HPLC測定叢生竹中總黃酮及(異)牡荊苷、(異)葒草苷的含量

華梅,陳劍,畢瑋,孔繼君,呼延麗,李云琴,楊宇明,王娟

(1.云南省林業(yè)科學院,云南 昆明 650201;2.云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室/國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育實驗室,云南 昆明 650201;3.西南林業(yè)大學,云南 昆明 650224)

叢生竹稈形高大，單稈出材率最高，竹叢稈數(shù)多，單位面積產(chǎn)量遠高于散生竹林，是優(yōu)良特性最突出、最具推廣和開發(fā)利用潛力的竹種[1-3]。叢生竹類資源生長快、生物量大，在我國林業(yè)資源中所占的地位日益重要[4]。竹子目前主要用來發(fā)展竹建筑、竹造紙、竹食品及竹工藝品產(chǎn)業(yè)，絕大部分竹葉未能得到充分利用，造成竹葉資源的浪費[1]。竹葉具有較好的醫(yī)療保健作用，苦竹〔Pleioblastusamarus(Keng)keng〕葉具有明目利九竅、治不睡、止消渴、解酒毒等作用，淡竹(Phyllostachysnigravar.henon)葉具有鎮(zhèn)靜、解熱、止咳和止血的功效[5-6]。竹葉中具有豐富的次生代謝產(chǎn)物，近年研究表明，竹葉提取物具有優(yōu)良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、抗菌、殺蟲、調(diào)節(jié)血脂等生物活性[7-10]。目前對竹葉化學成分的研究主要集中在散生竹[11-13]，對叢生竹研究的相對較少，李水芳等[14]以蘆丁為標準品對箬竹〔Indocalamustessellatus(Munro)Keng f.〕葉中的總黃酮含量進行了紫外分光光度計測定。因叢生竹資源化學成分的研究和開發(fā)利用的需要，對更多種類的叢生竹竹葉中化學成分的分析變得迫切。本研究以勃氏甜龍竹〔Dendrocalamusbrandisii(Munro)Kurz〕、箬竹、浦竹仔(IndosasahispidaMcClure)、椅子竹(DendrocalamusbambusoidesHsueh et D.Z.Li)4種叢生竹為研究對象，采用高效液相色譜法(HPLC)，建立叢生竹竹葉中總黃酮及牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷含量測定方法。同時考察了勃氏甜龍竹超聲提取的最佳方法，為叢生竹資源的開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以勃氏甜龍竹、箬竹、浦竹仔及椅子竹4種叢生竹的葉子作為分析樣品，樣品采自于云南省林業(yè)科學院樹木園(2017年3月20日)。將采集的竹葉樣品清洗，自然晾干，粉碎，過40目篩備用。

1.2 試劑與儀器

主要試劑 色譜甲醇、無水乙醇、甲醇、丙酮、石油醚(所用試劑均為分析純)、標準品為蘆丁、牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷，購自于上海安譜實驗科技公司。

主要儀器 高效液相色譜儀(安捷倫1260)、超聲儀、旋轉蒸發(fā)儀。

1.3 實驗方法

(1)竹葉黃酮超聲提取方法 精密稱取1.00g勃氏甜龍竹樣品，置于具塞三角瓶中，加入1︰10的溶劑，于40℃超聲提取1h。提取液用3倍石油醚萃取3次，去除上層石油醚相，收集，用旋轉蒸發(fā)儀旋蒸至干，稱量重量，計算樣品總黃酮得率。

(2)最適提取溶劑的確定 精密稱量1.00g勃氏甜龍竹樣品4份，分別加入1︰10的70%甲醇溶液、70%乙醇溶液、70%丙酮溶液及水，采用超聲提取法提取，分別計算不同提取溶劑的總黃酮得率，以篩選最佳的提取溶劑。

(3)最適料液比的確定 精密稱量1.00g勃氏甜龍竹樣品，分別加入料液比為1︰1,1︰5,1︰10,1︰20,1︰30的70%甲醇溶液，采用超聲提取法提取，分別計算不同提取溶劑的總黃酮得率，以篩選最佳的料液比。

(4)最適提取時間的確定 精密稱量1.00g勃氏甜龍竹樣品，分別加入1︰20的70%甲醇溶液，采用超聲提取法提取，提取時間分別為20min、40min、60min、80min、120min，分別計算不同提取溶劑的總黃酮得率，以篩選最佳的提取時間。

(5)最適提取溫度的確定 精密稱量1.00g勃氏甜龍竹樣品，分別加入1︰20的70%甲醇溶液，采用超聲提取法提取，提取時間60min，提取溫度分別為0℃、10℃、20℃、40℃、60℃，分別計算不同提取溶劑的總黃酮得率，以篩選最佳的提取溫度。

(6)叢生竹竹葉黃酮的提取 按照超聲提取的方法，對勃氏甜龍竹、箬竹、浦竹仔、椅子竹4種叢生竹中竹葉總黃酮進行提取，過濾后，濾液經(jīng)3倍石油醚進行萃取，除去石油醚相，剩余提取液經(jīng)0.45μm的濾膜過濾，用于HPLC分析。

(7)蘆丁及竹葉黃酮標準溶液的配制 準確稱取0.004 5g蘆丁標準品，用色譜純甲醇定容至10mL，配制成0.45mg/mL的蘆丁標準溶液。分別取0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL及1.0mL母液，分別定容至1.0mL，配制成濃度分別為0.045mg/mL、0.09mg/mL，0.18mg/mL、0.27mg/mL、0.36mg/mL、0.45mg/mL的標準溶液，經(jīng)HPLC分析后，相應結果用于標準曲線的繪制。準確稱取牡荊苷0.007 2g，異牡荊苷0.006 4g，葒草苷0.009 3g，異葒草苷0.005 8g，用色譜純甲醇定容至10mL，配制成標準溶液。分別取不同體積的母液混合，定容至1.0mL，配制成不同濃度的混合標準溶液，經(jīng)HPLC分析后，相應結果用于標準曲線的繪制。

(8)HPLC條件 高效液相色譜儀為安捷倫1260，色譜柱為Eclipse plus C18 column(4.6mm×150mm,5μm),流動相0.5%磷酸(A)和甲醇(B)為洗脫劑。洗脫條件為0-30min,90%A，10%B。檢測波長為330nm；流速為1.0mL/min；柱溫為35℃；進樣量為10μL。紫外吸收掃描波長范圍為200-400nm。

(9)叢生竹竹葉黃酮含量的測定 將配好的不同濃度的蘆丁標準溶液按照HPLC的方法進行上樣分析，所得結果用于繪制蘆丁標準品的標準曲線。將提取處理好的4種叢生竹提取液按照HPLC的方法上樣分析，分析結果采用外標法結合標準曲線，計算叢生竹中竹葉總黃酮含量。

(10)叢生竹中牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷含量的測定 將配好的不同濃度的竹葉黃酮標準品溶液按照HPLC的方法上樣分析，進行分別上樣和混合上樣，所得結果用于繪制標準品的標準曲線。將提取處理好的4種叢生竹提取物按照HPLC的方法上樣分析，分析結果結合混合標品中各竹葉黃酮標準曲線，采用外標法對叢生竹中牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷含量進行計算。

2 結果與分析

2.1 叢生竹竹葉黃酮超聲提取工藝

研究考察了勃氏甜龍竹的超聲提取工藝，以竹葉總黃酮得率為指標，分別考察了提取溶劑、料液比、提取溫度及超聲提取時間對得率的影響，確定其最佳的超聲提取工藝為:以70%甲醇作為提取溶劑，料液比1︰10，提取溫度40℃，超聲提取1h(圖1)。

圖1勃氏甜龍竹提取工藝

Fig.1 Extraction process ofD.brandisii(Munro)Kurz

2.2 HPLC測定竹葉黃酮中總黃酮的含量

2.2.1 叢生竹樣品HPLC色譜圖

采用叢生竹樣品的提取方法，將勃氏甜龍竹(a)、箬竹(b)、浦竹仔(c)、椅子竹(d)4種叢生竹中竹葉黃酮進行提取，處理后進行HPLC分析。4種叢生竹葉黃酮提取物的HPLC色譜圖見圖2。

圖24種叢生竹樣品HPLC色譜圖

注：勃氏甜龍竹〔Dendrocalamusbrandisii(Munro)Kurz〕，箬竹〔Indocalamustessellatus(Munro)Keng f.〕，浦竹仔(IndosasahispidaMcClure)，椅子竹(DendrocalamusbambusoidesHsueh et D.Z.Li)

Fig.2 HPLC chromatogram of four cluster bamboo

2.2.2 4種叢生竹竹葉總黃酮含量

以峰面積A為縱坐標對蘆丁標準品進樣濃度C(mg/mL)進行線性回歸，回歸方程為，A=12 589.67 C(mg/mL)+80.37，R2=0.998 7。根據(jù)蘆丁標準曲線及各樣品HPLC總峰面積(A≥50)，采用外標法，對4種叢生竹樣品中的總黃酮含量進行測定，結果見表1。4種叢生竹竹葉總黃酮含量，從高到低依次為箬竹>椅子竹>勃氏甜龍竹>浦竹仔。

2.3 HPLC測定叢生竹中牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷的含量

2.3.1 4種標準品混合的HPLC色譜圖

圖3為4種竹葉黃酮標準品同時進樣分析的HPLC色譜圖。從圖3可以看出，4種標準品的色譜峰均能被同時檢測到，并且各色譜峰之間實現(xiàn)了基線分離。葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷標準品的保留時間(RT)分別為13.978min、14.286min、15.007min、15.887min。此方法的建立，為后續(xù)叢生竹樣品中4種黃酮的同時測定奠定基礎。

表1 竹葉總黃酮含量

圖3 混合標準品HPLC色譜圖

2.3.2 4種叢生竹中牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、

異葒草苷含量測定

以峰面積A為縱坐標分別對牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷及異葒草苷標準品進樣濃度C(mg/mL)進行線性回歸，回歸方程分別為：牡荊苷A1=32 880.40 C(mg/mL)-257.80，R2=0.998 1；異牡荊苷A2=29 567.56 C(mg/mL)+405.8，R2=0.998 9；葒草苷A3=22 193.4 C(mg/mL)+183.59，R2=0.996 2；異葒草苷A4=23 969.14 C(mg/mL)+658.19，R2=0.994 4。根據(jù)4種竹葉黃酮標準品的標準曲線及各樣品HPLC總峰面積(A≥50)，采用外標法，對4種竹葉樣品中牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷含量進行測定，結果見表2。

表2 4種叢生竹中牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、

3 結論與討論

本研究采用超聲提取法對勃氏甜龍竹中竹葉黃酮進行提取，并考察了提取溶劑、料液比、提取時間及提取溫度對竹葉黃酮總得率的影響，篩選出勃氏甜龍竹最佳的提取工藝為70%甲醇作為提取溶劑、料液比為1:10、超聲時間60min、溫度40℃。在最佳條件下勃氏甜龍竹中總黃酮得率能達到4.63%。超聲提取方法所需時間較短，操作較為簡單，能實現(xiàn)擴大化生產(chǎn)。

采用HPLC法及外標法，對勃氏甜龍竹、箬竹、浦竹仔、椅子竹4種叢生竹中竹葉總黃酮及牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷的含量進行測定。蘆丁標準曲線方程為A=12 589.67 C(mg/mL)+80.37，R2=0.998 7，4種叢生竹中總黃酮含量分別為0.795 2%、1.166 9%、0.092 6%、0.897 2%。其中箬竹中總黃酮含量最高，浦竹仔中總黃酮含量較低。HPLC法測定箬竹總黃酮的結果與采用紫外分光光度法進行測定的相差不大(箬葉總黃酮含量在1.38%-1.92%)[15]，但采用HPLC操作更為簡單，效率高，并且葉綠素對結果干擾小，結果更準確。4種標準品的標準曲線分別為，牡荊苷A1=32 880.40 C(mg/mL)-257.80，R2=0.998 1；異牡荊苷A2=29 567.56 C(mg/mL)+405.8，R2=0.998 9；葒草苷A3=22 193.4 C(mg/mL)+183.59，R2=0.996 2；異葒草苷A4=23 969.14 C(mg/mL)+658.19，R2=0.994 4。勃氏甜龍竹、箬竹和椅子竹中均含有牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷及異葒草苷，浦竹仔中僅含有牡荊苷和異牡荊苷。本研究采用HPLC并分別以蘆丁及牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷對4種叢生竹中總黃酮及黃酮單體的含量進行了測定，使得測定結果更加準確。

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