兒茶素-稀土配合物的合成、表征及抗菌活性

余康，田翠翠，李霞，廖學(xué)品,2,3,＊，石碧,2,3

1四川大學(xué)生物質(zhì)與皮革工程系，成都 610065

2四川大學(xué)，皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610065

3四川大學(xué)，制革清潔技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，成都 610065

1 引言

食源性細(xì)菌以食品為主要渠道進(jìn)行傳播和感染，是影響食品質(zhì)量與公共安全的重要生物污染源。隨著抗生素為主的抗菌藥物的長(zhǎng)期使用，食源性細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題已日趨嚴(yán)重。因此，開(kāi)發(fā)多靶點(diǎn)、高效又安全的新型抗菌藥物替代抗生素變得越來(lái)越重要1。

兒茶素(Catechin，簡(jiǎn)稱(chēng)C)屬于黃烷醇類(lèi)物質(zhì)，廣泛存在茶葉、落葉松等植物體內(nèi)，是具有多元酚結(jié)構(gòu)的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其B環(huán)上的鄰位酚羥基較高的加質(zhì)子常數(shù) lg KH表明其具有很好的反應(yīng)活性，能以疏水鍵-氫鍵與蛋白質(zhì)(酶)多點(diǎn)鍵合2,3，其分子中鄰位酚羥基可以與金屬離子形成穩(wěn)定的五元螯合環(huán)4,5。此外，兒茶素還可以與多糖、脂質(zhì)、生物堿及 DNA發(fā)生復(fù)合反應(yīng)6–8。兒茶素可對(duì)多種微生物產(chǎn)生作用，Díaz-Gómez等9發(fā)現(xiàn)兒茶素對(duì)幽門(mén)螺桿菌的OD600影響甚大。Keller等10的研究表明 5 mg·m L?1的兒茶素可使腸道病原志賀氏菌數(shù)量減少 50%，同時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(M IC)達(dá)到 0.625 mg·m L?1。由此可見(jiàn)，兒茶素可以與維持細(xì)胞生理活性的多種物質(zhì)反應(yīng)并對(duì)細(xì)菌表現(xiàn)出一定的抑制作用。但是，由于C穩(wěn)定性差、膜穿透性不強(qiáng)11，在體內(nèi)對(duì)細(xì)菌的抑制作用相對(duì)較弱。另一方面，稀土(Rare earth，簡(jiǎn)稱(chēng) Re)作為一類(lèi)具有特殊電子層結(jié)構(gòu)的金屬元素，隨著稀土生物無(wú)機(jī)化學(xué)及其應(yīng)用的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)其具有抗凝血、抗炎殺菌、抗腫瘤等多種生物作用，并且可以與蛋白質(zhì)(金屬酶)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合而影響蛋白質(zhì)活性，也可以水解磷酸二酯鍵進(jìn)而損傷遺傳物質(zhì)DNA，還能夠改變磷脂表面電荷，影響與磷脂的結(jié)合牢固程度，同時(shí)，還可以與 Ca2+競(jìng)爭(zhēng)磷脂上的結(jié)合位點(diǎn)引起細(xì)胞膜代謝功能的紊亂12–14。Wakabayashi等15的研究表明稀土對(duì)細(xì)菌、真菌、線蟲(chóng)都有一定的殺菌作用，表現(xiàn)出廣譜抗菌性。Fujita等16發(fā)現(xiàn)在模擬廢水加入稀土Y或Eu (100 mg·m L?1)對(duì)硝化細(xì)菌的硝化作用具有顯著抑制。稀土離子Gd3+和Yb3+能明顯地抑制線粒體超氧化物歧化酶(SOD)的活性17。但是稀土離子的水溶性過(guò)強(qiáng)且易水解，與細(xì)胞的親和力較弱，難以到達(dá)細(xì)胞作用靶點(diǎn)，影響了其在抗菌領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，尋求合適的配體對(duì)于提高稀土的抗菌性能至關(guān)重要。

稀土離子屬于硬Lew is酸，離子半徑大、配位數(shù)高，易于和含氮、氧原子的硬堿配體配位，表現(xiàn)出強(qiáng)的親氧性18。而兒茶素是具有一定疏水性的多酚化合物，鄰位酚羥基可以與 Re3+發(fā)生配位反應(yīng)，得到具有脂溶性的配合物 Re3+-C，從而使 C和 Re3+的抗菌活性優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。由于該配合物解決了Re3+水溶性過(guò)強(qiáng)的問(wèn)題及C的穩(wěn)定性差、膜穿透性弱的問(wèn)題，配合物Re3+-C將表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗菌活性。另一方面，兒茶素及稀土本身對(duì)微生物具有一定的抑制作用，兒茶素能夠與蛋白、多肽及糖蛋白結(jié)合，兒茶素在作為抑菌劑的同時(shí)又可以作為載體將稀土有效的輸運(yùn)到細(xì)胞中，從而增強(qiáng)稀土及兒茶素的抑菌作用。因此，本文以C為配體，合成了3種稀土配合物(La3+-C、Gd3+-C、Er3+-C)，并研究其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌及沙門(mén)氏菌4種食源性細(xì)菌的抗菌活性。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

傅里葉變換紅外光譜(IS10美國(guó))、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-1800PC上海)、X射線光電子能譜(ESCA-850 日本)。

輕稀土：La(NO3)3·6H2O；中重稀土 Gd(NO3)3·6H2O；重稀土 Er(NO3)3·5H2O，均購(gòu)于 A laddin(99%)。

兒茶素C(98%)購(gòu)于上海瀚鴻化工科技有限公司。

大腸桿菌(Escherichia coli ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC23656)和綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC27853)購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，沙門(mén)氏菌(Salmonella SIIA235)由四川大學(xué)制革生物技術(shù)研究室提供。液體培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(Nutrient Broth，NB)，固體瓊脂平板和試管斜面培養(yǎng)基均在NB培養(yǎng)基中添加1.5%瓊脂。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 配合物的合成

按照摩爾比4 : 1，分別準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的C和Re(NO3)3溶于適量的二次水中，將Re(NO3)3以滴加的方式緩慢加入到C溶液中，在室溫下混合攪拌反應(yīng)6 h，冷凍干燥得到配合物Re3+-C。

2.2.2 菌懸液的制備

先將各試驗(yàn)菌株于試管斜面培養(yǎng)基上活化培養(yǎng) 18 h，然后刮取數(shù)環(huán)生長(zhǎng)良好的菌落于無(wú)菌生理鹽水中，并與 0.5麥?zhǔn)媳葷峁?相當(dāng)于菌懸液濃度 1.5 × 108CFU·m L?1，CFU，Colony-Form ing Units)對(duì)照，用無(wú)菌生理鹽水將各菌懸液濃度稀釋至 1 × 106CFU·m L?1。

2.2.3 抗菌活性的測(cè)定

抑菌圈：采用水平擴(kuò)散法(牛津杯法)，將高溫滅菌的培養(yǎng)基趁熱加入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，待其凝固制得無(wú)菌平板。吸取預(yù)先準(zhǔn)備的菌懸液200 μL于無(wú)菌平板上，經(jīng)無(wú)菌涂布棒涂布均勻，將無(wú)菌牛津杯輕置于含菌雙碟平板表面，接著取200 μL相應(yīng)濃度的配合物溶液注入牛津杯內(nèi)，然后于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)量各平板抑菌圈直徑(mm)。

最小抑菌濃度(M IC)：以二倍梯度稀釋法配制系列濃度的Re3+-C溶液，分別取1 m L加入無(wú)菌小試管中，利用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基將菌懸液稀釋至1 × 106CFU·m L?1。同時(shí)將等量的含菌培養(yǎng)液加入到各無(wú)菌小試管中，于37 °C培養(yǎng)24 h。觀察其生長(zhǎng)情況，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低配合物濃度(試管溶液澄清透明)為最小抑菌濃度19。

最小殺菌濃度(M BC)：取適量的最小抑菌濃度及其以上濃度的培養(yǎng)液于無(wú)菌瓊脂平板上，37 °C培養(yǎng)24 h。觀察其生長(zhǎng)情況，以沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)的瓊脂平板的最低配合物濃度為最小殺菌濃度。

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(SPSS19.0) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 配合物的表征

兒茶素又稱(chēng)兒茶精，是很多縮合類(lèi)單寧的結(jié)構(gòu)單體，為黃烷醇類(lèi)的衍生物，分子式為C15H14O6。其分子結(jié)構(gòu)中 B環(huán)上的鄰位酚羥基的lg KH比A環(huán)上兩個(gè)間位的酚羥基大，這表明B環(huán)具有較高的配位活性，從而使得其鄰苯二酚結(jié)構(gòu)與金屬離子的絡(luò)合反應(yīng)最容易發(fā)生。因此，稀土金屬離子Re3+與兒茶素B環(huán)鄰位酚羥基發(fā)生配位反應(yīng)，形成具有五元螯合環(huán)的Re3+-C配合物20，反應(yīng)原理如圖1a

3.1.1 傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜分析

采用KBr壓片法測(cè)得C和Re3+-C的紅外特征吸收光譜，如圖 2所示。配合物的紅外譜圖與配體 C相比發(fā)生了明顯的變化。3種配合物的特征吸收基本相似，表明 3種配合物在結(jié)構(gòu)上具有相似性。兒茶素分子中 O―H鍵伸縮振動(dòng)吸收峰出現(xiàn)在 3354 cm?1處，而當(dāng)其與稀土離子(La3+、Gd3+、Er3+)形成配合物后吸收峰均向高波數(shù)移動(dòng)。此外，1610–1530 cm?1苯環(huán)的骨架振動(dòng)也明顯減弱20。同時(shí)，兒茶素在1346與1238 cm?1的吸收峰為 O―H鍵面內(nèi)彎曲振動(dòng)和 C―O鍵伸縮振動(dòng)耦合所致，而配合物Re3+-C在這兩處的吸收峰明顯減弱或者消失，這均表明稀土金屬離子與酚羥基的氧配位成鍵21.22。

圖2 C及Re3+-C的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of C and Re3+-C.

3.1.2 紫外(UV)光譜分析

圖3為C及Re3+-C的紫外掃描圖譜。在C的紫外圖譜中，273 nm處出現(xiàn)一個(gè)明顯的吸收峰，是C分子結(jié)構(gòu)中的酚羥基的特征表現(xiàn)。在與Re3+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)后，使得配體C的電子云密度降低，整個(gè)分子中電子的離域程度增大，π電子的流動(dòng)性增強(qiáng)，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)所需的能量減小，因此該處特征吸收峰紅移至276 nm且吸光值有所減小23。

3.1.3 X射線光電子能譜分析(XPS)

C及Re3+-C的O 1s圖譜如圖4所示。C的O 1s圖譜僅有一個(gè)峰處于532.85 eV，這是C分子結(jié)構(gòu)中C―OH的O所表現(xiàn)出來(lái)的。而在Re3+-C配合物中均出現(xiàn)兩個(gè)峰，峰1為酚羥基的C―OH，峰2則是因?yàn)轵檄h(huán)的形成，酚羥基的O受到Re3+正電荷的影響，其電子云密度向 Re3+離子的空軌道偏移而降低，結(jié)合能(EB)位移至高能場(chǎng)24。

3.1.4 Re3+-C配合物配位數(shù)的測(cè)定

C與稀土離子 Re3+發(fā)生配位反應(yīng)時(shí)，酚羥基的離解促進(jìn)了H+的釋放，使反應(yīng)體系的pH降低，可以根據(jù)反應(yīng)后 pH的減少量來(lái)確定與 Re3+反應(yīng)的配位數(shù)25。圖5所示為不同摩爾比的C與3種Re3+配位反應(yīng)后pH的減少量?？梢钥闯觯瑢?duì)于同一種稀土而言，隨著摩爾比的增加，體系pH呈下降的趨勢(shì)，此時(shí)ΔpH隨之增大且在摩爾比為4 : 1時(shí)達(dá)到最大并趨于穩(wěn)定。此外，比較相同摩爾比時(shí)不同稀土離子與C反應(yīng)體系，隨著原子序數(shù)的增大，稀土 Re3+的半徑減小，配合物 Re3+-C中的Re―O鍵逐漸增強(qiáng)，而配體C的―OH上H受到中心離子(Re3+)的排斥作用更強(qiáng)，則其更容易離解釋而放出質(zhì)子(H+)，使得反應(yīng)體系pH降得更低26。因此，ΔpH隨Re3+原子序數(shù)的增大而增加，并且配合物的穩(wěn)定性也隨之增加。

由稀土離子 Re3+的配位反應(yīng)特性可知，其常見(jiàn)配位數(shù)為6–12，而C的分子結(jié)構(gòu)中B環(huán)的鄰位酚羥基具有較高的反應(yīng)活性，因此Re3+-C的配位數(shù)極有可能為8。其可能的結(jié)構(gòu)如圖1b所示。

圖3 C及Re3+-C的紫外光譜Fig.3 UV spectra of C and Re3+-C.

圖4 C (a)及Re3+-C (b, c, d)的O 1s XPS圖譜Fig.4 O 1s XPS spectra of C (a) and Re3+-C (b, c, d).

3.2 配合物抗菌活性

表1為C、Re3+及Re3+-C對(duì)4種常見(jiàn)食源性細(xì)菌的抑菌圈直徑，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表明在p ＜ 0.05水平Re3+-C配合物與Re3+相比差異顯著?？梢?jiàn)，在一定范圍內(nèi)，抑菌圈直徑與抑菌活性成正相關(guān)，因此，抑菌圈大小可以初步表征抑菌活性的強(qiáng)弱。由表中可以看出，四種細(xì)菌對(duì)C均不敏感，三種稀土離子 Re3+對(duì)四種測(cè)試菌株雖然都具有一定的抑制作用，但抑菌圈差異不大且抑菌效果并不顯著。相較Re3+及C而言，配合物Re3+-C的抑菌性能明顯提高，特別是對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑菌性能，這可能是因?yàn)椴煌⑸锛?xì)胞膜(壁)結(jié)構(gòu)上的差異27，金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，其細(xì)胞壁中肽聚糖含量為50%–80%，而綠膿桿菌、沙門(mén)氏菌及大腸桿菌這三種屬于革蘭氏陰性菌，肽聚糖含量?jī)H為5%–20%。因此，對(duì)于不同的菌株，配合物Re3+-C表現(xiàn)出了一定的差異性。

圖5 C與Re不同摩爾比反應(yīng)體系的pH變化量Fig.5 pH reduction of catechin and rare earth chelating

表1 抑菌活性(抑菌圈)的測(cè)定Tab le 1 Antibacterial activity(inhibition zone) of C, Re3+ and Re3+-C.

表2 C, Re3+ 及Re3+-C對(duì)四種食源性細(xì)菌的最小抑菌濃度Table 2 M IC of C, Re3+ and Re3+-C against four kinds of food-borne bacteria.

表2為C、Re3+及Re3+-C對(duì)4種食源性細(xì)菌的M IC值。相較于C與Re3+單獨(dú)作用，3種配合物的M IC值均明顯降低，雖然表1中Re3+與Re3+-C的抑菌圈表現(xiàn)差異不大，相較Re3+及C而言，配合物 Re3+-C的抑菌性能明顯提高(統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0分析在p ＜ 0.05水平差異顯著)，這可能是因?yàn)橐志Υ笮∽鳛槌醪皆u(píng)價(jià)抑菌活性指標(biāo)存在一定的局限性。從M IC值可以看出配合物Re3+-C的抑菌活性可以看出，Re3+與 C的協(xié)同效應(yīng)非常明顯。研究表明28,29，Re3+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)引起的生物效應(yīng)主要與 Ca2+相關(guān)，而在生物體內(nèi)，幾乎所有的生理活動(dòng)都受到 Ca2+的調(diào)控，而三種稀土Re3+的離子半徑(1.061–0.881 nm)與 Ca2+的離子半徑(0.990 nm)都較為接近，而且Re3+對(duì)四種食源性細(xì)菌的抑菌活性隨著稀土原子序數(shù)的增大而增加，這是因?yàn)橹叵⊥帘容p稀土及中重稀土的生物毒性高30。因此，對(duì)于配合物Re3+-C，其首先利用C的脂溶性到達(dá)細(xì)胞膜31，從而減少了穿透細(xì)胞膜磷脂雙分子層的阻力，一方面使細(xì)胞與環(huán)境的能量和物質(zhì)交換發(fā)生障礙，另一方面 Re3+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)可能干擾了 Ca2+的正常生物作用，引起細(xì)胞代謝紊亂，這可能是Re3+-C具有良好抑菌性能的原因。表 3是文獻(xiàn)報(bào)道的稀土配合物及其抗菌活性?？梢?jiàn)，Re3+-C的抗菌活性較高，特別重要的是兒茶素來(lái)源廣泛且無(wú)毒，因此，Re3+-C具有廣闊的應(yīng)用前景。

表4是C、Re3+及Re3+-C對(duì)4種食源性細(xì)菌的MBC，與Re3+及C相比，配合物Re3+-C的MBC值也顯著降低。結(jié)合表1、表2、表4可以發(fā)現(xiàn)，Re3+-C配合物的抑菌活性與Re3+和C相比均大大提高。一方面，這是因?yàn)镽e3+-C的形成增加了Re3+的脂溶性，脂溶性影響配合物穿透細(xì)胞膜的能力，這對(duì)于Re3+抑菌活性的提高至關(guān)重要。另一方面，我們的前期研究表明22，配合物Re3+-C的穩(wěn)定性隨稀土原子序數(shù)增大而增大，穩(wěn)定性則影響配合物Re3+-C進(jìn)入細(xì)胞中釋放Re3+的能力，因此，只有穩(wěn)定性合適的 Re3+-C配合物才能更好地發(fā)揮 Re3+的作用。而Er3+-C的穩(wěn)定性太強(qiáng)，Er3+難以在細(xì)胞中得到釋放，而相對(duì)較輕的稀土則更容易釋放并發(fā)揮作用。因此，配合物Re3+-C活性大小順序?yàn)镚d3+-C ＞ La3+-C ＞ Er3+-C。再者，因?yàn)橄⊥岭x子(Re3+)和鈣離子(Ca2+)的半徑相當(dāng)，而研究表明稀土可以進(jìn)入細(xì)胞取代Ca2+而影響微生物代謝，離子半徑越接近Ca2+，對(duì)細(xì)胞的影響就越大，因此配合物Re3+-C的半徑大小對(duì)抗菌性也有很大的影響。而Gd3+與Ca2+的離子半徑最為接近(分別為 0.938和 0.990 nm)，因此，Gd3+-C的抑菌活性相對(duì)較好。

表3 不同配體的稀土配合物的抗菌活性Tab le 3 Antibacterial activity of rare earth com p lexes of different ligands.

表4 C, Re3+及Re3+-C對(duì)四種食源性細(xì)菌的最小殺菌濃度Table 4 M BC of C, Re3+ and Re3+-C against four kinds of food-borne bacteria.

4 結(jié)論

水相中兒茶素 C可與稀土離子 Re3+形成配合物，配位數(shù)為8，配合物穩(wěn)定性與Re3+的結(jié)構(gòu)有關(guān)。由于兒茶素 C增加了 Re3+的脂溶性，使得 Re3+-C的抗菌活性較Re3+顯著提高，并表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用，同時(shí)，Re3+-C對(duì)四種食源性細(xì)菌的抗菌活性表現(xiàn)出一定的差異性，這與供試菌株的性質(zhì)及配合物自身的結(jié)構(gòu)(如中心離子半徑，配位數(shù)，穩(wěn)定性等)有關(guān)。后續(xù)將對(duì)稀土離子在細(xì)胞中的分布以及Re3+-C的作用靶點(diǎn)展開(kāi)研究，同時(shí)，Re3+-C納米抗菌劑同樣具有廣闊的研究前景。

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