云南松松針?biāo)幉馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

楚雄醫(yī)藥高等專科學(xué)校，云南 楚雄 675000

松針(pineneedle)，別名豬鬃松毛、松毛、山松須，為松科松屬植物的針狀葉。松針是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，在歷代本草中均有記載?！秳e錄》謂其：“主風(fēng)濕瘡，生毛發(fā)，安五臟”。《本草綱目》記載：“松針，氣味苦、溫、無(wú)毒，久服令人不老，輕身益氣，主風(fēng)濕瘡，生毛發(fā)，安五臟，守中，不饑延年”[1]?，F(xiàn)代研究表明，松針具有鎮(zhèn)痛、抗炎、鎮(zhèn)咳、祛痰、抗突變、降血脂、降血壓、抑菌等作用，其利用價(jià)值日益受到關(guān)注[2-4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，松針中含有山柰酚等黃酮類成分[5],山柰酚在防癌、抗癌、抗感染、抗炎及免疫抑制等方面有重要作用[6]。另外，山柰酚還能夠降低血糖，改善胰島素抵抗[7]。本研究對(duì)云南松松針中所含該活性成分采用TLC及HPLC進(jìn)行了定性、定量研究，并對(duì)藥材的水分、灰分、浸出物進(jìn)行了測(cè)定，為制定松針的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、開(kāi)發(fā)新藥奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20A高效液相色譜儀(日本島津)；Sartorius BS 224S萬(wàn)分之一分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海-恒科學(xué)儀器有限公司)；SX2-4-10箱式電阻爐(上海-恒科學(xué)儀器有限公司)；索氏提取器；As10200型超聲波清洗機(jī)(北京華博科技制造有限公司)；DZKW-4電子恒溫水浴鍋(上海科析試驗(yàn)儀器廠)。

1.2 材料 硅膠G預(yù)制薄層板(批號(hào)20141006,青島海洋化工廠，100 mm×100 mm)；HPLC級(jí)乙腈(德國(guó)MERCK公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純；山柰酚對(duì)照品(批號(hào)MUST-13121112,成都曼思特生物科技有限公司)。松針?biāo)幉?批，分別產(chǎn)自楚雄(2批)、南華、永仁、牟定、大姚、祿勸、大理、巍山。經(jīng)楚雄醫(yī)藥高等專科學(xué)校生藥教研室姚榮林教授鑒定為云南松(PinusyunnanensisFranch)松針。

2 方法及結(jié)果

2.1 水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物的測(cè)定

2.1.1 測(cè)定方法[8]水分測(cè)定參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部0832項(xiàng)下水分測(cè)定法中第二法(烘干法)；總灰分、酸不溶性灰分測(cè)定參照2302項(xiàng)下灰分測(cè)定法；浸出物測(cè)定參照2201項(xiàng)下浸出物測(cè)定法，以乙醇為溶劑，采用熱浸法測(cè)定醇溶性浸出物。

2.1.2 測(cè)定結(jié)果 9批樣品的水分、總灰分和酸不溶性灰分、浸出物的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。9批云南松松針?biāo)幉乃值钠骄繛?1.25%，總灰分的平均含量為3.28%，酸不溶性灰分的平均含量為0.27%，醇溶性浸出物的平均含量為20.83%。依照《中國(guó)藥典》中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究制定技術(shù)要求，按其平均值的±20%作為限度的制定幅度，暫定云南松松針?biāo)幉乃趾坎坏贸^(guò)13.50%，總灰分不得超過(guò)3.94%，酸不溶性灰分不得超過(guò)0.32%，醇溶性浸出物不得少于16.66%。

表1 松針?biāo)幉母鳈z查項(xiàng)目及藥材山柰酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.2 松針的薄層色譜(TLC)鑒別 取云南松松針?lè)勰?g，加甲醇-20%鹽酸(4∶1)混合溶液50 mL，回流提取1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取山柰酚對(duì)照品，加甲醇制成1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶5∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁顯色，在紫外燈(365 nm)下檢識(shí)，山柰酚熒光斑點(diǎn)清晰，分離效果理想。薄層色譜圖如圖1所示。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱:InertSustainC18(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流動(dòng)相：乙腈∶0.3%磷酸水溶液(30∶70)；流速：1 mL/min；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：365 nm，進(jìn)樣量：10 μL。色譜柱的理論板數(shù)按山柰酚計(jì)算應(yīng)不低于6000，分離度大于1.5。如圖2所示。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 取山柰酚對(duì)照品9 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，使成為0.9602 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3.3 供試品溶液的制備 稱取云南松松針?lè)勰?4號(hào)篩)約1.0 g，精密稱定，各加入甲醇-20%鹽酸(4∶1)混合溶液25 mL，加熱回流提取2次，每次1.5 h，合并濾液并定容至50 mL量瓶中，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，備用[9]。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 mL置10 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，配成0.09602 mg/mL的對(duì)照品；分別精密吸取上述對(duì)照品溶液2、4、6、8、10 μL按上述色譜條件依次進(jìn)樣，以山柰酚進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=5×106X-9184.3,r=0.9998，山柰酚在0.19～0.96 μg范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。如圖2所示。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取山柰酚對(duì)照品溶液(0.096 02 mg/mL)10 μL,按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄山柰酚色譜峰峰面積RSD為0.84%，顯示具有良好的精密度。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3.3”項(xiàng)下操作，處理同一樣品5份，精密吸取10 μL進(jìn)樣檢測(cè)，記錄山柰酚的峰面積，計(jì)算RSD為1.21%(n=5)，表明實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性較好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下，于0、4、8、12、16 h分別記錄山柰酚峰面積，計(jì)算峰面積的RSD值為1.01%，表明供試液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，精密稱取已知含量的藥材適量，分別精密加入一定量的山柰酚對(duì)照品，按供試品制備與測(cè)定方法，在上述色譜條件下，平行做5組，結(jié)果測(cè)得其平均回收率為101.04%，RSD為1.02%。

2.3.9 樣品測(cè)定 依上述方法，測(cè)定9批松針?biāo)幉闹猩借头雍?。結(jié)果見(jiàn)表1。色譜圖如圖3所示，圖中1為山柰酚。

3 討論

3.1 樣品處理?xiàng)l件的確定 本研究考察了甲醇-10%鹽酸(4∶1)、甲醇-20%鹽酸(4∶1)和甲醇-30%鹽酸(4∶1)3種水解溶劑。結(jié)果表明以甲醇-20%鹽酸(4∶1)混合液作為水解溶劑時(shí)所得樣品含量最高，故確定采用甲醇-20%鹽酸(4∶1)混合液為水解溶劑。又以甲醇-20%鹽酸(4∶1)混合液為溶劑，比較了回流和超聲方法對(duì)提取率的影響，結(jié)果回流提取率明顯高于超聲。同時(shí)還進(jìn)一步比較了不同提取時(shí)間和次數(shù)對(duì)提取效果的影響，最終確定提取2次，每次1.5 h基本能夠提取完全。

3.2 薄層條件的確定 通過(guò)比較多種展開(kāi)系統(tǒng)苯-乙酸乙酯-乙酸、環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸、甲苯-乙酸乙酯-甲酸、環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮等，結(jié)果表明環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶5∶1)作為展開(kāi)劑斑點(diǎn)清晰、分離度好。考察了三種不同品牌的薄層板:硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)、硅膠G薄層板(青島美高集團(tuán)有限公司)、自制硅膠G薄層板，均可對(duì)松針中山柰酚成分進(jìn)行定性鑒別。按照試驗(yàn)所得薄層色譜條件，考察本品在溫度15～29℃、相對(duì)濕度為40%～70%展開(kāi)時(shí)，對(duì)薄層色譜結(jié)果的影響。結(jié)果表明，在上述溫度、相對(duì)濕度范圍內(nèi)對(duì)該薄層色譜結(jié)果無(wú)明顯影響，9批不同產(chǎn)地的松針樣品均可檢出山柰酚，斑點(diǎn)清晰且方法簡(jiǎn)便、快速、可行，此方法可用作松針?biāo)幉牡亩ㄐ澡b別。

3.3 色譜條件優(yōu)化 考察了2種色譜柱,InertSustainC18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)和Phenomenex Gemini-NX C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱，結(jié)果顯示，后者所得山柰酚峰和雜質(zhì)峰分離效果較差，峰形展寬，而前者分離效果較好，故選擇InertSustainC18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱。對(duì)不同流動(dòng)相系統(tǒng)(甲醇-水、乙腈-1%冰醋酸、乙腈-0.3%磷酸、甲醇-0.3%磷酸水溶液)，結(jié)果顯示以乙腈-0.3%磷酸水溶液(30∶70)的分離效果較好，所得峰形及峰純度最好?？疾炝瞬煌魉?0.8、0.9、1.0 mL/min)、不同柱溫(25、30、40 ℃)，確定最佳流速為1 mL/min，柱溫40 ℃。在上述條件下測(cè)得山柰酚相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、分離度均符合定量測(cè)定要求。

本實(shí)驗(yàn)首次比較全面建立了云南松松針?biāo)幉乃?、灰分、浸出物檢查，薄層色譜鑒別以及藥材含量測(cè)定方法，且方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高，為松針?biāo)幉牡馁|(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

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