不同培養(yǎng)條件對金線蓮多糖含量的影響

施滿容

摘要：以金線蓮試管苗為材料，MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖25 g/L為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用SPSS正交設(shè)計試驗，研究不同添加物、不同瓶子規(guī)格、不同光質(zhì)等對金線蓮試管苗生長過程中多糖含量積累的影響。結(jié)果表明，影響金線蓮多糖含量的順序為光質(zhì)>添加物>瓶子規(guī)格。添加物中香蕉泥的均值最大為0.291，并且香蕉泥與蘋果汁和胡蘿卜汁之間具有顯著性差異（P<0.05）。光質(zhì)中藍光的均值最大為0.289，并且藍光與白光和紅光之間具有顯著性差異（P<0.05）。瓶子規(guī)格中6.5 cm的均值最大為0.279，與8.0 cm瓶子對比有顯著性差異（P<0.05），與9.0 cm瓶子對比沒有顯著性差異（P>0.05）。優(yōu)化后金線蓮多糖含量累積的培養(yǎng)條件為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖25 g/L+香蕉泥（pH 5.8）50 g/L+6.5 cm培養(yǎng)瓶+藍光。

關(guān)鍵詞：金線蓮；組織培養(yǎng)；多糖含量

中圖分類號：S567 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）04-0113-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.04.029

Effects of Different Culture Conditions on Polysaccharide Contents

in Anoectochilus roxburghii

SHI Man-rong

（Ningde Vocational and Technical College，F(xiàn)uan 355000，F(xiàn)ujian，China）

Abstract： The in vitro plantlets were used as the materials，and MS+3.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+7 g/L agar+25 g/L glucose was used as the basal medium for studying the effects of organic additives， bottle sizes and light qualities on the accumulation of polysaccharide content during the growth of in vitro plantlets by the L9（34） orthogonal experimental design during in Anoectochilus roxburghii. The results showed that the order of polysaccharide content was light quality>additive>bottle size. The average value of banana mud in the additive was 0.291，and there was a significant difference between banana mud and apple juice and carrot juice（P<0.05）. The mean value of blue light in the light mass is 0.289， and there is a significant difference between blue light and white and red light （P<0.05）. The mean value of 6.5 cm in the bottle size was 0.279，which was significantly different from that of the 8.0 cm bottle（P<0.05），and there was no significant difference（P>0.05）. Consolidated results showed that the best culture conditions for the accumulation of polysaccharide content was MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+7 g/L agar+25 g/L glucose+50 g/L banana（pH 5.8） in the culture bottle with 6.5 cm diameter in the blue light.

Key words： Anoectochilus roxburghii； tissue culture； polysaccharide contents

金線蘭[Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.]俗稱金線蓮，為單子葉植物綱蘭科開唇蘭屬植物，在中國福建、臺灣等省和東南亞地區(qū)被視為珍稀名貴藥材，享有“藥王”“金草”“鳥人參”“神藥”等美稱[1]。金線蓮中含有豐富的多糖，是其藥用成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、增強免疫功能等作用[2]，是一種天然抗氧化劑。福建省金線蓮產(chǎn)業(yè)規(guī)模持續(xù)快速擴大，已經(jīng)成為福建省特色中草藥產(chǎn)業(yè)之一。市場上的金線蓮產(chǎn)品多數(shù)是采用組織培養(yǎng)技術(shù)進行種苗生產(chǎn)，由于組織培養(yǎng)條件和后期大田種植管理的差異，對金線蓮有效成分積累產(chǎn)生很大的影響。目前，市場上還沒有形成一套完整的適用于金線蓮生產(chǎn)的質(zhì)量標準，難以對金線蓮有效藥用成分和品質(zhì)進行控制，導(dǎo)致市場上的金線蓮產(chǎn)品參差不齊。

金線蓮多糖含量是金線蓮產(chǎn)品質(zhì)量標準的重要控制成分，不同培養(yǎng)條件會影響金線蓮多糖含量變化。如黃瑞平等[3]通過對不同組培苗0和4月齡的金線蓮進行多糖和總黃酮含量的測定，結(jié)果表明，總黃酮含量隨著金線蓮栽培月齡的增加而上升，多糖含量則隨著金線蓮栽培月齡的增加而降低。楊翠芹等[4]研究表明，在4%的蔗糖濃度下對金線蓮多糖積累最有利；隨繼代天數(shù)的延長，多糖含量表現(xiàn)出先減少后增加的趨勢。牛蓓等[5]在同一光照度和幾種不同溫度下對金線蓮進行處理，結(jié)果顯示金線蓮多糖含量在25 ℃時最大，35 ℃時最小。為了研究影響金線蓮多糖含量變化的因素，本試驗在原有試驗配方確定的基礎(chǔ)上，采用天然添加物、光質(zhì)、瓶子規(guī)格3個因素進行正交設(shè)計試驗，旨在探索最有利于金線蓮組織培養(yǎng)過程中多糖含量積累的有效培養(yǎng)條件，為生產(chǎn)上提高金線蓮多糖含量提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為福建金線蓮組培苗，MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，25 g/L蔗糖為碳源，7 g/L瓊脂為凝固劑，pH 5.8，添加6-BA 3.0 mg/L、NAA 0.3 mg/L作為繼代培養(yǎng)基，對金線蓮試管苗進行擴繁。

1.2 試驗方案

根據(jù)正交試驗設(shè)計L9（34）（表1）得到的9個處理進行試驗[6]，以MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+7 g/L瓊脂+25 g/L蔗糖為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每處理接種5瓶，每瓶接6個帶2個芽的金線蓮莖段，每處理重復(fù)3次。培養(yǎng)溫度25±2 ℃，光照度2 000 lx，光照時間12 h/d。培養(yǎng)60 d時，利用苯酚-硫酸法測多糖含量。采用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件進行分析，優(yōu)選出有利于金線蓮多糖積累最佳試驗因素組合。

1.3 多糖含量的測定

1.3.1 標準曲線的制作 稱取葡萄糖25 mg，置于250 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，配制成0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液，由葡萄糖標準溶液稀釋成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 mg/mL的濃度，終體積為1.0 mL。取一支試管加入1.0 mL的去離子水作為空白對照管。在各個試管中分別加入5%苯酚液1 mL、5 mL濃硫酸，振蕩搖勻后放置5 min，再置沸水浴中15 min，取出后冷卻至室溫。以空白對照管液體為對照調(diào)0。在最大吸收波長490 nm處測定吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到回歸方程y=1.408 9x-0.036 8，R2=0.993 7，制作標準曲線見圖1。

1.3.2 多糖樣品溶液的制備 多糖樣品溶液制備參照王學(xué)奎[7]、林麗清等[8]、楊翠芹等[4]報道的苯酚-硫酸法。分別稱取烘干至恒重的金線蓮干粉0.025 g，加去離子水25 mL，于沸水中靜置提取3 h。提取后于4 000 r/min離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液5 mL置于新的離心管中，在濾液中加入80%的乙醇，放置在 4 ℃冰箱中過夜，棄上清液，得白色沉淀物。再將移出的液體進行離心，離心后用移液槍將上清液體移走，留下白色沉淀物，用3 mL 80%的乙醇將此次沉淀洗入上一次沉淀中，用去離子水將沉淀溶解定容至10 mL，得到粗多糖樣品溶液。

將制得的多糖樣品溶液各取1 mL移入20 mL試管中，步驟同“1.3.1”中以0號空白對照管液體為對照空白調(diào)0。重復(fù)3次，在490 nm處測得吸光度。以轉(zhuǎn)換系數(shù)0.9校正多糖含量，根據(jù)公式計算多糖含量。多糖含量=（C×0.9×Vr×N/W×Vs×1 000）×100%，式中，C：從標準曲線查得的糖量（mg）；0.9：葡萄糖轉(zhuǎn)化系數(shù)；Vr：提取液體積（mL）；N：稀釋倍數(shù)；W：測定時取用的樣品重量（g）；Vs：測得時取用的樣品體積（mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對金線蓮試管苗多糖含量影響

正交試驗得到的9個金線蓮樣品，進行多糖含量測定，3次重復(fù)，結(jié)果見表2。

運用SPSS軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行分析[9，10]，表3為方差齊次性檢驗的結(jié)果，從顯著性概率來看，P>0.05，說明各組方差在α=0.05水平?jīng)]有顯著性差異，也就說明了方差具有齊次性。

根據(jù)試驗結(jié)果進行主體間效應(yīng)分析，結(jié)果（表4）表明，在α=0.05水平上，添加物、瓶子規(guī)格、光質(zhì)這3種不同因素的培養(yǎng)條件對金線蓮多糖含量的積累具有極顯著性差異。比較3個因素的F值可以看出，影響金線蓮多糖含量的因素順序為光質(zhì)>添加物>瓶子規(guī)格。光質(zhì)對金線蓮試管苗多糖含量影響表現(xiàn)最為明顯。

2.2 不同添加物對金線蓮試管苗多糖含量影響

不同添加物對金線蓮多糖含量測定結(jié)果運用SPSS軟件分析，同時選擇具有齊次性的LSD法進行檢驗，結(jié)果見表5、表6。綜合表5和表6可以看出，添加物中香蕉泥的均值最大為0.291，其次蘋果汁，胡蘿卜汁表現(xiàn)最差，香蕉泥與蘋果汁和胡蘿卜汁之間具有顯著性差異（P<0.05）。說明選擇香蕉泥作添加物對金線蓮多糖積累有利，同時與蘋果汁和胡蘿卜汁之間差異顯著。

試驗過程中發(fā)現(xiàn)，在白光下培養(yǎng)的含有胡蘿卜汁添加物的金線蓮繼代苗全部都會引起莖段下端褐化現(xiàn)象，而添加胡蘿卜汁的金線蓮在藍光和紅光下培養(yǎng)則不發(fā)生褐化現(xiàn)象。這說明金線蓮組培中胡蘿卜汁可能不是理想的添加物，特別不適合在白光下培養(yǎng)。

2.3 不同光質(zhì)對金線蓮試管苗多糖含量影響

不同光質(zhì)處理金線蓮組培苗多糖含量測定結(jié)果運用SPSS軟件分析，同時選擇具有齊次性的LSD法進行檢驗，結(jié)果見表7、表8。綜合表7和表8可以看出，不同光處理后對金線蓮多糖均值影響大小順序為藍光>白光>紅光，光質(zhì)中藍光的均值最大為0.289，并且藍光與白光和紅光之間具有顯著性差異（P<0.05）。數(shù)據(jù)分析表明，藍光最有利于金線蓮多糖含量積累。在培養(yǎng)過程發(fā)現(xiàn)，藍光下培養(yǎng)的金線蓮比較矮壯，白光下培養(yǎng)的金線蓮葉面積比較大，紅光下培養(yǎng)的金線蓮較為細長，并且葉子邊緣有白化現(xiàn)象出現(xiàn)。外部形態(tài)特征也表現(xiàn)藍光最有利于金線蓮苗健壯生長。

2.4 不同規(guī)格瓶子對金線蓮試管苗多糖含量影響

不同規(guī)格瓶子培養(yǎng)的金線蓮苗多糖含量測定結(jié)果運用SPSS軟件分析，通過齊次性的LSD法進行檢驗，結(jié)果見表9、表10。綜合表9和表10可以看出，采用不同大小瓶子培養(yǎng)金線蓮苗，經(jīng)金線蓮多糖測定，對均值影響大小順序為6.5 cm>9.0 cm>8.0 cm，瓶子規(guī)格中6.5 cm的均值最大為0.279，6.5 cm瓶子與8.0 cm瓶子對比有顯著性差異（P<0.05），但是6.5 cm規(guī)格瓶子與9.0 cm瓶子對比沒有顯著性差異（P>0.05），表明6.5 cm規(guī)格的瓶子與9.0 cm的瓶子對金線蓮多糖含量積累的促進作用相似，綜合考慮各因素，選擇直徑為6.5 cm的瓶子更有利于提高經(jīng)濟效益。6.5 cm規(guī)格的瓶子可以節(jié)省培養(yǎng)基用量，同時也可充分利用培養(yǎng)架空間等優(yōu)勢。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同添加物對金線蓮試管苗多糖積累效應(yīng)不同

香蕉泥、蘋果汁、胡蘿卜汁、番茄汁、椰乳、馬鈴薯汁等是植物組織培養(yǎng)中常用的天然有機添加物[11]。這些常用的有機添加物都是一些成分較為復(fù)雜的天然復(fù)合物[12]，含有氨基酸、酶、生長調(diào)節(jié)劑等一些化學(xué)成分不明的有機物，其營養(yǎng)豐富，但不穩(wěn)定，主要作用是為植物生長提供一些生理活性物質(zhì)，補充一些未知的微量成分[13]。本試驗通過對比分析發(fā)現(xiàn)，香蕉泥對金線蓮多糖合成具有顯著促進效應(yīng)，而胡蘿卜汁與蘋果汁則對金線蓮多糖的積累未起到明顯作用，這可能是香蕉泥對pH具有較大的緩沖作用，并富含一些微量營養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)劑等[14]對多糖的合成有促進作用，具體是什么物質(zhì)尚未見相關(guān)報告。而蘋果汁與胡蘿卜汁可能不含或較少含有此類促進多糖合成的物質(zhì)或含有的天然有機物質(zhì)經(jīng)高壓滅菌而變性，從而失去效果[15]。白光下含有胡蘿卜汁培養(yǎng)基的金線蓮出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，影響金線蓮的生長。推測可能胡蘿卜汁中富含的某些多酚物質(zhì)，在白光下更容易氧化褐變，在藍光和紅光中培養(yǎng)的添加胡蘿卜汁的金線蓮則不發(fā)生褐化現(xiàn)象。一般出現(xiàn)褐化的原因有光照、溫度、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)時間、遺傳因素等[16]，具體的影響因素還需后面進行試驗觀察探究。

3.2 藍光最有利于金線蓮試管苗多糖的積累

光質(zhì)處理可以影響藥用植物有效成分的含量。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，藍色光質(zhì)對生物堿、黃酮、糖苷、萜類內(nèi)酯等次生代謝物質(zhì)有影響。如藍色光質(zhì)對長春花愈傷組織細胞核生物堿[17]和喜樹幼苗葉片中喜樹堿[18]積累有明顯的促進作用；能促進水母雪蓮愈傷組織中黃酮物質(zhì)的合成[19]；有利于毛地黃葉組織培養(yǎng)物中強心苷[20]和白樺愈傷組織三萜[21]含量的積累。朱旭丹等[22]研究不同光質(zhì)對布朗葡萄藻生長、有機物質(zhì)積累的影響，結(jié)果是白光下布朗葡萄藻多糖含量最高。高亭亭等[23]研究發(fā)現(xiàn)不同光質(zhì)對鐵皮石斛種苗和有效成分均有極顯著的影響，紅光有利于種苗根系與苗高生長，藍光有利于種苗增粗與生物堿積累，紅藍混和光有利于葉綠素與多糖含量增加。郝俊江[24]等通過研究不同光質(zhì)對靈芝生長發(fā)育和靈芝多糖含量的影響，表明藍色光質(zhì)處理可以提高靈芝多糖含量。本試驗結(jié)果表明，藍光最有利于金線蓮多糖的積累，紅光與白光則對金線蓮多糖積累的影響不大。該結(jié)果與朱旭丹等[22]的研究情況不同，與高亭亭等[23]和郝俊江等[24]的研究結(jié)果有相似之處，可能是藍光處理會促進金線蓮對光波的吸收，一定程度上提高光合作用，從而更有利于光合產(chǎn)物多糖的積累。綜合試驗的3個因素，表明光質(zhì)對金線蓮多糖的影響最大。

3.3 瓶子規(guī)格對金線蓮多糖積累有影響

在組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)容器中的氣體成分及含量影響培養(yǎng)物的生長和分化。組織培養(yǎng)的植物主要通過呼吸作用、物質(zhì)轉(zhuǎn)換、能量代謝來實現(xiàn)正常生長，組培苗的綠色組織也會進行光合作用，但光合能力弱，主要是利用培養(yǎng)基中的糖作為碳源進行異養(yǎng)生長[25]。因此，普遍采用氣密性小容器作為組培容器，進行傳統(tǒng)的小型容器有糖培養(yǎng)[26]。試驗結(jié)果表明，6.5 cm規(guī)格的培養(yǎng)瓶對金線蓮的多糖的合成具有顯著促進作用，9.0 cm規(guī)格的培養(yǎng)瓶，對金線蓮多糖合成也有一定的促進作用，8.0 cm的瓶子規(guī)格則對金線蓮多糖合成沒有明顯的促進作用。綜合衡量培養(yǎng)基用量、接種數(shù)、污染率、培養(yǎng)架上擺放數(shù)等各方面因素，認為6.5 cm規(guī)格的培養(yǎng)瓶更有優(yōu)勢。容器內(nèi)空氣環(huán)境因子主要有光照、溫度、濕度、CO2濃度、O2濃度、乙烯含量[27]。不同規(guī)格瓶子的瓶內(nèi)空氣、環(huán)境因子存在一定差異，對金線蓮多糖物質(zhì)的合成具有明顯的影響，其具體影響機理目前還不清楚。因此在金線蓮培養(yǎng)過程中，可以充分考慮使用合適大小的組培瓶，有利于提高金線蓮產(chǎn)品的藥用價值和保健價值。

綜上所述，在MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+7 g/L瓊脂+25 g/L蔗糖，pH 5.8，培養(yǎng)溫度25±2 ℃，光照度2 000 lx，光照時間12 h/d的同等條件下，使用直徑為6.5 cm培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)基中添加50 g/L香蕉泥，采用藍光照射最有利于促進金線蓮組培苗多糖含量的積累。

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