HPLC-ELSD測(cè)定磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿含量的方法研究

王小賓，張秉華，楊樹民，高玉瓊，郭利影，楊廣德*

(1.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061； 2.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，西安 710065；3.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，石家莊 050031)

磷脂酰絲氨酸[1-2]又稱絲氨酸磷脂、二酰甘油酰磷酸絲氨酸或復(fù)合神經(jīng)酸(phosphatidylserine，PS)，一般由天然大豆榨油剩余物提取。由于其具有很強(qiáng)的親脂性，吸收后能夠迅速通過血腦屏障進(jìn)入大腦，起到舒緩血管平滑肌細(xì)胞、增加腦部供血的作用[3-4]。2010年根據(jù)《中華人民共和國食品安全法》和《新資源食品管理辦法》的規(guī)定，磷脂酰絲氨酸被批準(zhǔn)為新資源食品，并對(duì)其含量規(guī)定為50.0%～60.0%[5]。歐盟批準(zhǔn)磷脂酰絲氨酸用于酸奶、巧克力等食品。磷脂酰絲氨酸的制備方法較多，以提取法和酶轉(zhuǎn)化法為主，提取法主要是從植物細(xì)胞和動(dòng)物的卵磷脂中提取磷脂酰絲氨酸[6-12]。

磷脂酰膽堿(phosphatidyl choline, PC)是一種兩性分子，由親水的頭部和疏水的尾部組成，亦稱卵磷脂。磷脂酰膽堿在蛋黃和大豆中特別豐富，在食品行業(yè)中廣泛用作乳化劑。工業(yè)用磷脂酰膽堿主要是作為大豆油精煉過程中的副產(chǎn)品獲得[13]。溶血磷脂酰膽堿(lyso-phosphatidyl choline，L-PC)是磷脂的降解產(chǎn)物，由于最常用的磷脂類化合物為卵磷脂，因而溶血磷脂一般是指溶血卵磷脂。

目前，對(duì)磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿的檢測(cè)有核磁共振和薄層色譜，使用最多的是HPLC法，應(yīng)用檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器或蒸發(fā)光檢測(cè)器，對(duì)復(fù)雜、體內(nèi)和多組分樣品主要用蒸發(fā)光檢測(cè)器(ELSD)[14-26]。由于合成反應(yīng)過程中，通常需要檢測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行程度以及合成物的純度，關(guān)于磷酯酰絲氨酸和磷脂酰膽堿同時(shí)測(cè)定方法卻未見報(bào)道。參考有關(guān)文獻(xiàn)，制定HPLC-ELSD方法，對(duì)磷酯酰絲氨酸的含量及其殘留的合成原料磷脂酰膽堿的含量同時(shí)進(jìn)行有效的控制，解決磷酯酰絲氨酸含量測(cè)定的實(shí)際問題。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Alliance HT色譜系統(tǒng)(美國Waters 公司)；Empower 色譜管理軟件(美國Waters 公司)；Alltech 3300 ELSD 蒸發(fā)光檢測(cè)器(美國格雷斯公司)；色譜柱：LiChrospher 100 Diol (100 mm×4.6 mm, 5 μm);CPA225D型十萬分之一電子天平(沈陽神宇龍騰天平有限公司)；KQ5200B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Millipore超純水機(jī)(美國Millipore公司)。

1.2試藥 磷脂酰絲氨酸對(duì)照品(購自SIGMA公司，批號(hào)1001498227，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%)；磷脂酰膽堿對(duì)照品(購自SIGMA公司，批號(hào)0691K521，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%)；磷脂酰膽堿原料(北京美亞斯磷脂技術(shù)有限公司，批號(hào)20120416)；磷酯酰絲氨酸樣品及半成品(均為實(shí)驗(yàn)室自制)；正己烷(色譜純，TEDIA公司)；異丙醇(色譜純，SIGMA公司)；三乙胺(色譜純，CNW公司)；冰醋酸、三氯甲烷(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為經(jīng)Millipore純水機(jī)處理過的超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 采用LiChrospher 100 Diol色譜柱 (100 mm×4.6 mm, 5 μm)。流動(dòng)相A為正己烷-異丙醇-冰醋酸-三乙胺(825∶170∶5∶0.8)及流動(dòng)相B異丙醇-水-冰醋酸-三乙胺(845∶150∶5∶0.8)，梯度洗脫：0～5 min：5%～20%B；5～8.5 min：20%～40%B；8.5～15 min：40%～100%B；15～17.5 min：100%B；17.5～20 min：100%～5%B；20～25 min：5%B。流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器漂移管溫度：85 ℃；氣體流速：2.5 L·min-1；柱溫：35 ℃。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取磷脂酰絲氨酸對(duì)照品和磷脂酰膽堿試藥19.95和20.03 mg，置于同一25 mL量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度均為0.8 mg·mL-1磷酯酰絲氨酸和磷脂酰膽堿混合對(duì)照溶液。

2.2.2供試品溶液 分別精密稱取同一批號(hào)磷脂酰膽堿合成磷酯酰絲氨酸過程樣品20 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加入20 mL三氯甲烷超聲溶解，冷卻至室溫，用三氯甲烷稀釋至刻度，0.45 μm微孔濾膜濾過，備用。在反應(yīng)開始及反應(yīng)完成后，測(cè)定磷酯酰絲氨酸或磷脂酰膽堿含量時(shí)，取樣200 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加入20 mL三氯甲烷超聲溶解，冷卻至室溫，用三氯甲烷稀釋至刻度，0.45 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.3系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 分別吸取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液、空白溶劑以及供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。結(jié)果表明，在此色譜條件下，磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿分離良好，理論塔板數(shù)按照磷脂酰絲氨酸峰計(jì)算一般不低于5 000，磷脂酰絲氨酸色譜峰和磷脂酰膽堿色譜峰分離度應(yīng)不小于2.5，拖尾因子在0.95～1.05之間，空白溶液不干擾測(cè)定。色譜圖見圖1。

圖1HPLC圖

A.對(duì)照品；B.供試品；C.磷脂酰絲氨酸半成品；D.空白溶劑；1.磷脂酰膽堿；2.磷酯酰絲氨酸。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference;B.sample；C.mid-product of phosphatidylserine; D.solvent;1.phosphatidyl cholines;2.phosphatidylserine.

2.4線性關(guān)系考察 量取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照溶液7.5，5，5和2.5 mL，分別置于10，10，20和20 mL量瓶中，用三氯甲烷稀釋至刻度，搖勻。制成含磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿分別均為0.1，0.2，0.4，0.6和0.8 mg·mL-1的線性系列溶液。精密量取各質(zhì)量濃度線性系列溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)(x)、峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(y)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，磷脂酰膽堿線性方程為：y=176.2x+0.088，r=0.999 8；磷脂酰絲氨酸線性方程為：y=183.5x+0.032 9，r=0.999 6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿在質(zhì)量濃度在0.1～0.8 mg·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.4項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液中磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿質(zhì)量濃度均為0.4 mg·mL-1的溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定磷脂酰絲氨酸色譜峰和磷脂酰膽堿色譜峰的峰面積，RSD值分別為0.9%和1.3%。結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品按照2.2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，采用外標(biāo)法計(jì)算供試品含量。結(jié)果磷脂酰絲氨酸的平均含量為52.83%，RSD值為0.45%；磷脂酰膽堿的平均含量為2.37%，RSD值為0.86%。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.4項(xiàng)下對(duì)照溶液中磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿質(zhì)量濃度均為0.4 mg·mL-1的溶液，分別于0，2，4，6，8和10 h進(jìn)樣20 μL，測(cè)定不同時(shí)間磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿色譜峰峰面積，其RSD值分別為1.35%和1.53%。結(jié)果表明，磷酯酰絲氨酸和磷脂酰膽堿的三氯甲烷溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8檢測(cè)限與定量限 取穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿質(zhì)量濃度均為0.4 mg·mL-1的溶液適量，用三氯甲烷稀釋至待測(cè)組分峰高為基線噪音的3和10倍，記錄色譜圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿的檢測(cè)限分別為0.02和0.021 mg·mL-1,定量限分別為0.07和0.05 mg·mL-1。

2.9耐用性 在2.1項(xiàng)色譜條件下，選用不同的高效液相色譜儀和蒸發(fā)光檢測(cè)器(安捷倫1260液相色譜儀，Alltech ELSD 2000蒸發(fā)光檢測(cè)器)，流速選用0.9 mL·min-1；檢測(cè)器漂移管溫度：90 ℃；氣體流速：2.0 L·min-1；柱溫：30℃進(jìn)行測(cè)定，磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿色譜峰仍能達(dá)到有效分離，色譜峰分離度為3.2，溶劑無干擾，測(cè)定結(jié)果良好。

2.10加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一半成品(磷脂酰膽堿含量為2.37%，磷酯酰絲氨酸含量為52.83%)9份，置于25 mL量瓶中，依照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別加入磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸，按照低、中、高 3 個(gè)質(zhì)量濃度水平，進(jìn)行方法的準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)，加樣回收率為 91.9%～98.4%，測(cè)定RSD值均小于2.5%，該方法具有良好的準(zhǔn)確度。結(jié)果見表1和表2。

表1磷脂酰絲氨酸的加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of recovery of phosphatidylserine

取樣量/g樣品含量/mg對(duì)照品加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%0．00995．23744．25009．364697．1196．402．310．01005．29554．25009．395596．470．00965．04994．25009．214597．990．01065．59935．300010．804498．210．00975．12325．300010．234096．430．01075．64035．300010．582093．240．01105．80216．400012．100998．420．00985．20056．400011．082191．900．01055．54726．400011．809697．85

表2磷脂酰膽堿的加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of recovery of phosphatidyl cholines

取樣量/g樣品含量/mg對(duì)照品加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%0．11332．68402．00004．632497．4296．581．550．10872．57622．00004．459494．160．10522．49322．00004．461498．410．10472．48022．50004．906797．060．10932．59042．50005．045798．210．10242．42572．50004．819495．750．10332．44703．00005．336996．330．10162．40793．00005．239194．370．10522．49323．00005．418497．51

2.11樣品測(cè)定結(jié)果 分別精密吸取2.2項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL，依照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用外標(biāo)法分別計(jì)算磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿的含量，結(jié)果其平均含量分別為53.87%和2.15%。

3 討論

由于磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿極性較大、相對(duì)分子質(zhì)量大，選擇正相LiChrospher 100 Diol (100 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱進(jìn)行洗脫分離、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定。本文方法分離效果好、專屬性強(qiáng)，可準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)用磷脂酰膽堿合成磷脂酰絲氨酸過程，也可用于磷脂酰絲氨酸的質(zhì)量控制。

實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，由于溶劑選用三氯甲烷，故磷脂酰絲氨酸或磷脂酰膽堿中水分的大小對(duì)最終配制溶液的穩(wěn)定性影響較大，若磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿的水分含量超過3%時(shí)，選用三氯甲烷配制的溶液會(huì)明顯發(fā)生渾濁，在此狀態(tài)下，若放置時(shí)間稍長，溶液會(huì)發(fā)生沉降現(xiàn)象，若不重新?lián)u勻直接測(cè)定會(huì)發(fā)現(xiàn)含量有明顯降低。同時(shí)上述不澄清的溶液若通過濾膜濾過后，含量也會(huì)有明顯下降。通過查閱文獻(xiàn)，將溶劑更換為正己烷、異丙醇或不同比例的正己烷-異丙醇混合溶液，均有此現(xiàn)象產(chǎn)生，且最終溶液的狀態(tài)均沒有三氯甲烷作溶劑的溶液整體狀態(tài)好，故最終選擇三氯甲烷為溶劑。磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿進(jìn)行含量測(cè)定前，應(yīng)首先對(duì)其水分進(jìn)行控制。

參考文獻(xiàn)：

[1] Verhoven B, Schlegel R A, Williamson P.Mechanisms of phosphatidylserine exposure, a phagocyte recognition signal, on apoptotic T lymphocytes[J].J Exp Med，1995, 182：1597-1601.

[2] Kidd P M.Phosphatidylserine;membrane nutrient for memory.A clinical and mechanistic assessment[J].Altern Med Rev，1996, 1(2)：70-84.

[3] 劉平, 舒良.磷脂酰絲氨酸的藥理及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊(cè), 1991, 18(4)：207-210.

[4] 饒雪娥, 林偉鈴.磷脂酰絲氨酸的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué), 2015, 27(11)：9-11.

[5] 中華人民共和國衛(wèi)生部公告2010年第 15號(hào).關(guān)于批準(zhǔn)蔗糖聚酯、玉米低聚肽粉、磷脂酰絲氨酸等3種物品為新資源食品的公告[J].中國食品添加劑, 2010, 20(6)：232-233.

[6] 李閱兵, 劉承初, 謝晶, 等.磷脂酰絲氨酸的提取分離研究進(jìn)展[J].中國油脂, 2011,36(3)：56-61.

[7] 張芹, 孫兆敏, 徐杰, 等.酶法合成富含二十二碳六烯酸的磷脂酰絲氨酸[J].中國食品學(xué)報(bào), 2016, 16(3)：81-87.

[8] 胡飛, 段章群, 王淮, 等.生物酶法制備磷脂酰絲氨酸的研究進(jìn)展[J].中國油脂, 2012, 37(6)：54-58.

[9] 于榮華, 劉艷玲, 喬浩, 等.磷脂酰絲氨酸制備進(jìn)展[J].廣州化工, 2012, 40(18)：35-37.

[10]楊偉東.磷脂酶D催化合成磷脂酰絲氨酸的工藝研究[J].現(xiàn)代食品科技, 2010, 26(9)：994-996.

[11]杜陽吉.磷脂酶D單一水相法催化合成磷脂酰絲氨酸工藝研究[J].中國食品添加劑, 2015,25(1)：113-118.

[12]Chae M,Carman G M.Characterization of the yeast actin patch protein app1p phosphatidate phosphatase[J].J Biol Chem，2013, 288(9):6427-6437.

[13]Chen F, Zhao Q, Cai X, et al.Phosphatidylcholine in membrane ofEscherichiacolichanges bacterial antigenicity[J].Can J Microbiol，2009, 55：1328-1334.

[14]孫浩洋, 汪勇, 歐仕益.HPLC-ELSD法測(cè)定大豆磷脂中磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿含量[J].糧食與油脂,2015,(5)：25-27.

[15]Ioffe V,Kalendarev T,Rubinstein I，et al.Reverse phase HPLC for polar lipids．Simple and selective HPLC procedures for analysis of phospholipid-based derivatives of valproic acid and various nonsteroidal anti-inflammatory drugs[J].J Pharm Biomed Anal, 2002, 30：391-403.

[16]Xu L Y，Wang J H，Long T，et al.Isolation and purification of phosphatidylcholine from egg yolk by semi-preparative hydrophilic interaction liquid chromatography[J].J Liquid Chromatogr Related Technol,2014,38:765-768.

[17]玉娟, 韓春霞, 范慧紅.多烯磷脂酰膽堿混合原料中4種磷脂的分離及溶血磷脂酰膽堿含量測(cè)定[J].藥物分析雜志, 2009, 29(1)：70-72.

[18]王芮,郭華.HPLC-ELSD法測(cè)定含三七中成藥的皂苷成分的含量[J].西北藥學(xué)雜志, 2014,29(6):575-577.

[19]葉小敏, 田頌九, 李慧義,等.HPLC-ELSD測(cè)定豬肺表面活性物質(zhì)及其凍干粉中7種磷脂組分含量[J].中國藥學(xué)雜志, 2007, 42(12)：938-942.

[20]蘇永恒, 張偉, 馬青青.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定保健食品中的磷脂酰絲氨酸[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2017, 27(6)：792-794.

[21]趙璇, 李群, 劉興國, 等.ELSD和CAD測(cè)定多烯磷脂酰膽堿注射液中磷脂酰膽堿含量的方法比較[J].藥物分析雜志, 2014, 34(3)：529-533.

[22]石丹, 王曉彥, 魏顯綱, 等.高效液相色譜檢測(cè)奶粉中磷脂酰絲氨酸分析方法的建立[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào), 2015, 37(1)：88-92.

[23]曾令高.HPLC測(cè)定多烯磷脂酰膽堿膠囊中的溶血磷脂酰膽堿量[J].華西藥學(xué)雜志, 2010, 25(2)：215-216.

[24]楊俊, 謝俊.HPLC-ELSD測(cè)定多西他賽注射用濃溶液中溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰膽堿的含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2013, 30(11)：1210-1214.

[25]劉益慶, 李一, 戴銘駿.HPLC-ELSD法測(cè)定小兒氨酚烷胺顆粒中對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸金剛烷胺的含量[J].西北藥學(xué)雜志, 2017,32(2):158-160.

[26]陳華, 崔煥立, 張雷, 等.HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定依托咪酯乳狀注射液中磷脂酰膽堿與溶血磷脂酰膽堿[J].中國生化藥物雜志, 2016,36：15-18.