福貢龍竹種子無菌誘導植株再生及快速繁殖

呼延麗，畢瑋，李燦雯，李丹，王娟，王毅,2，王四海，楊宇明

(1.云南省林業(yè)科學院，云南 昆明 650201；2.國家林業(yè)局重點開放性實驗室云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育實驗室，云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室，云南 昆明 650201)

福貢龍竹(Dendrocalamsfugongensis)，又名馬跨(福貢傈僳語)，系禾本科(Gramineae)竹亞科(Bambusoideae)牡竹屬(Dendrocalamus)大中型合軸叢生竹，產自云南福貢、維西等地，生于海拔1200m-1 800m的河谷地區(qū)[1]。福貢龍竹稈光滑，生長快速，姿態(tài)優(yōu)美，具有較高觀賞價值。福貢龍竹是怒江河谷地區(qū)的重要經濟竹種，既是良好的筍用竹，也是優(yōu)質的材用竹[2-3]，其開發(fā)前景廣闊。

竹類是一次性開花植物，開花周期長而不穩(wěn)定，開花后可能結實也可能不結實，但都將死亡。因此，人們還不能對竹類植物進行有規(guī)律的穩(wěn)定的有性繁殖[4]。竹類植物的組培快繁技術一直是竹類研究領域的熱點和難點，導致很多基于組培技術的深入研究如轉基因、體細胞雜交育種技術等研究目前尚無法在大多數竹種中開展，并極大阻礙竹類植物大規(guī)模的引種和推廣[5]。目前尚未見到國內外關于福貢龍竹良種選育和組織培養(yǎng)的研究報道。因此，本試驗以福貢龍竹種子為原始外植體，無菌誘導其植株再生，率先建立福貢龍竹的離體快繁體系，旨在短期內為種質資源的保存及工廠化育苗提供工作基礎，同時為進一步抗性研究、遺傳改良、生理生化特性研究等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料采自云南省怒江州福貢縣，為2014年11月收獲的福貢龍竹種子。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

以MS為基本培養(yǎng)基，加入不同濃度的植物生長調節(jié)劑。均添加3%蔗糖，0.5%-0.7%瓊脂或卡拉膠，抗壞血酸100mg/L或活性炭0.5g/L，調整pH值的范圍在5.8±0.2。培養(yǎng)溫度為(26±2)℃，光照度為30-50μmol/m2·s-1，光照時間為12h/d。滅菌溫度為121℃，滅菌時間25min。

1.2.2 種子消毒與預處理

挑選色澤鮮亮、顆粒飽滿、無病蟲害的種子，剝掉種殼。自來水沖洗3min，去除種子附屬器即種尖長花柱一端較多的茸毛。再浸泡于20%漂白劑(甲A bleach)且振蕩10min后無菌水沖洗3遍，放入超凈臺。

1.2.3 無菌系的建立和初代培養(yǎng)

在超凈臺內，將處理好的種子先用75%酒精消毒60s，再浸入0.1%的HgCl2溶液。HgCl2溶液消毒時間設置10min、20min、30min、40min、50min、60min 6個時間梯度，即6個處理(表1)。每個處理接種40粒為1個重復，共3個重復，即每個處理接種120粒種子。消毒過程中需用鑷子不斷攪動，充分滅菌，待消毒完畢，從HgCl2溶液取出后用無菌水沖洗5遍，并用無菌濾紙吸干水分，分別接種于初代培養(yǎng)基MS上，放置于培養(yǎng)室，14d后開始統(tǒng)計萌芽和污染狀況，其余既不萌芽也沒污染的死胚不作統(tǒng)計。萌發(fā)率=(無污染萌芽的胚數/每個處理接種的總胚數)×100%，污染率=(污染外植體數/每個處理接種的總胚數)×100%，30d后觀察記錄種胚萌發(fā)和幼芽生長狀況。

1.2.4 誘導叢生芽

種子萌發(fā)長出單株無菌幼苗，苗高2-3cm時，則剪去芽頂部分，剩1-1.5cm到生長點，根也應盡量剪除，轉接到誘導叢芽培養(yǎng)基中，誘導叢生芽培養(yǎng)基配方為MS+6-BA+IBA+KT，其中6-BA濃度為1mg/L和2mg/L，IBA濃度為0.5mg/L和1mg/L，KT濃度為0.2mg/L和0.4mg/L，組合成8個處理(表2)。每個處理接種10瓶為1個重復，每瓶接種1個外植體，共3個重復，即每個處理接種30株苗。30d后統(tǒng)計叢生芽的誘導率、叢生芽數量和生長情況，從而篩選出最適合誘導叢生芽的植物生長調節(jié)劑的配比。叢生芽誘導率=(發(fā)叢芽的株數/總接種株數)×100%。

1.2.5 繼代增殖培養(yǎng)

誘導叢生芽發(fā)生后，需轉接到增殖培養(yǎng)基進行多次繼代增殖。把幼嫩叢生芽分株成3-9個芽為一叢，接到增殖培養(yǎng)基中進行壯苗，每30-60d繼代一次。增殖培養(yǎng)基配方為MS+6-BA+NAA，其中6-BA濃度為2mg/L、3mg/L和4mg/L，NAA濃度為0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L，組合成9個處理(表3)。每個處理接種10瓶為1個重復，每瓶3個叢芽，共3個重復，即每個處理接種30瓶，90個叢芽。60d后觀察統(tǒng)計其增殖率和生長情況，篩選最優(yōu)叢生芽增殖培養(yǎng)基。

1.2.6 生根培養(yǎng)

以3-5個苗叢為一組，切取生長健壯，高5cm左右的苗叢接種到生根培養(yǎng)基中，轉入添加不同濃度IBA和NAA的MS培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)。每個處理接種30瓶，每瓶1個單株，重復3次。培養(yǎng)7-10d可長出根點和須根，30d后統(tǒng)計生根數和生根率，并觀察苗叢的生長情況。生根率=(生根的外植體數/接種的外植體總數)×100%。由于考慮下一步組培苗移栽的成活率，故不等到根系發(fā)育完全便打開封口膜煉苗。

1.2.7 煉苗移栽

經生根培養(yǎng)，挑選出生根整齊、生長健壯，苗高約5-7cm的植株進行煉苗。首先，將培養(yǎng)瓶移到大棚內放置1周，大棚內有覆蓋遮光率為50%的遮陽網，溫度控制在15-30℃，濕度為60%-70%。1周后揭開瓶蓋，每隔3-5h向瓶內噴霧狀水1次，且澆1層水，覆蓋1層薄膜保濕，保證80%以上相對濕度的小環(huán)境。持續(xù)4d左右，將苗取出，流水洗凈根上的培養(yǎng)基，移栽到預備好的2種基質中，即基質1(紅壤︰河砂︰腐殖土︰珍珠巖=2︰1︰1︰1)和基質2(紅壤︰河砂︰腐殖土=2︰1︰2)2個處理?；|均用0.2%的高錳酸鉀溶液拌土消毒備用。每個處理移栽30株，共3個重復。移栽時，小苗根部先用1‰的多菌靈溶液浸泡10min，移栽后立即用1‰的多菌靈水溶液作定根水，噴灑至基質浸透，用無紡布遮蓋保溫保濕。

1.3 數據統(tǒng)計

數據分析采用SPSS 16.0軟件，方差分析中兩兩均數比較采用S-N-K法。

2 結果與分析

2.1 外植體滅菌效果和初代培養(yǎng)

福貢龍竹種皮難剝離，種子兩端有皺褶且被茸毛，不易消毒，對其進行預處理是控制污染行之有效的前提。把種子先用75%酒精消毒60s后，再浸入0.1%的HgCl2溶液，進行不同消毒時間處理，見表1。

表1 不同消毒時間的滅菌效果

注：表中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

由表1可見，隨著消毒時間的增加，污染控制越好，但時間過長，易對種子造成傷害，導致幼芽畸形或死亡。種子浸入0.1%的HgCl2溶液30-40min后接種為宜，既能保持種子生活力又可控制污染率在10%左右。因此，D3號處理的消毒效果最為理想(圖1-A)，種子萌發(fā)早，接種后5-14d，可萌芽產生小植株，且萌發(fā)率達65.8%。

2.2 篩選誘導叢生芽的培養(yǎng)基

初代培養(yǎng)中種子萌發(fā)長出的單株無菌幼苗，應及時轉接到誘導叢生芽的培養(yǎng)基。約兩周莖段基部開始分化芽叢，培養(yǎng)30d后芽苗長勢差異明顯，可形成3-7個芽的叢生芽，見表2。從試驗結果看，6-BA在誘導福貢龍竹叢生芽的分化過程中起著主導作用。在8組誘導形成叢生芽的培養(yǎng)基中，叢生芽誘導率差異不大，各培養(yǎng)基對誘導叢生芽的影響主要表現在成叢時間、繁殖倍數、長勢方面的差異。綜合來看，適合誘導福貢龍竹叢生芽的最佳培養(yǎng)基為F5(圖1-B)：MS+6-BA 2mg/L +IBA 0.5mg/L +KT 0.2mg/L。

圖1 福貢龍竹的組織培養(yǎng)再生過程

注：A為剛萌發(fā)的無菌幼芽，B為單個芽尖培養(yǎng)誘導形成叢生芽，C為叢生芽的繼代增殖培養(yǎng)，D為叢生芽誘導生根，E為煉苗4d的組培苗，F為移栽90d后的幼苗

Fig.1 Regeneration process of D.fugongensis

2.3 叢生芽繼代增殖培養(yǎng)基的篩選

誘導出叢生芽后應及時分株，轉接到增殖培養(yǎng)基中。一般培養(yǎng)20d后，叢生芽基部可再分化出新的芽叢。經3-5次繼代增殖培養(yǎng)，可擴繁成9-20個芽的叢生芽。培養(yǎng)60d后統(tǒng)計叢生芽在各培養(yǎng)基的增殖狀況，結果見表3。不同6-BA濃度對福貢龍竹增殖培養(yǎng)的效果不同，6-BA濃度較低時，增殖效果不明顯；隨著6-BA濃度的增加，組培苗分化的不定芽明顯增加，當6-BA濃度高達4mg/L時增殖倍數最高，但芽叢密集，葉片扭曲呈水草狀；當6-BA濃度為3mg/L時增殖倍數高且苗生長最健壯。因此，篩選出最優(yōu)增殖培養(yǎng)基為P5(圖1-C)：MS+6-BA 3mg/L+NAA 0.2mg/L。

表3 植物生長調節(jié)劑對福貢龍竹叢生芽繼代增殖的影響

2.4 生根培養(yǎng)基的篩選

叢生芽接種于生根培養(yǎng)基后，14d左右開始產生不定根，苗叢基部長出白色根尖，之后迅速伸長，30d形成良好根系。叢生芽在不添加IBA或NAA的培養(yǎng)基中無法生根，其在添加IBA或NAA的培養(yǎng)基中均能100%生根，差異在于發(fā)根的快慢和根系生長狀況，見表4。

表4 植物生長調節(jié)劑對福貢龍竹生根的影響

故從整體比較而言，福貢龍竹叢生芽生根的最優(yōu)培養(yǎng)基為R8(圖1-D)，MS+IBA 1mg/L +NAA 0.5mg/L。

2.5 煉苗與移栽

將180瓶組培苗揭蓋，先置于室內煉苗1周后可清洗處理(圖1-E)，然后移栽到已經備好的基質中，移栽初期尤其要控制好小環(huán)境溫度18-30℃，需常噴霧狀水，保持相對濕度70%-85%。移栽1個月左右有新葉抽出，移栽3個月后苗高可達20cm(圖1-F)，見表5。3個月后統(tǒng)計成活率達81.1%。

表5 不同移栽基質對組培苗生長的影響

3 結論與討論

以福貢龍竹種子的組培快繁技術研究結果表明，用75%酒精消毒60s，再用0.1%的HgCl2溶液消毒30min的效果最好；適宜誘導形成叢生芽的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2mg/L+IBA 0.5mg/L+KT 0.2mg/L；最佳繼代增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 3mg/L+NAA 0.2mg/L；以MS+IBA 1mg/L+NAA 0.5mg/L為最佳生根培養(yǎng)基；將生根組培苗煉苗移栽，90d后成活率達81%以上。

無菌材料的獲得是建立無菌體系的關鍵前提[6]。福貢龍竹種尖長花柱一端密布茸毛，滅菌操作較困難，故應盡量清洗去除種子附屬器，加之采用75%酒精消毒60s和0.1%HgCl2溶液消毒30min對外植體表面消毒處理，獲得比較好的滅菌效果，同時也保證了種子正常萌發(fā)。繼代增殖過程中，偶有叢生芽內生菌污染現象[7]。隨著繼代次數的增加，菌量積累后才顯現出來，對于內生菌污染問題，目前采取的措施是剔除被污染的叢生芽，今后將考慮加入抗生素、生物活性物質等加以防治。

植物激素和植物生長調節(jié)物質在組織培養(yǎng)中起著至關重要的作用[8]。細胞分裂素在誘導叢生芽形成及增殖過程中作用明顯，當6-BA和KT濃度過高時，甚至出現不同程度的玻璃化叢生芽，苗一旦出現玻璃化，只能丟棄。不同原因為何均導致木質素合成受阻是研究植物玻璃化的核心問題[9]。要克服玻璃化現象，有待進一步研究。

褐變在植物組織培養(yǎng)過程中普遍存在，尤以木本植物組織培養(yǎng)中褐變明顯[10]。福貢龍竹褐化的現象在不同基因型間差異顯著，且會隨著繼代時間的增長而加重。因此，以褐化較嚴重的植物材料為研究對象，設法建立無其他因素干擾的組培體系，對于研究植物褐化的發(fā)生及作用機制很有必要[11]。

參考文獻：

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