漆酶介體催化的研究進(jìn)展

謝 軍 張思婧 陳洪章

（中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所生物質(zhì)煉制工程北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190）

漆酶介體催化的研究進(jìn)展

謝 軍 張思婧 陳洪章

（中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所生物質(zhì)煉制工程北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190）

謝軍，中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所，碩士研究生，從事生物質(zhì)工程的研究工作。

E-mail:xiejun14@mails.ucas.ac.cn

漆酶，又稱酚酶，是一類可有效降解木質(zhì)素的含銅多酚氧化酶，在氧氣存在的條件下能夠氧化降解木質(zhì)素的酚型結(jié)構(gòu)單元，在某些具有傳遞電子能力的介體作用下，對(duì)木質(zhì)素的非酚型結(jié)構(gòu)單元也有較好的降解效果（漆酶一般只能催化氧化酚型底物，無(wú)法作用于非酚型底物，介體的加入可通過(guò)電子傳遞實(shí)現(xiàn)漆酶對(duì)非酚型底物的催化氧化）。作為一種多功能金屬氧化酶，漆酶具有寬泛的催化底物譜，且其催化氧化反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)副產(chǎn)物為水，是一種“綠色催化劑”，成為近年來(lái)生物酶催化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前對(duì)于漆酶介體催化的研究涉及制漿造紙、污水處理、環(huán)境毒物降解、食品加工、材料合成及藥物合成等各個(gè)領(lǐng)域。但是，合成介體存在成本高、毒性大、易使漆酶失活等缺點(diǎn)，而成分單一的天然介體在提純制備過(guò)程中存在成本問(wèn)題，從而制約了其進(jìn)一步應(yīng)用。研究表明，木質(zhì)素降解過(guò)程中產(chǎn)生的酚類物質(zhì)作為漆酶介體，在漆酶催化過(guò)程中可促進(jìn)漆酶氧化，可作為未來(lái)漆酶催化介體的一個(gè)新研究方向。

1 漆酶結(jié)構(gòu)及催化機(jī)理

自然界中真菌漆酶的氧化還原電位較低（0.5～0.8V），只能氧化降解具有低氧化還原電勢(shì)的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的酚型單元，而不能氧化降解木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的非酚型單元。漆酶具有3個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)（T1、T2、T3），一般結(jié)合4個(gè)銅離子。這4個(gè)銅離子分別為I型銅，Ⅱ型銅和Ⅲ型銅，分別與T1、T2和T3結(jié)合，其中I型銅在T1位點(diǎn)與3個(gè)氨基酸配位（包括2個(gè)組氨酸、1個(gè)半胱氨酸），Ⅱ型銅在T2位點(diǎn)與2個(gè)組氨酸和1個(gè)水分子配位，Ⅲ型銅在T3位點(diǎn)包括2個(gè)銅離子，這2個(gè)銅離子分別與3個(gè)組氨酸配位，2個(gè)Ⅲ型銅之間通過(guò)氫氧橋配位。漆酶催化過(guò)程中，底物首先在T1位點(diǎn)被氧化，釋放出電子被T1位的銅捕獲，經(jīng)半胱氨酸傳遞給與T2位的銅結(jié)合的組氨酸，再進(jìn)一步將氧分子還原為水。

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2 漆酶介體催化進(jìn)展

許多底物由于體積過(guò)大難與漆酶的活性部位結(jié)合，或者由于氧化還原電位高于漆酶而不能直接氧化。漆酶介體的加入就是基于電子轉(zhuǎn)移、氫轉(zhuǎn)移、離子氧化等不同的催化機(jī)制實(shí)現(xiàn)漆酶與非酚類及大分子木質(zhì)素等底物間的電子傳遞。漆酶介體催化最本質(zhì)的機(jī)理是漆酶催化底物產(chǎn)生自由基，自由基之間通過(guò)電子傳遞實(shí)現(xiàn)漆酶對(duì)底物的最終氧化。Xie等研究發(fā)現(xiàn)Cot A漆酶與介體作用的關(guān)鍵位點(diǎn)是酚酸結(jié)構(gòu)鄰位的甲氧基。Murugesan等分別以HBT（1-羥基苯并三唑）、丁香醛做介體降解抗菌劑TCS（二氯苯氧氯酚），結(jié)果表明，用HBT降解TCS生成2,4-二氯苯酚，用丁香醛降解TCS生成2-氯對(duì)苯二酚。

漆酶催化的常用介體是一些酚型化合物和雜環(huán)物質(zhì)，可分為天然介體和合成介體。合成介體中，研究較多的是2,2-聯(lián)氨-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）、1-羥基苯并三唑（HBT）、紫脲酸（VIO）、N-羥基-N-乙?；桨罚∟HA）、2,2,6,6-四甲基哌啶（TEMPO）、吩噻嗪等雜環(huán)化合物。這些合成介體大都有毒且價(jià)格昂貴，而且還可能影響漆酶的活性及穩(wěn)定性，于是研究人員開(kāi)始尋找穩(wěn)定高效、低毒價(jià)廉的天然介體。來(lái)源于木質(zhì)素降解產(chǎn)物的3-羥基鄰氨基苯甲酸和來(lái)源于真菌次生代謝產(chǎn)物的紫丁香醛等天然介體已開(kāi)始被研究。Camarero等首次利用木素小分子酚類衍生物作為漆酶的天然介體，對(duì)不同染料進(jìn)行脫色，研究發(fā)現(xiàn)乙酰丁香酮、乙酰香草酮、對(duì)香豆酸、二甲基苯酚、乙基香草醛、甲基香草酸酯、丁香醛、三甲氧基苯酚、香草醛和香草醇等一些衍生自木素的酚醛類小分子都能作為漆酶催化的天然介體，促進(jìn)染料脫色。K?nst等在研究漆酶介體體系（LMS）促進(jìn)乙醇脫氫酶（ADH）催化裂解氧化反應(yīng)中，發(fā)現(xiàn)咖啡酸、綠原酸、丁香醛和乙酰丁香酮、木質(zhì)素酚類都是有效的天然介質(zhì)。Kudanga等研究發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素降解產(chǎn)生的乙酰丁香酮、沒(méi)食子酸、香草醇、抗癲香素、紫丁香酸、對(duì)香豆酸、丁香醛、3-羥基-2-氨基苯甲酸、鄰苯二酚、2,6-二甲酚、2,4,6-三甲基苯酚、香莢蘭乙酮、乙基香蘭素、介子酸、阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸、肉桂酸、松伯醇等小分子物質(zhì)都是良好的漆酶天然介體。邱衛(wèi)華等總結(jié)了木質(zhì)素分解產(chǎn)物中漆酶天然介體的研究進(jìn)展，從汽爆秸稈水洗液、造紙黑液和木質(zhì)纖維素生物降解產(chǎn)物等方面論述了從木質(zhì)纖維素原料降解產(chǎn)物中分離漆酶天然介體并進(jìn)行應(yīng)用的可能性。

從目前的研究來(lái)看，許多天然介體與合成介體的催化降解效果相當(dāng)，甚至優(yōu)于合成介體。Andreu等比較了天然介體丁香醛和乙酰丁香酮與HBT介體對(duì)紅麻脫木素效果的影響，結(jié)果顯示天然介體可以替代HBT。Moreira等比較了丁香醛、HBA（4-hydroxybenzoic acid）、HBT、DOPAC（4-dihydroxiphenilacetic acid）、2,3DHBA（2,3-dihydroxybenzoic acid）5種不同介體對(duì)活性藍(lán)19（染料）的脫色效果，結(jié)果表明丁香醛作介體時(shí)脫色效果最好，比單獨(dú)使用漆酶時(shí)脫色效率提高3倍。Gutiérrez等用木質(zhì)素降解物作為天然介體替代HBT等合成介體，去除了制漿中的脂溶性物質(zhì)。Struch等以香草醛、香草酸和咖啡酸為介體，漆酶催化脫脂酸奶，使其流變性能和食品口感發(fā)生改變。

但是，目前的研究?jī)?nèi)容仍然是以合成介體為主，天然介體由于提取純化成本較高，導(dǎo)致應(yīng)用受限。因此，尋找一種新的、制取工藝簡(jiǎn)單、分離成本低的天然介體系統(tǒng)，對(duì)于漆酶催化具有重要意義。

3 漆酶介體催化應(yīng)用

漆酶作為一種多功能金屬氧化酶，具有寬泛的催化底物譜，不僅能催化酚類和芳香胺類化合物氧化，也能降解多環(huán)芳烴等難降解物質(zhì)。因此，漆酶介體體系可應(yīng)用于木質(zhì)素生物降解、紙漿改性、造紙廢水處理、染料廢水脫色、環(huán)境污染物的脫除以及多環(huán)芳烴降解等多個(gè)領(lǐng)域。

3.1 環(huán)境污染物的脫除

農(nóng)藥尤其是含氯的芳香類化合物的過(guò)度使用嚴(yán)重污染環(huán)境，利用漆酶可以降解氯酚類等環(huán)境污染物。Mir-Tutusaus等研究了云芝漆酶/ABTS系統(tǒng)對(duì)生物農(nóng)藥imiprothrin（IP）、oxytetracycline（OTC）、cypermethrin（CP）、carbofuran（CBF）的降解，發(fā)現(xiàn)IP、OTC、CP、CBF均可以得到有效降解，且降解速率IP>OTC>CP>CBF。Prieto等用白腐菌/ABTS降解抗生素藥物環(huán)丙沙星和諾氟沙星，使其毒性有效降低。Arca-Ramos和Liu等分別以HBT和ABTS為漆酶介體，對(duì)蒽、苊進(jìn)行降解。

3.2 脫色脫毒

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在紡織工業(yè)中，染料成分通常是芳烴化合物，一般很難被降解，用一般的物理化學(xué)方法對(duì)紡織廢水很難達(dá)到脫色脫毒的效果，且費(fèi)用較高。Benzina等以HBT為介體成功地對(duì)紡織工業(yè)廢水進(jìn)行脫毒處理。Yang等的研究表明，以低毒的乙酰丙酮作為介體，利用LMS對(duì)污水脫色脫毒，比以HBT為介體更穩(wěn)定，而且可循環(huán)使用。

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鋼鐵工序利用鋼渣在我國(guó)得到廣泛應(yīng)用，但是由于鋼渣中的P元素含量較高，在燒結(jié)或高爐等工序中利用不能過(guò)量，以磷為例，近年來(lái)高磷鐵礦的使用必然造成鐵水脫磷后鋼渣磷含量上升，如果將鋼渣大比例和持續(xù)循環(huán)利用，將容易造成磷循環(huán)富集，加大后期煉鋼生產(chǎn)負(fù)擔(dān)。

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3.3 紙漿改性

由于漆酶可以氧化或降解木質(zhì)素，其在造紙中的應(yīng)用主要集中在脫墨、廢水處理和改善紙漿濕強(qiáng)度等方面。研究結(jié)果表明，經(jīng)漆酶處理可以有效提高紙漿的濕強(qiáng)度；紙漿中木素含量越高，漆酶改善紙漿性能的效果越明顯。漆酶/介體體系可通過(guò)氧化降解紙漿表面的木素來(lái)達(dá)到脫除油墨的目的。Xu等以紫脲酸為漆酶介體，發(fā)現(xiàn)半纖維素酶與LMS有協(xié)同脫墨的效果。

3.4 有機(jī)合成

漆酶催化有機(jī)物的合成的操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和且毒副產(chǎn)物較少，在介質(zhì)存在的情況下，可催化多種合成反應(yīng)。漆酶催化的聚合反應(yīng)，能夠生成一些傳統(tǒng)化學(xué)法不可能合成的聚合物。通常認(rèn)為在聚合反應(yīng)過(guò)程中，首先底物傳遞給漆酶一個(gè)電子，形成底物自由基，然后底物自由基與其他分子耦聯(lián)產(chǎn)生二聚體、三聚體乃至多聚體。Shumakovich等以 KMo（CN）做介體，將EDOT

38（3,4-ethylenedioxythiophene）聚合成低聚物，應(yīng)用于晶體管、發(fā)光二極管及光電池領(lǐng)域。Mathew等將氧化馬鈴薯淀粉的伯羥基選擇性地氧化成醛和羧酸，以TEMPO為介體，低水平的氧化適用于表面施膠，而高度氧化淀粉用于制備紙張涂料、涂料和樹(shù)脂。Ganachaud等用TEMPO做介體，催化吲哚三聚。Piccinino等用碳納米管固定漆酶，漆酶/TEMPO和ABTS介體催化高效成醛反應(yīng)。Molina等采用漆酶/HBT系統(tǒng)氧化不飽和脂肪，產(chǎn)物主要是環(huán)氧脂肪酸和羥基脂肪酸，而甾醇氧化產(chǎn)物多為甾酮。

此外，漆酶還能催化酚類或芳胺類底物氧化合成新型化合物，如各種藥物、氨基酸、多肽等。Galletti等以TEMPO作為介體，漆酶催化芐胺合成醛亞胺，用于抗腫瘤藥物的合成。Kochius等用ABTS為介體，LMS系統(tǒng)原位再生煙酰型輔酶（NADP），在制藥、食品、精細(xì)化工、農(nóng)藥等領(lǐng)域有重要應(yīng)用。

4 木質(zhì)素降解產(chǎn)物中的漆酶介體

實(shí)際上，木質(zhì)纖維素原料汽爆水洗液可以看做是一個(gè)包含多種小分子木質(zhì)素降解產(chǎn)物的混合介體體系。已有研究表明，在不同介體組成的混合體系中，介體之間存在漆酶催化底物反應(yīng)的連續(xù)電子傳遞。因此，木質(zhì)素降解物包含的酚類物質(zhì)可以組合在一起作為漆酶的天然介體組催化漆酶應(yīng)用。

人工合成的漆酶催化介體存在成本高、毒性大、易使漆酶失活等缺點(diǎn)，而一般所說(shuō)的漆酶天然介體指的是單一成分的介體，存在分離純化成本高的問(wèn)題，因此漆酶催化一直未在工業(yè)上得到廣泛應(yīng)用。木質(zhì)素降解物的天然介體組合具有原料易得、制取工藝簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，在催化漆酶染料脫色和合成環(huán)氧化物方面均取得成功。所以，從木質(zhì)纖維素原料的降解物（如汽爆水解液）中提取高性能漆酶天然介體可以作為未來(lái)漆酶介體發(fā)展的一個(gè)重要方向。

5 結(jié)論與展望

漆酶介體催化體系的底物范圍寬泛，有廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域。目前應(yīng)用的漆酶介體催化體系中，大多數(shù)還是采用合成介體，如ABTS、HBT、TEMPO等，但是存在價(jià)高、有毒、影響漆酶活性等問(wèn)題，而單一組分的漆酶天然介體提取純化工藝復(fù)雜，導(dǎo)致成本較高，這都限制了漆酶介體催化體系在工業(yè)上的應(yīng)用。尋找穩(wěn)定、高效、低毒和價(jià)廉的天然介體仍是當(dāng)前的研究重點(diǎn)。木質(zhì)素降解產(chǎn)生的酚類物質(zhì)等已經(jīng)被證明是良好的漆酶天然介體，但是，目前關(guān)于這些酚類物質(zhì)產(chǎn)生和遷移機(jī)理尚未明確，其在漆酶的催化體系中的具體作用及其對(duì)漆酶活性的影響還有待深入研究，而且此類小分子物質(zhì)獲取的濃度一般較低，成分復(fù)雜，分離純化的成本較高有待降低。因此，高效、低成本、低毒地構(gòu)建漆酶天然介體催化體系，是未來(lái)漆酶工業(yè)化應(yīng)用的研究重點(diǎn)。

［本研究得到國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（“973”計(jì)劃）（No. 2011CB707401）資助。］

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漆酶是一種含銅多酚氧化酶，可催化氧化酚型底物，不能氧化降解非酚型結(jié)構(gòu)單元，但介體的加入可實(shí)現(xiàn)漆酶與非酚類底物間的電子傳遞，實(shí)現(xiàn)漆酶對(duì)非酚型底物的最終氧化。文章綜述漆酶介體催化常用介體及其研究進(jìn)展，并針對(duì)合成介體有毒價(jià)高、天然介體提取純化復(fù)雜的特點(diǎn)，提出一種新型介體——木質(zhì)素降解產(chǎn)物中的漆酶介體。