刀孢蠟蚧菌ZJLP09液體發(fā)酵工藝的研究

鹿連明，杜丹超，胡秀榮，蒲占湑，張利平，黃振東，陳國慶(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 柑橘研究所，浙江 臺州 318020)

柑橘木虱、蚜蟲等是柑橘上的重要害蟲，目前對于這些害蟲的防治仍以吡蟲啉、噻嗪酮、毒死蜱等化學(xué)農(nóng)藥為主，然而化學(xué)農(nóng)藥的頻繁使用帶來的3R(抗性、再增猖獗和殘留)問題日趨嚴重。而生物農(nóng)藥因具有無殘留、特異性強、不殺傷害蟲天敵及有益生物、不易產(chǎn)生抗藥性、環(huán)境相容性好、生產(chǎn)工藝簡單等特點越來越引起人們的重視。

在利用生防菌防治柑橘木虱、蚜蟲等害蟲的研究方面，國內(nèi)外學(xué)者相繼開展了一些有益的探索。其中已報道的對柑橘木虱具致病力的真菌有玫煙色擬青霉、白僵菌、檬型被毛孢、宛式擬青霉等[1-5]。已報道的對橘蚜等柑橘蚜蟲有致病力的真菌有磚紅鐮孢菌、弗雷生蟲霉菌、蚜蟲霉菌等[5-9]。但目前研究多集中在實驗室探索階段，市場上尚無商品化的微生物農(nóng)藥產(chǎn)品可供使用。

刀孢蠟蚧菌ZJLP09為本實驗室從浙江臺州地區(qū)橘園內(nèi)的柑橘木虱蟲體上分離篩選出的1株蟲生真菌[10]，經(jīng)致病性測定，確定該菌株對柑橘木虱和蚜蟲具有強致病力，且其對高溫、低溫、低濕和紫外線等具有更高的抗逆性[11]。為此，本研究通過培養(yǎng)基、溫度、pH等條件的優(yōu)化，建立了一套穩(wěn)定的適于刀孢蠟蚧菌ZJLP09的液體發(fā)酵工藝，以期為進一步開發(fā)該菌株的生防菌制劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株刀孢蠟蚧菌ZJLP09為本實驗室從浙江臺州地區(qū)橘園內(nèi)的柑橘木虱蟲體上分離，接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基(PDA，配方為：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH值)上，于4 ℃冰箱保存。

1.2 發(fā)酵培養(yǎng)

制備PDA培養(yǎng)基平板，在超凈工作臺中以無菌接種針挑取斜面上保存的刀孢蠟蚧菌ZJLP09菌塊，接種至PDA平板上，之后置于微生物培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。以無菌打孔器在菌落四周打取菌餅，接種至馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)中，在28 ℃恒溫搖床下以轉(zhuǎn)速180 r·min-1震蕩培養(yǎng)3 d。

1.3 培養(yǎng)基的篩選

取上述培養(yǎng)的刀孢蠟蚧菌ZJLP09的分生孢子懸浮液，按1%的比例接種到各供試培養(yǎng)基中(表1)，置于28 ℃恒溫搖床下以轉(zhuǎn)速180 r·min-1震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)不同時間后取樣，用血球計數(shù)板統(tǒng)計孢子數(shù)量， 計算各培養(yǎng)基中菌株ZJLP09的產(chǎn)孢量。

1.4 初始接種量的篩選

取刀孢蠟蚧菌ZJLP09分生孢子懸浮液，按l%、3%、5%、10%和20%的比例(V/V)分別接入裝有培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中(接種后共100 mL)，每處理設(shè)3個重復(fù)。置于28 ℃恒溫搖床中以轉(zhuǎn)速180 r·min-1的條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)不同時間后取樣，用血球計數(shù)板法計算孢子濃度，重復(fù)測定3次，取平均值換算成產(chǎn)孢量。

表1 液體搖床培養(yǎng)基及配方

1.5 裝液量的篩選

在250 mL三角瓶中分別裝入20%、40%、60%、80%的培養(yǎng)液，121 ℃滅菌20 min后，在無菌條件下接入分生孢子懸浮液，接菌量為5%，每處理設(shè)3個重復(fù)。置于28 ℃恒溫搖床中以轉(zhuǎn)速180 r·min-1的條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)不同時間后取樣，用血球計數(shù)板法計算孢子濃度，重復(fù)測定3次，取平均值換算成產(chǎn)孢量。

1.6 初始pH值的篩選

在250 mL三角瓶中分別裝入40%的培養(yǎng)液，將pH分別調(diào)至4.0、6.0、8.0、10.0，21 ℃滅菌20 min后，在無菌條件下接入分生孢子懸浮液，接菌量為5%，每處理設(shè)3個重復(fù)。置于28 ℃恒溫搖床中以轉(zhuǎn)速180 r·min-1的條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)不同時間后取樣，用血球計數(shù)板法計算孢子濃度，重復(fù)測定3次，取平均值換算成產(chǎn)孢量。

1.7 震蕩轉(zhuǎn)速的篩選

在250 mL三角瓶中分別裝入40%的培養(yǎng)液，將pH調(diào)至6.0，接菌量為5%，每處理設(shè)3個重復(fù)。置于恒溫搖床中，28 ℃下分別以100、150、180、200、220 r·min-1連續(xù)振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)不同時間后取樣，用血球計數(shù)板法計算孢子濃度，重復(fù)測定3次，取平均值換算成產(chǎn)孢量。

1.8 培養(yǎng)時間的篩選

在250 mL三角瓶中分別裝入40%的培養(yǎng)液，將pH調(diào)至6.0，接菌量為5%，每處理設(shè)3個重復(fù)。置于恒溫搖床中，28 ℃下以180 r·min-1連續(xù)振蕩培養(yǎng)6 d。每隔24 h從各三角瓶中取培養(yǎng)液，用血球計數(shù)板法計算孢子濃度，重復(fù)測定3次，取平均值換算成產(chǎn)孢量。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的確定

由表2可知，菌株ZJLP09在不同液體培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量存在明顯差異。培養(yǎng)3 d后，在沙氏葡萄糖酵母培養(yǎng)基(編號D)中的產(chǎn)孢量最高，含孢量為4.20×108個·mL-1；其次為麥麩培養(yǎng)液(編號J)和馬鈴薯葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基(編號B)，含孢量分別為3.25×108個和3.15×108個·mL-1；而察氏培養(yǎng)基(編號E)和玉米粉培養(yǎng)液(編號K)產(chǎn)孢量最低，分別僅為3.50×105個和4.00×105個·mL-1。隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株ZJLP09在多數(shù)培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量均明顯上升，其在沙氏葡萄糖酵母培養(yǎng)基(編號D)中的產(chǎn)孢量更增加為1.27×109個·mL-1，為所有供試培養(yǎng)基中最高；但其在小米浸液培養(yǎng)基(編號L)和大豆粉玉米粉培養(yǎng)基(編號O)中的產(chǎn)孢量表現(xiàn)為下降，在玉米粉麥麩培養(yǎng)液(編號I)中更難以看到孢子的存在，多生長為菌絲。據(jù)此，篩選出適于刀孢蠟蚧菌ZJLP09產(chǎn)孢的最佳液體培養(yǎng)基為沙氏葡萄糖酵母培養(yǎng)基。

表2 菌株ZJLP09在不同液體培養(yǎng)基培養(yǎng)不同時間后的產(chǎn)孢量

注：同列數(shù)字后不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。表3～7同。

2.2 初始接種量的確定

在不同接種量條件下，菌株ZJLP09在SDY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量如表3所示。

表3 在不同接種量條件下菌株ZJLP09在SDY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量

由表3可知，接種量越大，菌株ZJLP09達到產(chǎn)孢高峰的時間越短。其中培養(yǎng)3 d，20%的接種量條件下菌株產(chǎn)孢量可達5.22×109個·mL-1，而1%接種量條件下菌株產(chǎn)孢量僅為4.35×108個·mL-1。隨著培養(yǎng)時間的延長，1%～5%接種量條件下菌株的產(chǎn)孢量明顯增加，其中5%接種量條件下在培養(yǎng)7 d后的產(chǎn)孢量可達5.35×109個·mL-1，而此時10%和20%接種量條件下的產(chǎn)孢量已表現(xiàn)下降趨勢。究其原因，同一液體培養(yǎng)基下，在通氣量等條件一致的情況下，接種量越大，孢子濃度越容易先達到最大。在工業(yè)化生產(chǎn)中，為了節(jié)約動力消耗，可以增加接種量；為了節(jié)約接種量，需增加動力消耗。綜合考慮兩個因素，可選用5%的接種量用于刀孢蠟蚧菌ZJLP09的發(fā)酵。

2.3 裝液量的確定

在不同裝液量條件下菌株ZJLP09在SDY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量如表4所示。

表4 不同裝液量條件下菌株ZJLP09在SDY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量

由表4可知，培養(yǎng)相同時間，裝液量越少，菌株ZJLP09產(chǎn)孢量越多。在培養(yǎng)3 d和20%裝液量條件下，菌株ZJLP09的產(chǎn)孢量可達3.20×109個·mL-1，而80%裝液量條件下，菌株的產(chǎn)孢量僅為8.25×108個·mL-1。說明菌株ZJLP09為好氧型菌株，增加通氣量(即減少裝液量)有利于增加菌株產(chǎn)孢。綜合考慮材料利用率和產(chǎn)孢總量，可選用40%的裝液量用于刀孢蠟蚧菌ZJLP09的發(fā)酵。

2.4 初始pH值的確定

在不同pH條件下菌株ZJLP09在SDY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量如表5所示。

表5 不同pH條件下菌株ZJLP09在SDY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量

由表5可知，菌株ZJLP09在不同pH的相同培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量差異明顯，過酸和過堿都不利于菌株產(chǎn)孢。在pH值5.0～7.0條件下，菌株ZJLP09的產(chǎn)孢量明顯高于其他pH條件下，在pH值6.0條件下培養(yǎng)3 d，菌株ZJLP09的產(chǎn)孢量為1.70×109個·mL-1，培養(yǎng)7 d，其產(chǎn)孢量可達5.35×109個·mL-1，而在pH值3.0和pH值10.0條件下培養(yǎng)3 d的產(chǎn)孢量僅為1.20×108個和8.85×107個·mL-1。因此，可選用培養(yǎng)基初始pH值6.0用于刀孢蠟蚧菌ZJLP09的發(fā)酵。

2.5 震蕩轉(zhuǎn)速的確定

在不同轉(zhuǎn)速條件下菌株ZJLP09在SDY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量如表6所示。

表6 不同轉(zhuǎn)速條件下菌株ZJLP09在SDY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量

由表6可知，轉(zhuǎn)速越快，菌株ZJLP09達到產(chǎn)孢高峰所需時間越短。在培養(yǎng)3 d及220 r·min-1轉(zhuǎn)速條件下，菌株產(chǎn)孢量為2.35×109個·mL-1；而在100 r·min-1轉(zhuǎn)速條件下，菌株產(chǎn)孢量僅為7.20×108個·mL-1，在180和200 r·min-1條件下，產(chǎn)孢量無顯著差異。綜合考慮產(chǎn)孢量和能量消耗等因素，可選用搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1用于刀孢蠟蚧菌ZJLP09的發(fā)酵。

2.6 培養(yǎng)時間的確定

不同培養(yǎng)時間后菌株ZJLP09在SDY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量如表7所示。

表7 不同培養(yǎng)時間菌株ZJLP09在SDY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量

由表7可知，菌株ZJLP09隨震蕩培養(yǎng)時間的延長，呈現(xiàn)先增加再飽和后衰減的趨勢。其中培養(yǎng)前5 d菌株的產(chǎn)孢量一直呈遞增趨勢，至培養(yǎng)第5天產(chǎn)孢量可達5.35×109個·mL-1，與培養(yǎng)第6、7和8天后的產(chǎn)孢量無顯著差異，8 d之后菌株產(chǎn)孢量開始下降。因此，可選用培養(yǎng)時間為5 d用于刀孢蠟蚧菌ZJLP09的發(fā)酵。

3 小結(jié)與討論

刀孢蠟蚧菌ZJLP09為從浙江臺州地區(qū)橘園內(nèi)的柑橘木虱蟲體上分離獲得的1株蟲生真菌，該菌株對柑橘木虱和蚜蟲具有強致病力，且對高溫、低溫、低濕和紫外線等具有更高的抗逆性，表現(xiàn)出良好的開發(fā)利用前景。本研究通過對培養(yǎng)基、初始接種量、裝液量、pH值、震蕩轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)時間等方面的篩選優(yōu)化，確定了刀孢蠟蚧菌ZJLP09產(chǎn)孢所需的最佳條件，建立了一套刀孢蠟蚧菌ZJLP09的液體發(fā)酵工藝，具體為：初始接種量5%、搖瓶裝液量40%～60%，初始pH值5.0～7.0、震蕩轉(zhuǎn)速180～220 r·min-1、培養(yǎng)溫度28 ℃、培養(yǎng)時間5 d。

生防菌通常被開發(fā)為分生孢子可濕性粉劑等制劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用，而制劑研制的前提即為制備獲得大量高純度的分生孢子。本研究建立的液體發(fā)酵工藝，可獲得大量的分生孢子，這為今后刀孢蠟蚧菌ZJLP09分生孢子制劑的研制提供了良好的依據(jù)。

參考文獻：

[1] RIVERO-ARAGON A，GRILLO-RAVELO H. Natural enemies ofDiaphorinacitriKuwayama (Homoptera: Psyllidae) in the central region of Cuba[J]. Centro-Agricola，2000，27(3): 87-88.

[2] SUBANDIYAH S，NIKOH N，SATO H，et al. Isolation and characterization of two entomopathogenic fungi attackingDiaphorinacitri(Homoptera，Psylloidea) in Indonesia[J]. Mycoscience，2000，41: 509-513.

[3] MEYER J M，HOY M A，BOUCIAS D G. Morphological and molecular characterization of aHirsutellaspecies infecting the Asian citrus psyllid，DiaphorinacitriKuwayama (Hemiptera: Psyllidae) in Florida[J]. Journal of Invertebrate Pathology，2007，95: 101-109.

[4] MEYER J M，HOY M A，BOUCIAS D G. Isolation and characterization of anIsariafumosoroseaisolate infecting the Asian citrus psyllid in Florida[J]. Journal of Invertebrate Pathology，2008，99: 96-102.

[5] 謝佩華，蘇朝安，林自國. 柑桔木虱寄生菌：蠟蚧頭孢菌初步研究[J]. 生物防治通報，1988(2): 92.

[6] 陳祝安，曹光照，許益?zhèn)?，? 柑桔害蟲病原真菌資源的考察和生測[J]. 微生物學(xué)通報，1985(5): 194-198.

[7] 宋漳. 從橘蚜上分離的一種致病鐮刀菌[J]. 林業(yè)科學(xué)，2011，37(6): 66-70.

[8] Muma M H, Selhime A G, Denmark H A. Annotated list of predators and parasites associated with insects and mites on Florida citrus[J]. Bull Fla Agric Exp Stn,1961.

[9] 葉琪明，陳偉民，陳道茂. 蟲生真菌在柑桔主要害蟲上的研究及應(yīng)用現(xiàn)狀[J]. 浙江柑桔，1994(4)：15-18.

[10] LU L M，CHENG B P，DU D C，et al. Morphological，molecular and virulence characterization of threeLencanicilliumspecies infecting Asian citrus psyllids in Huangyan citrus groves[J]. Journal of Invertebrate Pathology，2015，125: 45-55.

[11] 鹿連明，杜丹超，胡秀榮，等. 三種侵染柑橘木虱的蠟蚧菌屬真菌的生物學(xué)特性[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，28(10): 1738-1744.