傳統(tǒng)海洋中藥淡菜高效液相（HPLC）指紋圖譜研究

龔曾豪 于春光 金艷霞 王燕 王斌

[摘要]指紋圖譜技術在傳統(tǒng)中藥材及其制劑的質量控制中應用較多，在種類鑒別和質量優(yōu)劣判斷方面具有重要作用。但是，指紋圖譜技術在傳統(tǒng)海洋中藥領域應用較少?；诖?，采用高效液相色譜法（HPLC），建立淡菜的HPLC指紋圖譜，并根據(jù)峰面積和保留時間標定了其中的13個共有峰。利用來自全國不同產(chǎn)區(qū)的24批供試品樣本驗證建立淡菜HPLC指紋圖譜的有效性，試驗結果證明利用10批供試品所建的HPLC指紋圖譜可以快速地區(qū)分不同種類的淡菜，聯(lián)合聚類分析，可對淡菜溯源提供技術支持。因此，淡菜高效液相（HPLC）指紋圖譜可為其物種鑒別和溯源提供技術支持，對其有效成分的分離和鑒別提供了科學依據(jù)，也為其他傳統(tǒng)海洋中藥的質量控制提供借鑒。

[關鍵詞]指紋圖譜；淡菜；高效液相色譜；聚類分析

[中圖分類號]R284 [文獻標識碼]A

傳統(tǒng)中藥材的產(chǎn)地來源與其品質和質量安全息息相關，建立健全的中藥材質量評價和溯源體系對保證中藥材質量安全至關重要。我國中藥材的質量控制分為兩個方面，依靠定性鑒別（性狀鑒別和顯微鑒別技術）確定樣品的真?zhèn)?，該方法需要鑒定者長期工作于第一線接觸實物，具備較強的實踐經(jīng)驗；而以化學物質基礎及其性質的理化鑒別評價中藥材的優(yōu)劣，重點監(jiān)測藥材復雜成分中的少數(shù)特定的“有效成分”，但是因為檢測的對象少，容易忽視不同化學成分之間的協(xié)同作用。目前，以化學成分為基礎的指紋圖譜技術廣受關注，被確認為傳統(tǒng)中藥材品種鑒定、質量控制和產(chǎn)地溯源的關鍵技術，而以指紋圖譜作為控制傳統(tǒng)中藥材品質的方法得到國際社會認可。目前，色譜技術（如高效液相色譜（HPLC）和波層色譜）、光譜技術（如紅外光譜和核磁共振）逐漸多樣化，且應用日益普遍，且各種儀器的性能和精密度和檢測能力日益增強，為指紋圖譜研究和應用奠定了良好基礎。高效液相（HPLC）指紋圖譜法不但可用特征峰做定性鑒別，還可以根據(jù)各峰的相對峰面積進行定量分析，是目前中藥化學成分指紋圖譜的主流方法。

淡菜為貽貝科動物肉的干制品，具有補肝腎，消癭瘤，益精血之功效，袁高峰等試驗證明其脂溶性成分具有較好的抗炎效果。我國從南至北各海域均產(chǎn)有貽貝，是世界上貽貝產(chǎn)量最高的國家，品種主要有翡翠貽貝（Perna viridis）、紫貽貝（Mytilus edulis）和厚殼貽貝（Mytilus coruscus），但是產(chǎn)地和品種不同致使貽貝質量參差不齊，加工成淡菜后品質不一。所以，利用指紋圖譜技術建立淡菜的質量評價和產(chǎn)地溯源技術對其產(chǎn)業(yè)發(fā)展意義重大?；诖?，本實驗以國內(nèi)不同區(qū)域的24批淡菜供試品為研究對象，利用高效液相色譜（HPLC）技術建立淡菜HPLC指紋圖譜，并結合聚類分析鑒別淡菜的產(chǎn)地。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗試劑與材料

色譜純乙腈和甲醇分別購于美國Fisher公司和Burdick & Jackson公司；無水乙醇、甲醇均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司，24批傳統(tǒng)藥食兩用海洋中藥淡菜供試品分別購于全國主要的貽貝產(chǎn)地，詳細信息見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品溶液的制備。參照孟志娟試驗方法，以無水乙醇為提取溶劑采用超聲提取法制備淡菜醇提物。具體操作流程如下：淡菜干燥、粉碎過40目篩，按照1 g/100 mL比例稱取0.7 g加入到盛有無水乙醇的圓底燒瓶中，密塞并稱重，用超聲波提取器在300 W功率下超聲提取30 min后，補足損失無水乙醇，利用旋轉蒸發(fā)儀去除提取物中的乙醇，然后加入色譜純甲醇，利用超聲溶解提取物，最后定容至5mL，微孔濾膜（0.45?m）除去溶液中的不溶性雜質，得供試品溶液。

1.2.2 HPLC實驗條件。色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18 （4.6 × 250 mm， 5μm）；檢測波長：210 nm；參比波長：360 nm；Agilent柱溫箱G1316A溫度：30 ℃；流速：1.0 mL/min；供試品自動進樣器G1313A進樣量：20 ?L；流動相：色譜純乙腈（A）-0.1%色譜純磷酸水（B）梯度洗脫，梯度程序如表2所示。

2 結果

2.1 海洋中藥淡菜參考指紋圖譜的建立

根據(jù)1.2.1的方法制備S1、S2、S3、S4、S5、S6、S8、S9、S11和S12等10批淡菜供試品的溶液，按照試驗方法1.2.2所描述的HPLC色譜條件分別將10批淡菜供試品的溶液加入到HPLC中，獲得相關色譜數(shù)據(jù)，以AIA格式將所得到的供試品HPLC圖譜數(shù)據(jù)（保留時間和峰面積等）依次導入國家藥典委員會推薦的數(shù)據(jù)處理軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版），對相關數(shù)據(jù)進行比對和分析，以淡菜供試品S1（大連夏方水產(chǎn)有限公司）的HPLC色譜圖為參照譜圖進行指紋匹配，建立S1、S2、S3、S4、S5、S6、S8、S9、S11和S12等10批淡菜供試品的對照指紋圖譜共有模式，結果如圖1中的R色譜圖所示。根據(jù)對照指紋圖譜共有模式中各個色譜峰的峰面積及穩(wěn)定性，確定其中的13個峰為共有峰（見圖2），共有峰面積之和占總峰面積的90%以上，符合高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜的標準。

基于峰面積和相對保留時間的相似度分析是建立傳統(tǒng)中藥材供試參考指紋圖譜的主要途徑，也是樣品間比較分析的報告重要依據(jù)。因此，本實驗根據(jù)10批淡菜供試品（S1、S2、S3、S4、S5、S6、S8、S9、S11、S12）的HPLC圖譜的峰面積和相對保留時間信息，利用國家藥典委員會推薦的數(shù)據(jù)處理軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版），計算與對照指紋圖譜的相似度，結果如由表3所示。供試品S2的HPLC圖譜與對照指紋圖譜的相似度最高，而供試品S6的HPLC圖譜與對照指紋圖譜的相似度最低。因此，確定供試品S2的圖譜作為淡菜的HPLC參考指紋圖譜（見圖2）。

2.2 高效液相色譜（HPLC）特征峰的確定及淡菜供試品真?zhèn)舞b別

特征峰是代表檢測樣品特征屬性的化學成分在色譜圖上的體現(xiàn)，具有特定保留時間，并且與其他化學成分的峰面積具有相對固定的比值。由圖1和圖2相關信息表明，色譜峰P4、P6、P8、P9和P10的分離度比較好，特征明顯，可以代表本實驗所檢測的淡菜樣品的指紋特征。因此，選擇5個主要共有峰（P4、P6、P8、P9和P10）為淡菜指紋圖譜的特征峰。其中特征峰P6的峰面積較大，與其他色譜峰比較具有明顯優(yōu)勢，而且其出峰時間處于高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜的中間，易于和其它峰進行比較分析，確定其為色譜圖的參照峰。

利用HPLC建立的中藥材的指紋圖譜，特別是其中的特征信息（特征峰的相對保留時間參數(shù)）可以專一的體現(xiàn)所檢測中藥材的特性。因此，利用指紋圖譜進行中藥材的真?zhèn)魏蛢?yōu)劣鑒別是其建立的重要目的。因此，將淡菜高效液相色譜（HPLC）參考指紋圖譜參照峰（P6號峰）的相對保留時間（RRT）定為1，計算試驗所檢測的10批淡菜供試品指紋圖譜剩余4個特征峰的相對保留時間（RRT），結果見表4。取剩余未進行分析的14批淡菜供試品進行分析，其色譜圖見圖3。與圖2比較分析表明：淡菜高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜的5個特征峰均存在于剩余的采集于全國主要產(chǎn)區(qū)的14批淡菜供試品；與前10批樣品的特征峰的相對保留時間（RRT）平均值進行比較，結果表明剩余的采集于全國主要產(chǎn)區(qū)的14批淡菜供試品各特征峰相對保留時間（RRT）與之吻合度良好，證明剩余的采集于全國主要產(chǎn)區(qū)的14批供試品均非偽品。

2.3 淡菜供試品的產(chǎn)地鑒別

以淡菜供試品指紋圖譜中6號峰為參照峰，相對峰面積定為1，計算24批淡菜供試品指紋圖譜13個共有峰的相對峰面積，并以13個共有峰的相對峰面積為指標，將24批不同產(chǎn)地的淡菜供試品的共有峰相對峰面積導入SPSS19.0進行聚類分析，結果見圖4。

圖4中橫坐標代表采集于全國主要產(chǎn)區(qū)的24批淡菜供試品之間的距離，縱坐標代表全國主要產(chǎn)區(qū)的24批淡菜供試品的編號。由圖4可知，除供試品S7（煙臺龍潤食品有限公司）、S10（青島福興祥物流股份有限公司）、S21（煙臺、散裝）外，相同產(chǎn)地的淡菜供試品均聚集為相同的類群。該研究結果也表明產(chǎn)地不同導致淡菜供試品在化學組成上存在一定差異，而HPLC指紋圖譜輔以聚類分析能較好地反映出供試品與產(chǎn)地之間的關系。

3 結論

本文以10批傳統(tǒng)藥食兩用海洋中藥淡菜為供試品，建立淡菜的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，指紋圖譜中包含了13個共有峰。應用國家藥典委員會推薦的數(shù)據(jù)處理軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版）進行相似度計算，結果表明10批傳統(tǒng)藥食兩用海洋中藥淡菜樣本指紋圖譜具有良好的相似度，達到了建立中藥材高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜要求。在此基礎上，對24批供試品進行了聚類分析（clustering analysis），結果表明采集于全國主要產(chǎn)區(qū)的24批淡菜供試品基本能根據(jù)樣品來源聚集成同一類群。因此，HPLC指紋圖譜能夠較好的對淡菜進行品種和產(chǎn)地鑒別，為海洋中藥質量標準的建立及溯源技術研究提供了技術支持。

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