Trametes sp. MA-X01漆酶對不同染料的脫色作用

王 倩， 丁 蕾， 祝嫦巍(安徽科技學院 生命與健康科學學院，安徽 鳳陽 233100)

隨著現(xiàn)代紡織工業(yè)的飛速發(fā)展，有機合成染料被廣泛使用。各種染料隨污水排放，造成水體色度增高，BOD增加，嚴重污染環(huán)境。另外某些種類的染料如偶氮類或苯胺類還具有致癌、致突變等毒性作用，嚴重危害人類的健康。各種染料大都具有復雜且穩(wěn)定的化學結(jié)構(gòu)，很難進行降解，對生態(tài)環(huán)境具有很大的負面影響[1-2]。因此，尋找有效降解染料的方法意義重大。染料廢水的處理方法有多種，傳統(tǒng)的物理化學方法包括混凝沉降法、膜分離法、光氧化法、超聲氧化法等等。但用這些方法處理廢水不但付出巨大成本，效率也不高，降解的產(chǎn)物還有可能造成環(huán)境的二次污染，相對而言運用生物酶處理染料廢水具有更好的環(huán)保效果[3-5]。

白腐真菌是一類能夠引起木材腐朽降解的絲狀真菌，可以合成多種胞外木質(zhì)素氧化酶包括木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶等。同時白腐真菌對于各種不同結(jié)構(gòu)的天然及合成化學物質(zhì)如苯、苯胺、氰化物、多環(huán)芳烴、偶氮染料等都具有的強大降解能力。漆酶作為一種多酚氧化酶，它可催化氧化酚類或芳胺類等多種底物，同時分子氧被還原為水，在降解各種有機污染物(酚類和非酚類等)及染料脫色方面具有較強的應用潛力[6-7]。

漆酶是100多年前由一位日本學者首先在漆樹(Rhus vernicifera)中發(fā)現(xiàn)的，其催化底物十分廣泛，且副產(chǎn)物只有水，故被稱為“生態(tài)友善的”酶[8]。漆酶在自然界中廣泛存在，不僅分布于真菌和植物中，在昆蟲和細菌等原核生物中也存在漆酶或漆酶類似物。其中白腐真菌產(chǎn)生的漆酶被認為催化反應效果最好，能有效的降解環(huán)境中的多種有機污染物[9-10]，因而受到廣受關(guān)注。

從安徽科技學院校園內(nèi)取材而分離得到一株漆酶產(chǎn)生菌，經(jīng)ITS序列比對分析，該菌屬于栓菌屬(Trametes)，將其命名為Trametessp. MA-X01。本文探討了該菌所產(chǎn)漆酶對3種不同結(jié)構(gòu)類型的6種染料的脫色能力，以期為染料脫色的生物酶法處理以及在工業(yè)環(huán)保中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試供菌株及培養(yǎng)基 漆酶產(chǎn)生菌株Trametessp. MA-X01(安徽科技學院生物技術(shù)實驗中心篩選并保藏)。PDA固體培養(yǎng)基或PDB液體培養(yǎng)基用于菌株常規(guī)保存和培養(yǎng)使用。PDA固體培養(yǎng)基：新鮮去皮土豆200 g煮汁，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g， 瓊脂粉15～20 g，溶化后加水定容至1 000 mL。121℃滅菌30 min。PDB液體培養(yǎng)基：不添加瓊脂，其余成分與PDA相同。

1.1.2 主要試劑 ABTS(2 ,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)購于上海麥克林生化科技有限公司；香蘭素、丁香酸購于生工生物工程(上海)股份有限公司；伊文思藍、酸性鉻蘭K、酸性紅94、堿性紅2、孔雀石綠、亮綠SF購于國藥集團化學試劑有限公司。6種染料的結(jié)構(gòu)式如表1所示。

表1 不同染料的化學結(jié)構(gòu)式Table 1 Chemical structure formula of different dyes

1.1.3 儀器 V-1800型可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司制造；恒溫搖床：武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司；DNP-9272-1A電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學儀器有限公司；HH-S3數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市白塔金昌實驗儀器廠；RJ-TGL-16G臺式高速離心機：無錫市瑞江分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗酶液的制備 取4 cm×4 cm左右的新鮮固體培養(yǎng)物均質(zhì)后接種至100 mL液體培養(yǎng)基中，在160 rpm、28℃的恒溫搖床中震蕩培養(yǎng)7 d。所得發(fā)酵液于4℃、3 000 rpm離心5 min，收集的上清液即為粗酶液。

1.2.2 漆酶活力的測定 酶活反應體系總體積3 mL，其中含2.3 ml 0.2 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=4.5)，0.5 mL粗酶稀釋液和0.2 mL 1 mmol/L ABTS 溶液。測定反應體系在420 nm處吸光值的變化。定義1 min 催化氧化l μmol ABTS 所需的酶量為一個酶活力單位(U)。420 nm處ABTS摩爾消光系數(shù)ε=36 000 /M·cm。

1.2.3 染料的脫色處理 染料脫色反應在0.2 mol/L pH=4.5醋酸-醋酸鈉緩沖液中，避光條件下進行，反應體系總體積10 mL。在該種染料的最大吸收波長下測定反應初始及每隔一段時間后的最大吸收值。反應體系中，各種染料、反應介體等溶液均采用醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.2 mol/L，pH=4.5)進行配置或稀釋，反應體系中介體的終濃度為10 μmol/L。

1.2.4 脫色率的計算 脫色率(%)=(Ai-Af)/Ai×100%，其中Ai為反應初始吸收值，Af為反應終止吸收值。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化還原介體對染料脫色的影響

相關(guān)研究表明，在反應體系中添加一定的氧化還原介體可以提高漆酶對染料的脫色效率[11-12]。本研究首先探討了3種不同介體(ABTS、香蘭素、丁香酸)對染料脫色率的影響。室溫下進行脫色反應1 h后，測定吸光值，計算脫色率，結(jié)果如圖1所示。在不添加氧化還原介體的條件下，Trametessp. MA-X01漆酶對不同結(jié)構(gòu)染料均有一定的脫色能力，染料的脫色率為三苯甲烷類>偶氮類>雜環(huán)類。與對照組相比，在反應體系中添加不同介體對不同染料脫色率都有一定提高作用，其中添加ABTS效果最好，因此在后續(xù)實驗中選用ABTS為反應添加介體考察其他條件對漆酶脫色的影響。

圖1 不同介體對染料脫色的影響Fig.1 Effect of different redox mediators on the decolorization rate of different dyes

2.2 反應溫度對染料脫色的影響

不同反應溫度對染料的脫色率的影響結(jié)果如圖2。將反應體系分別置于20、30、40、50、60℃的條件下進行試驗，反應1 h后測定菌株Trametessp. MA-X01所產(chǎn)漆酶對不同染料脫色能力。隨著反應溫度的升高，染料的脫色率有所提高，各種染料的在最高脫色率均出現(xiàn)在反應溫度40℃的條件下。隨著溫度的進一步升高，脫色率逐漸降低，其中伊文思藍、酸性鉻蘭K的脫色率降幅極為明顯，伊文思藍在60℃的脫色率僅為40℃的50%，酸性鉻蘭K在60℃的脫色率僅為40℃的35.94%。

圖2 反應溫度對染料脫色率的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on the decolorization rate of different dyes

2.3 反應時間對染料脫色的影響

如圖3所示，隨著溫育時間的延長，各種染料的降解率逐漸提高。但實驗結(jié)果顯示，Trametes sp. MA-X01所產(chǎn)漆酶對不同染料最大脫色速率發(fā)生在反應的前3 h，3～12 h染料脫色率的增幅顯著降低。但對于不同的染料，脫色率的變化不同。例如亮綠SF 3 h脫色率達64.93%，12 h脫色率84.68%，24 h脫色率89.10%，即24 h脫色率比3 h脫色率增加約30%。而對于堿性紅2，3 h脫色率15.93%， 24 h脫色率30.77%，約增加1倍。因此，在應用時可根據(jù)實際需要調(diào)整反應時長，提高脫色效率，降低生產(chǎn)成本。

圖3 反應時間對染料脫色的影響Fig.3 Effect of reaction time on the decolorization rate of different dyes

2.4 給酶量對染料脫色的影響

不同給酶量(1 U、5 U)對染料脫色率的影響結(jié)果如圖4。實驗表明，提高給酶量可以提高染料的脫色率。但對不同類型的染料脫色率的影響差異較大。Trametessp. MA-X01漆酶對三苯甲烷類染料(孔雀石綠和亮綠SF)的脫色效果最好，在給酶量為1 U的條件下，脫色率在80%左右，而在5 U的給酶條件下，脫色率均高于90%。即給酶量提高5倍，脫色率提高10%。對于兩種偶氮類染料(伊文思藍和酸性鉻蘭K)，脫色效率中等，在給酶量由1 U提高到5 U，脫色率提高接近1倍。對于兩種雜環(huán)類染料(酸性紅94和堿性紅2)，給酶量由1 U提高到5 U，染料脫色率分別提高51 %和40 %。

圖4 給酶量對漆酶脫色的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on the decolorization rate of different dyes

2.5 染料濃度對染料脫色的影響

反應液中染料濃度對脫色率的影響結(jié)果如圖5所示。對于脫色率較高的幾種染料，伊文思藍、孔雀石綠、亮綠SF，染料濃度對于脫色率幾乎沒有影響。而對于脫色率較低的幾種染料，隨著反應液中染料濃度的增加，脫色率逐漸降低。反應液中染料濃度由50 mg/L提高到200 mg/L，脫色率降低約30%。

圖5 染料濃度對脫色率的影響Fig.5 Effect of dye concentration on the decolorization rate of different dyes

3 結(jié)論與討論

漆酶在自然界中廣泛存在，具有較強的催化降解多種環(huán)境污染物的能力，但不同來源漆酶的酶學特性以及降解能力存在差異。本論文對白腐真菌Trametessp. MA-X01所產(chǎn)漆酶對3種結(jié)構(gòu)類型的6種染料的脫色能力進行研究,實驗結(jié)果顯示，白腐真菌Trametessp. MA-X01所產(chǎn)漆酶對不同種類的染料均有較好的脫色能力。在反應液中添加氧化還原介體ABTS可以提高漆酶對染料的脫色作用，該酶在40℃的反應條件下具有較好的催化效率，在反應的前3 h具有較高的脫色速率，這些可能與該酶的最適反應溫度以及酶穩(wěn)定性等酶學特性相關(guān)。另外脫色率的差異也與底物本身的結(jié)構(gòu)特征和化學性質(zhì)有關(guān)。因此，今后將進一步探討Trametessp. MA-X01所產(chǎn)漆酶的特性，以及對不同底物的催化特異性，以期建立高效催化反應體系，為該漆酶在染料脫色及環(huán)保領(lǐng)域中的應用奠定基礎(chǔ)。

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