白刺對胃癌MGC-803細胞的抑制作用

王亞峰，謝親建，丁曉煜，孫曉剛，羅淑平，賀葵邦

1青海省人民醫(yī)院藥劑科，青海 西寧 810000；2武警甘肅省總隊醫(yī)院；3中國人民解放軍蘭州總醫(yī)院

白刺是蒺藜科白刺屬的灌木，分枝多而密集，呈叢生狀，具有較強的固沙阻沙能力，而西北屬氣候條件惡劣，水資源缺乏，風(fēng)沙彌漫遍地的寬闊地帶，白刺是一種生長在沙漠的耐寒植物，它的果實光滑圓胖，如同微型圣女果，在陜甘蒙地區(qū)又被稱為“酸胖”，性溫、味甘、微堿酸，具有調(diào)經(jīng)活血，消食健胃的功效，用于治療肺病、胃病、心熱痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、消化不良等［1］。近年來有研究［2］表明白刺果的稀有金屬為鉻、鋅、鐵、錳、硒等微量元素和18種氨基酸，另外它所含的總黃酮及其衍生物是抗炎、降壓、擴張冠狀血管、抗癌的有效成分［3］。因此，本研究從細胞水平探討白刺果實能否有效抑制胃癌，為以后研究白刺治療癌癥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級昆明種小鼠50只，實驗動物許可證號：SCXK(甘)2013-0002，購自蘭州大學(xué)實驗動物中心，體質(zhì)量(18±2)g，雌雄各半。

1.2 儀器與試劑 Sartorius分析天平(SARTORIUS-BT23S)；KH-5200B超聲清洗器(昆山禾木超聲儀器有限公司)；Thermo CO2培養(yǎng)箱(thermoscientific公司)；Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)。小牛血清(四季青)；RPMI1640 培養(yǎng)基(美國 Solarbio 公司)；MGC-803細胞株(青海省人民醫(yī)院惠贈)；5-FU(5-氟尿嘧啶，上海旭東海普藥業(yè)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 白刺果液的制備 白刺果500 g(來自民勤縣騰格里沙漠，經(jīng)蘭州大學(xué)生藥學(xué)教研室馬教授鑒定），除去雜質(zhì)和霉變果實，清水沖洗、曬干；放入圓底燒瓶煎煮，加入純水2 500 mL，煎煮2～3次，1～1.5 h/次，過濾，合并濾液，濃縮至比重為1.025～1.030 g/mL，待用。

1.3.2 細胞培養(yǎng)與MTT檢測 將凍存的胃癌MGC-803細胞株在37℃水浴中迅速融化，加入2 mL RPMI1640吹打后放入15mL玻璃離心管中，800rpm離心，棄去上清液，在含有10%新生小牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，整個過程在無菌操作間進行。取對數(shù)生長期的胃癌MGC-803細胞，用含10%小牛血清的RPM1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至1.0×105/mL，接種至96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。待細胞貼壁后分別加入不同濃度(25，50，100，200 mg/mL)的白刺溶液，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)空白對照組。分別培養(yǎng)24、48、72小時后每孔加入 5 mg/mL的噻唑藍(MTT)試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，棄上清液，每孔加入DMSO 100 μL，震蕩至結(jié)晶溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測儀以570 nm測量波長測定各孔吸光度(A)，按以下公式計算：

抑制率(%)=(對照組-給藥組)／對照組

1.3.3 PI檢測細胞周期 取對數(shù)生長期胃癌MGC-803細胞，調(diào)整至每毫升2.0×105個細胞，接種于6孔板，每孔3 mL。待細胞貼壁后加入不同濃度的白刺溶液，每孔加入藥物后終體積為1 000 μL。培養(yǎng)48小時后，消化收集細胞，800 rpm離心5分鐘，棄上清。預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液(PBS)重懸細胞，離心洗滌3次，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇4℃固定過夜。上機前用預(yù)冷的PBS洗滌，加入PI染色液(含 RNA 酶 5 mg/mL)，終濃度 500 μg/mL，避光染色15分鐘，300目尼龍網(wǎng)過濾后上流式細胞儀分析細胞DNA含量的變化，每個樣本隨機分析10 000個 /mL。

1.3.4瑞氏——吉姆薩染色細胞形態(tài)學(xué)的觀察 取對數(shù)生長期的胃癌細胞，計數(shù)、稀釋，最終細胞密度為2×106個/mL，接種于6孔板上，每孔加3 mL的細胞，接種24小時后，按照給藥濃度分別為200、100、50 mg/mL 3組和空白對照組，每孔分加300 μL的白刺溶液，空白對照組用等體積培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小時后。PBS洗滌2遍，取少量細胞離心涂片，瑞氏——吉姆薩染色，光鏡下觀察形態(tài)。1.3.5 毒性試驗 參照文獻［4-6］方法觀察白刺對昆明種小鼠的毒性試驗。將昆明種小鼠20只分為高劑量組、空白對照組，每組10只。2周后用斷頭法處死小鼠，用病理觀察方法觀察小鼠臟器。

2 結(jié)果

2.1 白刺溶液對胃癌MGC-803細胞的抑制作用 不同濃度白刺溶液作用于胃癌MGC-803細胞24、48、72小時均可抑制細胞增殖。隨著藥物濃度和作用時間的增加，該藥的抑制作用逐漸增強，但作用48～72小時時抑制率的增幅逐漸減小，100～200 mg/mL作用72小時的抑制率相近，見圖1。

圖1 不同時間白刺溶液對胃癌MGC-803細胞的抑制率

2.2 白刺溶液對胃癌細胞周期的影響 白刺溶液對胃癌細胞周期的影響結(jié)果見圖2。

圖2 白刺溶液對胃癌細胞周期的影響

2.3 白刺溶液對胃癌細胞形態(tài)學(xué)的影響 光學(xué)顯微鏡下對照組MGC-803細胞分布均勻，大小一致，加入相同體積的RPMI1640作用細胞48小時，可見細胞無變化。加入50mg/mL白刺溶液后MGC-803細胞體積縮小，細胞不規(guī)則，細胞膜周邊形成小泡，處于凋亡小體的形成中。加入100mg/mL的白刺溶液后MGC-803細胞體積連接緊密不規(guī)則，細胞膜周邊有的形成小泡，處于形成凋亡小體的過程中。加入200 mg/mL的白刺溶液作用于MGC-803細胞

圖3 白刺溶液對胃癌細胞形態(tài)學(xué)(HE×200)

圖5 肝臟(HE×40)

圖7 肺臟(HE×40)

3 討論

胃癌是一種常見腫瘤，近年來調(diào)查表明在水土與氣候條件惡劣的環(huán)境中，胃癌的發(fā)病率增高，胃癌治療的主要手段是切除，但是復(fù)發(fā)率較高。因此，為了防止腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，延長患者的生存時間和提高患者的生活質(zhì)量，減輕患者痛苦，學(xué)者們不斷尋找治療癌癥的各種藥物。近年來在中醫(yī)傳48小時，細胞數(shù)量減少，細胞出現(xiàn)破裂，不規(guī)則程度增大，有可能逐漸向凋亡狀態(tài)過渡，見圖3。

圖4 心臟(HE×40)

圖6 脾臟(HE×40)

圖8 腎臟(HE×40)

2.4 白刺溶液對小鼠臟器的影響 光鏡下心肌細胞均勻完整，未發(fā)現(xiàn)心肌細胞及內(nèi)膜纖維化；小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細胞排列整齊，無壞死狀態(tài)，無炎細胞浸潤，匯管區(qū)有輕微的炎性細胞浸潤；脾、肺、腎臟與空白對照組相比，無明顯變化。由此可知，白刺溶液對小鼠的臟器沒有明顯不良影響，見圖4—8。統(tǒng)理論的指導(dǎo)下，用中藥來治療癌癥受到國內(nèi)外重視［7-8］。本研究發(fā)現(xiàn)白刺果對胃癌MGC-803細胞具有增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡作用。從圖1—2可知，隨著時間和藥物濃度的增加，抑制率逐漸增大，但是當(dāng)白刺果的濃度增大到200 mg/mL時，抑制率逐漸處于平衡狀態(tài)。從形態(tài)學(xué)變化可知：細胞出現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)，細胞膜周邊形成小泡，處于凋亡小體的形成期，隨著濃度的增大，細胞數(shù)量減少，細胞出現(xiàn)破裂，不規(guī)則程度增大，有可能逐漸向凋亡的狀態(tài)過渡；從病理學(xué)角度可知，未見該藥對小鼠臟器的損傷作用。

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