍生物為200多類蛋白的混合物，含有卡介苗與非結(jié)核分枝桿菌的共同抗原成分，所以接種卡介苗的群體經(jīng)該技術(shù)檢查后可呈現(xiàn)較高的假陽(yáng)性率[6]；胸腔積液細(xì)菌學(xué)檢查則是診斷結(jié)核性胸膜炎的金標(biāo)準(zhǔn)，然而耗時(shí)長(zhǎng)，陽(yáng)性率過(guò)低[7]。胸腔積液生物學(xué)技術(shù)是診斷結(jié)核性胸膜炎主要方法，尤其是胸水ADA活性檢查現(xiàn)已成為許多國(guó)家診斷結(jié)核性胸膜炎的常規(guī)技術(shù)。有研究對(duì)ADA在結(jié)核性胸膜炎中的應(yīng)用效果進(jìn)行了薈萃分析，認(rèn)為對(duì)胸腔積液進(jìn)行ADA檢驗(yàn)具有顯著的應(yīng)用價(jià)值[8]。也有學(xué)者認(rèn)為，ADA特異性與敏感度偏低，其中特異度偏低多見于類風(fēng)濕性疾病與肺炎旁積液患者，而敏感性降低可能與機(jī)體免疫功能減退及早期炎癥有關(guān)[9]。

近年來(lái)，隨著臨床檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，在特異T細(xì)胞檢測(cè)中，ELISPOT已成為最敏感的方法之一，該技術(shù)能夠?qū)⒖乖禺惣?xì)胞從數(shù)量眾多的外周血單個(gè)核細(xì)胞中檢測(cè)出來(lái)。Lalvani根據(jù)ELISPOT檢測(cè)的相關(guān)原理，利用ESAT-6和CFP-10，從外周血結(jié)核中檢測(cè)出了特異性的T細(xì)胞[10]，因此T-SPOT.TB開始作為診斷結(jié)核感染的新方法而應(yīng)用到臨床。部分研究發(fā)現(xiàn)，T-SPOT.TB具有較佳的特異性與敏感性，且不受卡介菌的影響。有學(xué)者研究認(rèn)為，T-SPOT.TB對(duì)于結(jié)核病具有顯著的診斷價(jià)值，尤其是對(duì)于結(jié)核性胸膜炎，陽(yáng)性率可高達(dá)91.67%[11]。此外，T-SPOT.TB的高敏感性已被多項(xiàng)臨床試驗(yàn)證實(shí)。王永生等[12]對(duì)結(jié)核性胸膜炎的患者進(jìn)行了外周血T-SPOT.TB檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其敏感性達(dá)到了95.8%。學(xué)者郭曉酮等[13]對(duì)比了胸腔積液ADA與外周血T-SPOT.TB對(duì)TBP的 診斷效果，結(jié)果顯示胸腔積液ADA與外周血T-SPOT.TB診斷TBP均具有較佳的特異度(94.4%VS86.1%)，但T-SPOT.TB較ADA的敏感度更高(88.9%VS46%)，且兩者聯(lián)合檢測(cè)的敏感度高達(dá)92.1%，認(rèn)為臨床工作中將T-SPOT.TB與ADA聯(lián)合應(yīng)用可以有效提高TBP的診斷率。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核組的外周血T-SPOT.TB與ADA陽(yáng)性率均明顯高于非結(jié)核組，結(jié)核組外周血斑點(diǎn)平均數(shù)與ADA活性也顯著高于非結(jié)核組。A、B孔斑點(diǎn)平均數(shù)ROC曲線下的面積(AUC)>0.9，敏感性達(dá)到了98.00%，與既往多項(xiàng)研究基本一致[14]。T-spot.TB是檢測(cè)早期分泌抗原(ESAT-6)和培養(yǎng)過(guò)濾蛋白(CFP-10)這2個(gè)抗原刺激時(shí)淋巴細(xì)胞分泌的INF-γ，計(jì)數(shù)熒光標(biāo)記釋放TNF-γ的T淋巴細(xì)胞的個(gè)數(shù)來(lái)了解機(jī)體是否處于結(jié)核感染狀態(tài)。與劉菲等[15]發(fā)現(xiàn)ESAT-6與CFP-10的融合蛋白敏感性要比ESAT-6單用時(shí)明顯增高，本研究中單用ESAT-6或單用CFP-10均具有較高敏感性(98.00%)，考慮與樣本量大小、研究對(duì)象差異及有可能的誤差相關(guān)，需要進(jìn)一步的大樣本詳盡數(shù)據(jù)支持。同時(shí)，相較于結(jié)核菌素試驗(yàn)，T-SPOT.TB不受卡介苗的影響，且多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌具有較低的交叉免疫反應(yīng)，檢測(cè)周期短，操作簡(jiǎn)便，還適用于支氣管肺泡灌洗液、腹腔積液、痰液、腦脊液等標(biāo)本，應(yīng)用范圍較廣。

研究中顯示，A、B孔斑點(diǎn)平均數(shù)的特異性為73.60%，ADA的特異性82.60%，兩者的診斷特異性均不是特別理想，筆者對(duì)兩者的互補(bǔ)關(guān)系也進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示結(jié)核組中4例患者的外周血T-SPOT.TB陰性，但有3例的ADA檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。非結(jié)核組中有12例外周血T-SPOT.TB為陽(yáng)性，但有10例ADA檢測(cè)為陰性。可以看出，兩者的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)診斷結(jié)核有更高的價(jià)值。非結(jié)核組中T-SPOT.TB假陽(yáng)性率較高，筆者考慮可能與陳舊性結(jié)核及潛伏期結(jié)核相關(guān)，當(dāng)然另一可能原因與目前的檢測(cè)手段無(wú)法對(duì)肺外微小結(jié)核灶進(jìn)行有效的發(fā)現(xiàn)有關(guān)[8]。

綜上所述，外周血結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)是一種快速 、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)手段，對(duì)于診斷結(jié)核性胸腔積液價(jià)值較高，但特異性偏低，與ADA聯(lián)用時(shí)診斷會(huì)更為準(zhǔn)確。

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