紅蛇果接穗組織培養(yǎng)體系的建立

胡春宏 王婷婷 常蘋 季翔

摘要 [目的]建立紅蛇果接穗組織培養(yǎng)體系。[方法]于早春取紅蛇果接穗兩年生苗半木質(zhì)化莖段作為外植體，通過消毒、萌芽、增殖、生根過程建立組織培養(yǎng)體系。[結(jié)果]最適宜的萌芽培養(yǎng)基為MS+6-BA（1.0 mg/L）+IBA（0.1 mg/L），其萌芽率可達(dá)93.33%，添加PVP（0.5 g/L）和VC（100 mg/L）可以有效地防止褐化。將萌發(fā)后的芽轉(zhuǎn)入MS+6-BA（1.2～1.6 mg/L）中，可以進(jìn)行高效增殖的同時(shí)抑制玻璃化情況的發(fā)生，增殖倍率可以達(dá)3.79。最適宜紅蛇果接穗頂芽生根的培養(yǎng)基為1/2MS+IBA（1.0 mg/L），生根率為34.17%。[結(jié)論]該研究可為提供大量的紅蛇果組培苗以及之后的組培微嫁接提供技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 接穗；紅蛇果；組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào) S604+.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）01-0105-03

Abstract [Objective]To establish the tissue culture system of red delicious.[Method]Semi-woody stem segments from two-years red delicious seedlings were chosen as the explants in the early spring to establish the tissue culture system by sterilization，germination，multiplication and rooting process.[Result]The most suitable germination medium was MS+6-BA （1.0 mg/L） +IBA （0.1 mg/L） and the sprout rate can up to 93.33%.Adding PVP （0.5 g/L） and VC （100 mg/L） can effectively prevent browning.The germinated buds were transferred into MS+6-BA （1.2～1.6 mg/L） which could bring a highly efficient multiplication and inhibit the vitrification with a multiplication rate of 3.79.The most suitable rooting medium for the apical buds was 1/2MS+IBA（1.0 mg/L） and the rooting rate was 34.17%.[Conclusion]The study provided a technical basis for providing a large number of tissue culture seedling of red delicious and subsequent micrografts.

Key words Scion；Red delicious；Tissue culture

紅蛇果（Malus domestica “Red Delicious”）原產(chǎn)于美國，是世界上蘋果主要栽培品種之一，該品種最早于1880年在美國愛荷華州麥迪遜縣被培育成功。根據(jù)美國蘋果協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，該品種在美國是15個(gè)最受歡迎的蘋果品種之一。紅蛇果果實(shí)大小中等，總體呈圓錐形，頂大底小，霞紅色的果皮顏色以及耐貯藏的特性使得該品種在市場(chǎng)上很受歡迎。其果肉為黃白色，肉質(zhì)甜脆多汁，甘甜可口，含有果糖、葡萄糖、蔗糖以及多種維生素，其中果膠和鉀居水果類之首。國內(nèi)蛇果產(chǎn)地多為山東、 陜西，主要生產(chǎn)方式為嫁接，即選用健壯的紅蛇果接穗條嫁接于砧木之上，實(shí)現(xiàn)果樹的方便管理以及高產(chǎn)。

將紅蛇果接穗通過組織培養(yǎng)方式繁殖，可以在短時(shí)間內(nèi)得到大量的生長勢(shì)一致的組培苗，方便其商業(yè)化嫁接。目前國內(nèi)外對(duì)于紅蛇果接穗組織培養(yǎng)技術(shù)的研究較少。筆者通過大量試驗(yàn)研究，以期建立一個(gè)高效的可以商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的組培體系，為國內(nèi)市場(chǎng)提供大量的紅蛇果組培苗，同時(shí)為之后的組培微嫁接提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

紅蛇果接穗母本來自于江蘇無錫高科技農(nóng)業(yè)示范園區(qū)內(nèi)的試驗(yàn)苗圃。母本樹為已經(jīng)嫁接好的兩年生苗，在取材之前進(jìn)行適當(dāng)?shù)墓喔仁┓剩龠M(jìn)植株生長。

5—6月份春末夏初為最佳的取材時(shí)間，待當(dāng)年生枝條呈現(xiàn)半木質(zhì)化狀態(tài)時(shí)便可以采集外植體。于晴朗的午后，挑選生長健壯無病蟲害的母株，剪取植株頂端10 cm左右的枝條，封存于密封袋內(nèi)，避光貯藏在4 ℃冰箱，24 h后取出消毒。

1.2 外植體消毒 將剪取的枝條于流水下沖刷2 h，在超凈工作臺(tái)上將枝條分割為單節(jié)莖段，用75%乙醇溶液浸泡30 s，之后將頂芽和其他節(jié)段分別進(jìn)行消毒。頂芽采用20%消毒試劑（市售消毒試劑，有效成分為次氯酸鈉）消毒40 min，其他節(jié)段使用25%消毒試劑消毒40～50 min。消毒完成后，用無菌去離子水沖洗3次，最后一次使用添加300 mg/L的抗壞血酸溶液浸泡3 min，以最大程度地減少外植體的褐化[1]。培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境條件如下：光照強(qiáng)度為4 000～6 000 lx，光周期為16 h/d，溫度保持在（23±2）℃。

1.3 組培體系的建立

1.3.1 不定芽萌發(fā)。將消毒成功的外植體接種于不同的萌芽培養(yǎng)基上，每瓶接種1個(gè)莖段。所用的萌芽培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的6-BA和IBA，蔗糖濃度為30%，同時(shí)添加8%的瓊脂，保持培養(yǎng)基pH為5.8。由于蘋果外植體中含有的大量酚類物質(zhì)非常容易褐化，因此在培養(yǎng)基中均添加了一定濃度的防褐化試劑，防褐化試劑有活性炭（AC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）以及抗壞血酸（VC）[2-4]。所用的萌芽培養(yǎng)基如表1所示，每組合處理30瓶，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。將消毒后的外植體放置于9 ℃冰箱中避光存儲(chǔ)4～6 d可以有效地減輕褐化現(xiàn)象，之后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)植株的萌芽率。

1.3.2 腋芽增殖。

待芽萌發(fā)之后，挑選健壯無玻璃化的無菌芽，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。所用的增殖培養(yǎng)為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加不同質(zhì)量濃度的6-BA+瓊脂8 g/L+蔗糖30 g/L，培養(yǎng)基的pH 保持在5.8。不同試驗(yàn)組中添加的6-BA濃度為0.2、0.5、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/L。每個(gè)組合處理10瓶，每瓶放置12個(gè)無菌苗，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)增殖倍率（增殖后的株數(shù)/接種的株數(shù)）和生長狀況。

1.3.3 生根誘導(dǎo)。經(jīng)過30 d左右的增殖培養(yǎng)，挑選其中3 cm左右高、生長健壯無玻璃化的頂芽，將其底部的愈傷組織切除，切口為“V”形，插入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。在培養(yǎng)起初，將苗放置于30 ℃環(huán)境中暗培養(yǎng)7 d，之后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)瓶放置16個(gè)頂芽，每10個(gè)培養(yǎng)瓶為1組，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。培養(yǎng)室環(huán)境條件如下：光照強(qiáng)度為4 000～6 000 lx，光周期為16 h/d，溫度保持在（25±2） ℃。30 d后統(tǒng)計(jì)植株的生根率，生根率=生根頂芽數(shù)/接種頂芽數(shù)。所用的生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的IBA和活性炭（AC），不同生根培養(yǎng)基配方見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 不定芽萌發(fā)

起初將外植體放置于9 ℃壞境中暗培養(yǎng)一段時(shí)間，可以顯著減輕外植體的褐化情況，但是低溫培養(yǎng)在一定程度上也抑制了外植體的生理活性，因此紅蛇果接穗外植體所需萌芽時(shí)間較長，一般在20 d左右開始啟動(dòng)，通常頂芽最先萌發(fā)，接著是靠近培養(yǎng)基部分的腋芽開始啟動(dòng)，中間段的腋芽所需萌發(fā)時(shí)間最長。不同培養(yǎng)基中外植體萌發(fā)情況如表3所示。

由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，3種防褐化物質(zhì)均可以在一定程度上減輕植株的褐化程度。但在培養(yǎng)基中添加活性炭時(shí)，添加同等質(zhì)量濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑，植物的萌芽率普遍要低于添加VC作為防褐化劑的接穗。這可能是因?yàn)榛钚蕴繉?duì)于植物生長調(diào)節(jié)劑的吸附作用所致。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，后期挑選消毒不徹底的帶菌苗時(shí)，活性炭的存在使培養(yǎng)基變?yōu)楹谏?，很容易造成漏挑苗現(xiàn)象，從而導(dǎo)致帶菌苗在增殖階段大量繁殖，給組培生產(chǎn)帶來后續(xù)困難。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中一般不使用活性炭作為防褐化物質(zhì)。

當(dāng)使用VC和PVP作為防褐化物質(zhì)時(shí)，隨著培養(yǎng)基中6-BA濃度的增加，植株的萌芽率呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L的6-BA時(shí)，植株的萌芽率最高，可以達(dá)93.33%。但同時(shí)植株玻璃化的概率也逐漸增加，尤其是當(dāng)6-BA濃度增加到2.0 mg/L時(shí)，只有頂芽可以萌發(fā)，同時(shí)萌發(fā)出的新植株葉子大而透明，即使轉(zhuǎn)至增殖培養(yǎng)基中也不能繼續(xù)生長。而腋芽均被愈傷組織包裹，10～15 d即死亡。

綜上所述，最適宜紅蛇果接穗萌芽的培養(yǎng)基為6號(hào)培養(yǎng)基，即MS+6-BA（1.0 mg/L）+IBA（0.1 mg/L），在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)的外植體其萌芽率可以高達(dá)93.33%。在培養(yǎng)基中同時(shí)添加PVP（0.5 g/L）+VC（100 mg/L），可以有效防止外植體褐化，同時(shí)不會(huì)影響到培養(yǎng)基中激素的吸收。

2.2 不定芽增殖

一般植株轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基后7 d左右，沒入培養(yǎng)基的部分膨大，之后靠近基部的腋芽最先萌發(fā)，待20 d左右之后，部分上部的腋芽開始萌發(fā)。不同培養(yǎng)基中增殖情況如表4所示。

由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著6-BA 濃度的增加，增殖倍率也逐漸增加。當(dāng)6-BA濃度低于0.5 mg/L時(shí)，植株幾乎不增殖，同時(shí)長時(shí)間地放置于低濃度6-BA培養(yǎng)基中，會(huì)造成植株死亡。具體表現(xiàn)為植株下部的葉片開始發(fā)黃掉落，之后頂芽死亡，最后整株植物褐化死亡。而當(dāng)培養(yǎng)基中的6-BA 濃度大于1.6 mg/L時(shí)，隨著6-BA濃度的增加，植株玻璃化概率也隨之增加。具體表現(xiàn)為接種于培養(yǎng)基中的植株最先表現(xiàn)為玻璃化現(xiàn)象，之后萌發(fā)的腋芽也開始玻璃化，部分玻璃化植株不能繼續(xù)增殖，甚至?xí)贿^多的白色愈傷組織包裹而死亡。

因此，最適宜紅蛇果接穗增殖的培養(yǎng)基中6-BA濃度為1.2～1.6 mg/L。在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)的植株，其增殖倍率可以達(dá)3.79，同時(shí)植株健壯，長勢(shì)旺盛，玻璃化概率幾乎為0。

2.3 生根誘導(dǎo)

在沒有添加活性炭的培養(yǎng)基中，頂芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基15～20 d，基部首先長出乳黃色致密的愈傷組織，之后在此愈傷組織之上根系開始形成，一般為3～4條黃綠色粗壯的根系。而在添加活性炭的培養(yǎng)基中，愈傷組織可以被有效抑制，但根系形成所需的時(shí)間較長，一般需要25～30 d。同時(shí)，根白色細(xì)長，一般只有1～2條根系。不同培養(yǎng)基中紅蛇果接穗的生根率如圖1所示。

從圖1可以看出，在沒有添加活性炭的培養(yǎng)基中（1～4號(hào)），隨著IBA濃度的增加，頂芽底部的愈傷組織越來越多，生根率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在3號(hào)培養(yǎng)基中，頂芽的生根率達(dá)到最高（34.17%）。而當(dāng)培養(yǎng)基中IBA濃度繼續(xù)增加至1.5 mg/L時(shí)，生根率反而下降至30.83%，推測(cè)可能是由于過多的愈傷組織阻礙了根系的發(fā)生和生長。而在添加活性炭的培養(yǎng)基中，隨著IBA濃度的增加，生根率隨之上升，最高為添加2.0 mg/L IBA的8號(hào)培養(yǎng)基，生根率為22.08%。

3 討論

在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，紅蛇果接穗的組培苗在多次繼代之后很容易發(fā)生玻璃化的現(xiàn)象，尤其是夏季組培室內(nèi)的溫度不穩(wěn)定的時(shí)候。通過調(diào)高培養(yǎng)基內(nèi)瓊脂的濃度，將組培室的溫度降低2～3 ℃，降低培養(yǎng)基中6-BA 的濃度可以有效地抑制玻璃化苗的產(chǎn)生[5-7]。

隨著繼代次數(shù)的增加，組培苗對(duì)于培養(yǎng)基中的6-BA濃度逐漸適應(yīng)，同時(shí)體內(nèi)累積了大量的6-BA，如果一直在培養(yǎng)基中添加高濃度的6-BA容易造成組培苗畸形、玻璃化進(jìn)而影響后續(xù)的生根[8-9]。在實(shí)際生產(chǎn)中梯度性地降低培養(yǎng)基中6-BA 濃度可以有效地避免上述情況的發(fā)生，如每一個(gè)繼代周期降低培養(yǎng)基中1/3的6-BA濃度，直至將增殖情況穩(wěn)定為止。

生根過程中將組培苗放置于暗環(huán)境下培養(yǎng)5～7 d有利于根系的發(fā)生和生長。試驗(yàn)結(jié)果顯示，紅蛇果接穗的組培苗不太容易生根，最高的生根率僅為34.17%。因此，之后的研究方向主要為組培微嫁接。選擇合適的易于生根的蛇果砧木進(jìn)行組織培養(yǎng)，組培苗生根后于溫室進(jìn)行馴化移栽，小苗成活后將馴化好的無根紅蛇果接穗小苗直接嫁接于砧木之上，此種方法有利于生產(chǎn)出潔凈無菌的嫁接苗，同時(shí)可以簡化紅蛇果接穗的組培流程，省去生根步驟，提高組培苗的成活率同時(shí)縮短育苗周期[10-11]。

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