聚蘋果酸-阿霉素/多烯紫杉醇納米共聚物的制備及性質(zhì)研究

余 喆，周 青，喬友備，郭松巖，張 雨，吳 紅

(空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，西安 710032)

化療是治療癌癥的重要手段之一[1]，化療藥物通常為小分子藥物，難溶于水，生物利用度較低，尤其是非特異性毒性及多藥耐藥性等限制了其發(fā)展[2]。聚合物載體材料用于藥物的輸送可實(shí)現(xiàn)高效低毒地治療腫瘤[3-4]，藥物通過共價(jià)鍵與聚合物連接形成納米共聚物，可改善藥物水溶性并靶向腫瘤部位給藥，減少藥物在正常組織的蓄積。常用的聚合物載體主要有聚氨基酸類、聚酯類和多糖等，其中聚酯類是應(yīng)用最廣泛的載體材料，包括聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)和聚己內(nèi)酯(PCL)等，它們不溶于水，且可修飾基團(tuán)有限，僅有端基可供修飾，難以滿足藥物載體多功能修飾的要求。聚蘋果酸[poly (β-malic acid)，PMLA]是一種新型的脂肪族聚酯，在體內(nèi)可生物降解，水溶性好，且有許多懸掛羧基可供修飾，是一種優(yōu)于多糖和多肽類生物高分子的新型藥物載體。但PMLA作為藥物載體研究還處于起步階段，鮮見其他以PMLA為藥物載體的研究報(bào)道。

阿霉素(doxorubicin，DOX)與多烯紫杉醇(docetaxel，DTX)是臨床常見的化療小分子藥物，是治療乳腺癌的一線用藥[5-7]。DOX能干擾DNA合成期堿基對(duì)的配對(duì)，使S期細(xì)胞比例提高[8]；DTX為紫杉烷類藥物，主要抑制細(xì)胞分裂期，使細(xì)胞停滯在G2/M期，兩藥聯(lián)用產(chǎn)生序貫協(xié)同作用。阿霉素的分子結(jié)構(gòu)具有活性氨基，較易被聚合物通過共價(jià)鍵相連修飾成DOX前藥且保留了DOX的抗腫瘤活性[9]。早期研究表明，DTX的2′位C上所連羥基?；〈哂懈玫目鼓[瘤效果，且2′位C的單羥基取代比多羥基取代在生理?xiàng)l件下更易水解[10-11]。因此，本研究利用PMLA作為載體，采用“一鍋煮”法同時(shí)將DOX與DTX分別以酰胺鍵和酯鍵與PMLA連接，考察納米共聚物與游離藥物的細(xì)胞內(nèi)攝作用及對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，研究2種藥物的協(xié)同抗腫瘤作用。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Advance DMX500核磁共振波譜儀(德國(guó)Bruker公司)；THZ-C-1全溫振蕩器(太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；1260 Inifity Ⅱ高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；LGJ-10冷凍干燥機(jī)(美國(guó)SIM公司)；BIO-RAD 680酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)伯樂公司)；Tecnai Spirit 100KV透射電子顯微鏡(美國(guó)FEI公司)；DelsaTMNano C動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)；FluoView FV1000激光共聚焦顯微鏡(奧林巴斯(中國(guó))有限公司)。

1.2試藥 三氟乙酸酐(濟(jì)南萬(wàn)興達(dá)化工廠)；N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，均購(gòu)自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；鹽酸阿霉素(DOX·HCl)和多烯紫杉醇(DTX)，均購(gòu)自北京華奉聯(lián)博化學(xué)材料有限公司；透析袋購(gòu)自科昊生物工程有限公司；人肝臟組織蛋白酶B與豬肝酯酶均購(gòu)自美國(guó)西格瑪奧德里奇公司；細(xì)胞毒性活性試劑檢測(cè)盒CCK-8與4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購(gòu)自英國(guó)賽默飛世爾公司；人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)；其他化學(xué)試劑均由天津市富宇精細(xì)化工有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1PMLA-DOX/DTX的制備 采用課題組建立的方法合成載體PMLA[12-15]，以L-天冬氨酸為原料，通過氨基重氮化、酯化和陰離子開環(huán)聚合反應(yīng)，最后氫化得PMLA。得到的PMLA透析除去小相對(duì)分子質(zhì)量的聚合物，冷凍干燥待用。取116 mg干燥的PMLA(相對(duì)分子質(zhì)量9 kDa，含-COOH 1 mmol)、172.6 mg NHS(1.5 mmol)、191.7 mg EDC·HCl(1 mmol)和122.17 mg DMAP(1 mmol)溶于無水二甲基亞砜(DMSO)，抽真空反應(yīng)2 h。DOX·HCl與三乙胺(TEA)反應(yīng)過夜，得到游離DOX。同時(shí)將游離DOX(0.5 mmol)與DTX(0.5 mmol)加入PMLA反應(yīng)液，真空通N2保護(hù)，避光反應(yīng)24 h，透析凍干得180 mg PMLA-DOX/DTX，合成路線見圖1。

圖1PMLA-DOX/DTX的合成路線

Fig.1 The synthesis route of PMLA-DOX/DTX

2.2PMLA-DOX/DTX的結(jié)構(gòu)表征 取10 mg PMLA-DOX/DTX溶于氘代DMSO，核磁共振氫譜(1H-NMR)結(jié)果見圖2。2.95～3.02為主鏈上亞甲基質(zhì)子峰，5.39～5.41為主鏈上次甲基質(zhì)子峰。共聚物在7.0～8.0出現(xiàn)的苯環(huán)質(zhì)子峰來自藥物，證實(shí)兩藥共價(jià)連接于載體。

圖2PMLA-DOX/DTX的核磁共振氫譜

Fig.2 The1H-NMR spectroscopy of PMLA-DOX/DTX

2.3載藥率的測(cè)定 各取10 mg PMLA-DOX/DTX溶于透析袋內(nèi)，分別置于100 mL pH值為7.4與pH值為5.0 的PBS緩沖液中，模擬體內(nèi)環(huán)境，在pH值為7.4的緩沖液中加入豬肝酯酶(0.25 U)，pH值為5.0的緩沖液中加入組織蛋白酶B(300 U)，37 ℃，100 r·min-1攪拌。1 h后每隔一段時(shí)間吸取上述緩沖液各20 μL，直至對(duì)應(yīng)游離藥物的高效液相色譜峰峰面積不再增加，計(jì)算其藥物含量。DOX的色譜條件：十二烷基硫酸鈉溶液(取十二烷基硫酸鈉1.44 g和磷酸0.68 mL，加水500 mL使溶解)∶乙腈∶甲醇=500∶500∶60；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。DTX的色譜條件：流動(dòng)相：乙腈∶水=45∶55；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：227 nm。精密稱取10 mg DOX和DTX分別溶于10 mL流動(dòng)相中，配置成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的母液，根據(jù)母液準(zhǔn)確稀釋至100，75，50，25和10 μg·mL-1的梯度質(zhì)量濃度的DOX和DTX系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。濾膜過濾后，取20 μL進(jìn)樣記錄不同質(zhì)量濃度峰面積，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算緩沖液中游離藥物的質(zhì)量濃度。見圖3。由圖3可知，分別按照兩藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，按照共聚物中藥物的載藥率計(jì)算：

載藥率(%)=m藥物÷(m藥物+m聚合物)，得DOX的載藥率為21.5%±1.2%，DTX的載藥率為11.03%±1.51%。

圖3DOX(A)與DTX(B)的高效液相圖譜及對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.3 The HPLC chromatograms and the standard curve of DOX and DTX

2.4PMLA-DOX/DTX膠束的制備 稱取不同質(zhì)量的PMLA-DOX/DTX溶于去離子水中(終質(zhì)量濃度為2，1，0.5，0.1和0.05 mg·mL-1)，攪勻，各取1 mL，緩慢滴入20 mL DMSO，攪拌4 h，再移至相對(duì)分子質(zhì)量為7 kDa的透析袋中，用去離子水透析24 h，37 ℃下放置2 h，動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀測(cè)其水合粒徑。通過透射電子顯微鏡，觀察其形態(tài)與表面特征。不同質(zhì)量濃度的聚合物制備膠束時(shí)，質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的聚合物所制得的膠束均一性更好，粒徑在150 nm左右，多分散性指數(shù)為0.14，見圖4。

圖4PMLA-DOX/DTX膠束的粒徑與透射電鏡圖

Fig.4 The particle size and transmission electron microscope image of micelle

2.5體外釋藥 稱取10 mg PMLA-DOX/DTX溶于透析袋內(nèi)，分別以50 mL pH值為5.0和7.4的緩沖液為釋放介質(zhì)，在透析袋內(nèi)加入300 U的組織蛋白酶B與0.25 U的豬肝酯酶，37 ℃，100 r·min-1攪拌。分別在1，2，4，6，8，10，12，24，36，48 和72 h取出200 μL，同時(shí)補(bǔ)進(jìn)同體積的相應(yīng)緩沖溶液。用HPLC分別在波長(zhǎng)254與227 nm處測(cè)定，計(jì)算DOX與DTX的質(zhì)量濃度。共聚物體外釋藥曲線見圖5，由于酯鍵的水解較酰胺鍵的水解速度更快，DTX的釋放速率較快。在釋放前4 h內(nèi)，pH值為7.4的緩沖液中DOX與DTX的釋放率分別為8.5%與17.6%，而此后DOX的釋放速率逐漸降低，DTX一直保持較DOX快的釋放速率。上述釋放特點(diǎn)能在早期實(shí)現(xiàn)兩藥的序貫釋放和對(duì)腫瘤細(xì)胞的快速殺傷作用。

圖5PMLA-DOX/DTX在37℃PBS緩沖液中累積釋藥曲線

Fig.5 Theinvitroaccumulate release profile of PMLA-DOX/DTX in PBS buffer at 37 ℃

2.6細(xì)胞毒性研究 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231接種到96 孔板中，每孔1×104個(gè)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵育箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%，棄去原有培基，給藥總質(zhì)量濃度為1.5 μg·mL-1，檢測(cè)兩藥(DOX/DTX)在不同摩爾比(20∶1，10∶1，2∶1，1∶1，5∶1，1∶2，1∶7)時(shí)的細(xì)胞活性。每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔的吸光度值A(chǔ)，測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm，計(jì)算細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率計(jì)算公式：

見圖6。由圖6 B可知，兩藥(DOX/DTX)摩爾比為10∶1時(shí)，對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的協(xié)同效果最好。加入同摩爾比的PMLA-DOX/DTX(1，5，10，20和40 μg·mL-1)處理細(xì)胞48 h，各質(zhì)量濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白對(duì)照組計(jì)算半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)。由圖6 A可知，PMLA-DOX/DTX的IC50為9.21 μg·mL-1。

2.7細(xì)胞內(nèi)攝作用 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞接種至激光共聚焦培養(yǎng)皿，使細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞數(shù)為每毫升1×104個(gè)，鋪板完成后，置于37 ℃孵箱中培育24 h，待細(xì)胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)液，加入含藥培養(yǎng)基(DOX質(zhì)量濃度為1.3 μg·mL-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h使細(xì)胞充分?jǐn)z取藥物，固定染色，激光共聚焦觀察藥物入胞。用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞對(duì)不同藥物的攝取，見圖7。由圖7可知(紅色為DOX，藍(lán)色為細(xì)胞核染料DAPI)，4 h后所有樣品中均有DOX入細(xì)胞核。其中PMLA-DOX/DTX的阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度最高，說明該組藥物入胞最多。

圖6共聚物PMLA-DOX/DTX的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)

A.細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線；B.2種藥物不同比例對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的毒性作用。*P<0.05，**P<0.01。

Fig.6 The cytotoxicity of PMLA-DOX/DTX in MDA-MB-231

A.the growth-inhibitory curve of PMLA-DOX/DTX；B.the influence of different drug ratios on the cytotoxicity to MDA-MB-231 cells.*P<0.05,**P<0.01.

圖7激光共聚焦觀察PMLA-DOX/DTX的入胞(比例尺為50μm)

A.游離藥物DOX；B.PMLA-DOX；C.PMLA-DOX/DTX在37 ℃與MDA-MB-231細(xì)胞共孵育4 h。

Fig.7 Cell internalization of PMLA-DOX/DTX observed by confocal laser scanning microscopy (scale bar was 50 μm)

A.free DOX；B.PMLA-DOX；C.PMLA-DOX/DTX incubated with MDA-MB-231 cell for 4 h under 37 ℃.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選用PMLA作為載體，以“一鍋煮”法分別通過酰胺鍵與酯鍵連接DOX與DTX。DOX和DTX載藥率分別為21.5%±1.2%和11.03%±1.51%。進(jìn)一步考察2種藥物體外釋藥，組織蛋白酶B[16]是一種在腫瘤組織中高表達(dá)的水解酶，弱酸性環(huán)境中易被活化，可促進(jìn)DOX在酸性環(huán)境中的釋放。因此，DOX在組織蛋白酶B催化作用后，在pH值為5.0的釋放率增加，且釋放表現(xiàn)酸依賴性。相反，豬肝酯酶在pH值為7.4比pH值為5.0時(shí)活性更高，因而DTX在中性條件比酸性條件釋放更多。此法合成步驟簡(jiǎn)單，具有載藥率高、減少藥物泄露等優(yōu)點(diǎn)。Ma Y等[17]利用殼聚糖為載體，制備了2種藥物共載的聚合物膠束，先用酸敏鍵連接DOX，再與普朗尼克F127形成膠束物理包封紫杉醇。結(jié)果表明，多步反應(yīng)的載藥率最高僅為15.94%(阿霉素)與9.01%(紫杉醇)，且2種藥物的體外釋藥無明顯的酸依賴性。聚合物藥物共聚物透析法制備膠束，形成的納米粒為規(guī)整均一的球形，粒徑為150 nm，多分散性指數(shù)為0.14。根據(jù)多個(gè)納米研究團(tuán)隊(duì)對(duì)納米粒粒徑的研究[18-20]，納米粒(≥100 nm)具有長(zhǎng)循環(huán)特性，納米粒(≤50 nm)具有強(qiáng)的腫瘤組織穿透及滲透能力。說明納米共聚物制備成膠束具備體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)特性，并可通過腫瘤富集與滲透效應(yīng)實(shí)現(xiàn)在腫瘤組織中的高效富集。因此，PMLA作為載體材料既可多功能修飾也可制備成合適粒徑大小的納米粒。細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中聚合物藥物共聚物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制率和入胞明顯優(yōu)于游離藥物組，這是因?yàn)榫酆衔锼幬锕簿畚锔淖兞怂幬锶氚姆绞?，促進(jìn)了藥物入胞，提高了藥物的細(xì)胞毒性。

綜上所述，這種以聚合物載體連接多種藥物協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞的方式，既改善了藥物的水溶性，也有助于減少游離藥物的用量。本研究為構(gòu)建基于PMLA的聯(lián)合遞藥體系奠定了重要基礎(chǔ)。

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