云南及北方主栽核桃蛋白氨基酸綜合評(píng)價(jià)

耿樹(shù)香，寧德魯，賀娜，陳海云，肖良俊

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明650201;2.云南省木本油料工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650201)

核桃(Juglansregia)干果是堅(jiān)果之王，是食用人群最多、消費(fèi)量最大的干果。我國(guó)的核桃資源十分豐富，有超過(guò)上千個(gè)品種[1]。研究表明核桃仁中含量最高的兩種物質(zhì)是脂類(lèi)和蛋白質(zhì)，其中脂類(lèi)的含量高達(dá)75%，蛋白質(zhì)含量也達(dá)到25%[2]，核桃仁的成分中，由于產(chǎn)地不同，蛋白質(zhì)含量約為14%-17%，其可消化率達(dá)87%，核桃蛋白生物價(jià)達(dá)98.77%。根據(jù)他人對(duì)核桃蛋白的成分分析，醇溶谷蛋白、清蛋白、球蛋白和谷蛋白這4種蛋白質(zhì)組成了核桃蛋白，它們各自在核桃總蛋白中所占的比例分別為5.33%、6.81%、17.57%和70.11%[3]。從以上數(shù)據(jù)中可以看出谷蛋白是核桃蛋白中含量最高的蛋白質(zhì)。劉寶堯等[4-5]以青海6個(gè)核桃分布區(qū)核桃為參照，檢測(cè)其氨基酸含量,17種氨基酸被檢出，其中7種人體必需氨基酸占氨基酸總量的30%左右；谷氨酸含量最高(3.531%)，其次是精氨酸(2.474%)、天冬氨酸1.723%，含量最低的是賴(lài)氨酸(0.460%)。表明不同氨基酸含量差異明顯，其中精氨酸變異系數(shù)最大，纈氨酸變異系數(shù)最小。

蛋白質(zhì)是核桃中重要的營(yíng)養(yǎng)成分，核桃蛋白中含有大量的谷氨酸和精氨酸，可以開(kāi)發(fā)出良好的增智、促進(jìn)記憶、促進(jìn)鈣吸收和降血壓的保健品[6-7]，還含有鮮味氨基酸(如天冬氨酸)、甜味氨基酸(如甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸)、芳香氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸)及藥效氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸、賴(lài)氨酸等)[8]。云南省具有種植核桃優(yōu)越的自然條件，歷來(lái)是中國(guó)核桃主產(chǎn)區(qū)之一，而目前對(duì)云南核桃及北方核桃其蛋白質(zhì)的氨基酸的評(píng)價(jià)尚未深入研究。因此，本研究選擇了20個(gè)具有代表性的云南核桃及13個(gè)北方核桃的核仁蛋白質(zhì)及氨基酸進(jìn)行對(duì)比分析與評(píng)價(jià),篩選出氨基酸含量豐富且均衡的核桃品種，對(duì)于促進(jìn)核桃資源合理利用，為云南不同品種核桃進(jìn)行定性定量分析、良種選育、精深加工等提供理論依據(jù)，具有重要的指導(dǎo)意義[9]。

本研究選取云南主栽的20個(gè)核桃品種及陜西、山西、新疆具有代表性的13個(gè)北方核桃測(cè)定其蛋白質(zhì)及氨基酸。采用模糊識(shí)別法和氨基酸比值系數(shù)法對(duì)核桃蛋白的氨基酸進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)[10]，依據(jù)營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)指標(biāo)[11]，采用系統(tǒng)聚類(lèi)的方法將33個(gè)不同核桃品種進(jìn)行分類(lèi)，以期為合理開(kāi)發(fā)和利用優(yōu)質(zhì)核桃蛋白資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

供試核桃于2017年9月至10月采自云南核桃主栽區(qū)，每個(gè)品種選取生長(zhǎng)勢(shì)較一致、無(wú)病蟲(chóng)害的植株3株，在每株樹(shù)冠的上、中和下層及里外層隨機(jī)采集果實(shí)20個(gè)，充分混勻后于40℃烘干，再取樣測(cè)定蛋白質(zhì)及氨基酸。樣品名稱(chēng)及編號(hào)見(jiàn)表1。其中1-20號(hào)為云南核桃，21-33號(hào)為北方核桃。

表1 云南核桃及北方核桃試樣及編號(hào)

硫酸、凱爾特消化片(FOSS公司)、氫氧化鈉、硼酸、鹽酸(優(yōu)級(jí)純)、重蒸苯酚、檸檬酸鈉的緩沖溶液、茚三酮溶液(二甲基亞砜150mL+pH值5.2的乙酸鋰溶液50mL+水合茚三酮4g+還原茚三酮0.12g)、混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5mmoL/mL(SIGMA)。

1.2 儀器設(shè)備

BSA224S 電子天秤(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、小型研磨機(jī)、丹麥FOSS Soxtec 2008全自動(dòng)索氏抽提儀[福斯賽諾分析儀器(蘇州)有限公司]、DHG-9146A型烘箱(上海習(xí)仁科學(xué)儀器有限公司)、FOSS消化爐〔福斯賽諾分析儀器(蘇州)有限公司〕、FOSS全自動(dòng)凱氏定氮儀(KjeltecTM8400)、Biochrom30+氨基酸分析儀(英國(guó)biochrom公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

依據(jù)GB/5009.5-2010標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5g粉碎好的核桃仁樣品，移入干燥的定氮瓶中，加入0.1g硫酸銅、1g硫酸鉀及5mL硫酸進(jìn)行試樣消解，制備試樣溶液。加4.0mL乙酸鈉-乙酸緩沖溶液及4.0mL顯色劑，水浴中加熱15min。于波長(zhǎng)400nm處測(cè)量吸光度值，通過(guò)吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量求出樣品中蛋白質(zhì)含量[12]。

1.3.2 氨基酸組成測(cè)定

取一定量的核桃仁樣品，粉碎，全部過(guò)40目篩，混勻。稱(chēng)取約100mg(精確至0.0001g)混勻后樣品，置于20mL水解管中,加入15mL(1+1)鹽酸,在水解管中充入高純氮?dú)?，密封。將水解管放?10±1℃恒溫烘箱中,水解22h,取出后冷卻。將冷卻后的水解液過(guò)濾，取200μL至10mL試管中,蒸干，加入1mL超純水(除氨)復(fù)溶后,再蒸干。用1mL pH值2.2的緩沖液溶解后過(guò)0.45μm有機(jī)濾膜，上機(jī)分析。

核桃仁經(jīng)酸水解后，按照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)，運(yùn)用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定，脯氨酸在波長(zhǎng)440nm測(cè)定，其余16種氨基酸在570nm波長(zhǎng)下測(cè)定，17 種氨基酸在該分離條件下達(dá)到很好的分離效果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，計(jì)算出氨基酸含量的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差以及變異系數(shù)、核桃蛋白與模式蛋白的貼近度、RC、SRC值。并繪制出氨基酸總含量(total amino acids，TAA)和EAA含量折線圖及EAA平均含量柱形圖。采用SPSS 22.0軟件對(duì)33個(gè)核桃品種進(jìn)行聚類(lèi)分析和顯著性分析[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南核桃及北方核桃氨基酸組成分析

按照FAO/WHO模式或全雞蛋蛋白模式，必需氨基酸EAA分為9類(lèi)：Val、Ile、Leu、Phe、Tyr、Met、Cys、Thr、Lys[14-15]。對(duì)云南20個(gè)核桃品種的17種氨基酸含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 云南核桃氨基酸組成

續(xù)表2

編號(hào)纈氨酸Val蛋氨酸Met苯丙氨酸Phe異亮氨酸Ile亮氨酸Leu賴(lài)氨酸Lys脯氨酸Pro總含量TAAEAA10.6540.2410.5450.5390.9390.2320.83111.0253.698 20.6910.4520.6000.5701.0980.1971.27013.0464.145 30.9790.2320.9310.7231.2410.5350.31916.9835.610 40.5810.3430.4940.4830.9040.1801.01310.6933.420 50.6530.3680.5580.5471.0170.1971.08512.1163.858 60.5350.4940.4550.4390.8490.1601.12010.4763.342 70.5770.3960.4850.4710.9130.1700.72010.3483.485 80.4930.3630.4160.4040.7770.1490.9899.1132.948 90.5570.3630.4730.4610.8720.1730.97110.2643.338 102.1500.3471.6151.6072.5830.8951.14636.72711.548 110.4850.3300.4100.4050.7720.1550.7829.1032.934 120.5840.4090.4960.4850.9010.1831.05711.0403.523 131.5510.2321.1791.1652.0520.7270.81526.4938.597 142.0090.3451.5111.4932.4330.8091.06133.37110.735 151.7690.2681.2761.2871.9610.7130.47628.0169.391 161.9700.2711.4401.4502.2610.8290.88131.37110.386 171.6770.2631.2651.2262.1180.7720.60628.7729.226 181.6610.2811.2461.2222.1500.7270.68028.5739.137 191.9390.3441.4211.4172.2290.8660.58130.90010.318 201.6930.2971.3031.2732.2410.7721.03229.7849.510 SD0.0600.1700.1700.1700.2300.1300.170均值0.3101.4101.4101.3902.2300.7200.80019.4406.310CV19.35012.42012.42012.29010.30017.49021.350

由表2可知，不同品種的核桃仁均含有人體所需氨基酸的17種(色氨酸水解時(shí)被破壞，未檢出),20個(gè)核桃樣本的17種氨基酸均值為19.44%，其中9種必需氨基酸平均含量為6.31%，9種必需氨基酸中Tyr變異系數(shù)最大，為85%，Leu變異系數(shù)最小，為10.30%。非必需氨基酸中，His變異系數(shù)最大，為27.08%，Gly變異系數(shù)最小，為10.85%。

北方核桃氨基酸組成見(jiàn)表3。

表3 北方核桃氨基酸組成

續(xù)表3

編號(hào)纈氨酸Val蛋氨酸Met苯丙氨酸Phe異亮氨酸Ile亮氨酸Leu賴(lài)氨酸Lys脯氨酸ProTAAEAA212.2950.4611.7621.7422.6950.4420.89337.59512.964 222.2520.3551.6681.6652.5880.8610.94037.22712.116 232.1870.3361.6461.6242.6120.8741.00936.37111.778 242.1870.3891.6251.6182.5410.8341.01236.42511.824 251.8540.2831.3531.3732.0530.7680.54030.52010.264 261.9470.3181.4821.4542.4570.8421.02733.61410.728 272.0670.3371.5511.5372.4840.8490.94834.56211.177 281.6640.2481.2261.2361.9250.6750.83427.3508.869 291.9930.2971.4681.4362.2150.6950.58431.11510.395 301.8450.3511.3881.3702.2190.6440.72930.4229.787 311.5470.2341.1821.1692.2630.8640.67927.2538.996 322.1840.3131.6031.6192.4630.8730.77135.67211.736 332.0820.3021.5901.4362.4540.7941.01733.18510.855 SD0.2290.0590.1750.1710.2290.1270.170均值1.8810.3061.4091.3892.2280.7240.79731.06010.190CV12.19219.34612.41612.28610.29717.49021.346

注：表中TAA為17種氨基酸總量(%)；EAA為9種必需氨基酸總量(%)；SD為標(biāo)準(zhǔn)差；CV為變異系數(shù)。

由表3可知，北方13個(gè)品種核桃中17種氨基酸均值為31.06%，其中9種必需氨基酸平均含量為10.19%，9種必需氨基酸中Cys變異系數(shù)最大，為85.004%，Leu變異系數(shù)最小，為10.297%。非必需氨基酸中，Pro變異系數(shù)最大，為21.346%，Ala變異系數(shù)最小，為10.416%。表明不同核桃品種蛋白質(zhì)組成差異較大。

33個(gè)核桃樣TAA與EAA含量見(jiàn)圖1。

圖1 核桃中TAA與EAA含量

由圖1可知，TAA含量越高EAA含量也越高，TAA與EAA波動(dòng)方向一致。對(duì)TAA與EAA含量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，分析結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，TAA含量與EAA含量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為0.998。

表4 TAA與EAA含量相關(guān)性分析

注：**表示極顯著相關(guān)(P<0.01)。

2.2 氨基酸的主成分分析

對(duì)云南20個(gè)核桃品種與北方核桃13個(gè)品種的核桃仁中17種氨基酸做主成分分析和比較(見(jiàn)表5)。結(jié)果表明，云南核桃仁中氨基酸提取了2個(gè)主成分，第1主成分的貢獻(xiàn)率較高，為84.848%，其中絲氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸和丙氨酸有較大的特征向量值。第2主成分的貢獻(xiàn)率為9.786%，其中脯氨酸和蛋氨酸有較大的特征向量值。這2個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到94.634%，說(shuō)明這2個(gè)主成分基本概括了云南核桃仁中17種氨基酸的主要信息；另外，北方核桃仁中氨基酸提取了3個(gè)主成分，第1主成分的貢獻(xiàn)率較高，為70.703%，其中谷氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、絲氨酸和天冬氨酸有較大的特征向量值。第2主成分的貢獻(xiàn)率為13.099%，其中，脯氨酸和賴(lài)氨酸有較大的向量值，組氨酸和蘇氨酸有較大的負(fù)向量值。第3主成分的貢獻(xiàn)率為10.224%，其中賴(lài)氨酸有較大的向量值。3個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)94.026%，說(shuō)明這3個(gè)主成分基本概括了北方核桃仁中氨基酸的主要信息。

表5 云南核桃仁與北方核桃仁中氨基酸主成分成分矩陣

2.3 核桃仁17種氨基酸的綜合分析

用Z1、Z2代表云南核桃仁氨基酸的2個(gè)主成分，Z3、Z4、Z5代表北方核桃仁氨基酸的3個(gè)主成分，X1、X2、X3、……X15、X16、X17分別代表17個(gè)氨基酸成分，可得到如下的線性方程：

Z1=0.997X1+0.995X2+0.997X3+0.667X4+0.989X5+0.983X6+0.983X7+0.991X8+0.992X9+0.914X10+0.996X11-0.527X12+0.994X13+0.995X14+0.806X15+0.992X16-0.269X17

Z2=0.052X1+0.065X2+0.044X3-0.098X4-0.056X5+0.130X6+0.104X7+0.076X8+0.227X9+0.056X10+0.750X11+0.0371X12+0.080X13+0.109X14+0.067X15-0.045X16+0.855X17

同時(shí)，分別以第1、2、3、4主成分對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率a1、a2作為權(quán)數(shù)，構(gòu)建的綜合評(píng)價(jià)模型為,C云南=a1Z1+a2Z2

Z3=-0.971X1+0.995X2+0.972X3+0.583X4+0.807X5+0.634X6+0.943X7+0.884X8+0.993X9+0.572X10+0.966X11+0.861X12+0.978X13+0.985X14+0.909X15-0.056X16+0.577X17

Z4=-0.079X1+0.009X2-0.138X3-0.623X4+0.460X5-0.619X6+0.217X7+0.360X8-0.077X9-0.318X10-0.077X11-0.179X12-0.002X13-0.111X14+0.361X15+0.592X16+0.635X17

Z5=0.156X1+0.004X2+0.023X3+0.481X4-0.049X5+0.430X6+0.175X7-0.145X8-0.028X9-0.672X10+0.129X11-0.366X12+0.015X13+0.076X14-0.094X15+0.782X16-0.084X17

以北方核桃仁氨基酸第1、2、3主成分對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率a3、a4、a5作為權(quán)數(shù)，構(gòu)建的綜合評(píng)價(jià)模型為,C北方=a3Z3+a4Z4+a5Z5

將20個(gè)云南核桃品種與13個(gè)北方核桃品種的核桃仁中17種氨基酸指標(biāo)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)代入對(duì)應(yīng)的表達(dá)式中，得到各品種核桃仁中氨基酸的綜合得分值(C值)，見(jiàn)表6。

表6 各品種核桃仁中氨基酸的綜合得分值(C值)

由表6可知，云南核桃17種氨基酸的綜合得分值在6.288-29.368之間，蛋白品質(zhì)差異較大，其綜合評(píng)分20以上的有10號(hào)(昌寧細(xì)香)(29.368，最高)、14號(hào)(華寧大砂殼)(26.649)、16號(hào)(魯?shù)榇舐?號(hào))(25.13)、19號(hào)(娘青)(25.015)、20號(hào)(永11)(23.7)、13號(hào)(華寧大白殼)(21.223)等11個(gè)品種。北方核桃17種氨基酸的綜合得分值在7.792-25.064之間，最高為21號(hào)(陜西中林5號(hào))，最低的為31號(hào)(新疆溫185)，蛋白品質(zhì)差異較小。云南主核桃品種除云新系列外，其綜合評(píng)分20以上的有11個(gè)，占到全部品種的90%以上。北方核桃綜合得分值在20以上的有7個(gè)，占全部北方品種的65%。云南主栽核桃品種中云新系列氨基酸的綜合得分值相對(duì)偏低原因是其含油高，成熟期較早，鮮食口感純正香甜，一般作鮮食水果核桃。

2.4 聚類(lèi)分析

針對(duì)不同品種蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的差異進(jìn)行研究，對(duì)33個(gè)品種進(jìn)行了系統(tǒng)聚類(lèi)分析[15]，采用歐氏距離測(cè)定33個(gè)不同品種之間的組內(nèi)邊接距離，得出最短距離聚類(lèi)譜系圖(圖2)。從最大組內(nèi)連接距離中10處進(jìn)行劃分，將33個(gè)品種分成3類(lèi)，第1類(lèi)為3號(hào)(云新36)、8號(hào)(云新高原)、11號(hào)(三臺(tái))、9號(hào)(漾濞泡核桃)、6號(hào)(云新云林)、12號(hào)(臨滄漾濞泡核桃)、7號(hào)(云新306)、4號(hào)(云新43)、2號(hào)(云新303)、5號(hào)(云新301)、1號(hào)(云新64)，該類(lèi)核桃蛋白品質(zhì)評(píng)價(jià)最好；第2類(lèi)為10號(hào)(細(xì)香)，該類(lèi)核桃蛋白品質(zhì)次之；其余21種核桃為第3類(lèi)核桃品種，蛋白質(zhì)品質(zhì)較為一般。

圖2 核桃品種的系統(tǒng)聚類(lèi)分析

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

云南核桃與北方核桃33個(gè)品種的蛋白質(zhì)氨基酸種類(lèi)齊全，都含有17種氨基酸，其TAA范圍為9.103%-37.595%之間，EAA含量在2.948%-11.824%之間，TAA與EAA呈顯著正相關(guān)，TAA越高，EAA越高。不同品種核桃氨基酸含量差異顯著。核桃仁所含氨基酸種類(lèi)齊全，包含17種氨基酸，其中包括7種人體必需氨基酸。氨基酸種類(lèi)、氨基酸總含量與必需氨基酸含量高低、排列次序具有一致性；而且各種氨基酸之間比例也較均衡，基本符合WHO/FAO推薦值。

云南核桃與北方核桃在在主成分分析中云南核桃仁中氨基酸提取了2個(gè)主成分，第1主成分的貢獻(xiàn)率較高，為84.848%，第2主成分的貢獻(xiàn)率為9.786%，這2個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到94.634%，說(shuō)明這2個(gè)主成分基本概括了云南核桃仁中17種氨基酸的主要信息；而北方核桃仁中氨基酸提取了3個(gè)主成分，第1主成分的貢獻(xiàn)率較高，為70.703%，第2主成分的貢獻(xiàn)率為13.099%，第3主成分的貢獻(xiàn)率為10.224%,3個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)94.026%，說(shuō)明這3個(gè)主成分基本概括了北方核桃仁中氨基酸的主要信息。

云南核桃與北方核桃在聚類(lèi)分析中，云南云新系列及漾濞泡核桃、三臺(tái)均聚于第1類(lèi)，品質(zhì)較好。而北方核桃聚于第2或第3類(lèi)，品質(zhì)居中。

在33個(gè)核桃樣本的17種氨基酸的綜合得分評(píng)價(jià)上，云南的云新系列雖得分值相對(duì)偏低，但在蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)上是較好，說(shuō)明云南主栽品種營(yíng)養(yǎng)及功能具有豐富多態(tài)性，每一品種均有其營(yíng)養(yǎng)特異性，可考慮全方位開(kāi)發(fā)利用。

3.2 討論

本文研究材料取于中國(guó)核桃主栽區(qū)，結(jié)果具有一定的代表性，不同的評(píng)價(jià)方法針對(duì)不同的品質(zhì)指標(biāo)，在后續(xù)的研究中應(yīng)結(jié)合核桃的脂肪酸組成、碳水化合物及功能活性成分指標(biāo)進(jìn)行深入全面的探討。云南核桃資源豐富，可進(jìn)一步擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)樣本容量，深度挖掘并開(kāi)發(fā)云南省優(yōu)質(zhì)核桃資源、拓寬核桃深加工領(lǐng)域，為云南省核桃精深加工提供一定的理論基礎(chǔ)。

蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值決定于其氨基酸組成，核桃蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值優(yōu)于多種植物蛋白與水果，基本接近動(dòng)物蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是一種具有較高開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的可食用優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源[6,11]。本文重點(diǎn)分析了EAA對(duì)核桃營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響，后續(xù)研究可以結(jié)合核桃中的脂肪酸組成及含量、碳水化合物含量等營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)進(jìn)行更深入全面的探討。云南省核桃品種繁多，可進(jìn)一步擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)樣本量，豐富并驗(yàn)證營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)和品種分類(lèi)結(jié)果。研究結(jié)果為深度挖掘和開(kāi)發(fā)云南省優(yōu)質(zhì)核桃資源、拓寬核桃產(chǎn)品深加工領(lǐng)域、指導(dǎo)核桃的合理種植提供一定的理論依據(jù)。

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