納米氧化鋯沉積棉花纖維的制備及其在磷酸化多肽快速富集中的應(yīng)用

余瓊衛(wèi),　方凱敏,　何小梅,　鄭　杰,　馮鈺锜(生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院, 湖北 武漢 430072)

蛋白質(zhì)的磷酸化是一種重要的可逆性翻譯后修飾,參與諸多生理調(diào)控過程[1]。一般采用電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)或基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜(MALDI-MS)對(duì)磷酸化蛋白的酶解產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),用于研究磷酸化的豐度、位點(diǎn)等。但是,由于磷酸化多肽在體內(nèi)含量低,且所處基質(zhì)復(fù)雜,難以直接進(jìn)行質(zhì)譜分析檢測(cè)。因此,在質(zhì)譜分析前,需對(duì)其進(jìn)行純化和富集[2,3]。目前應(yīng)用最廣泛的磷酸化多肽的富集方法主要是固載金屬親和色譜法[4-9]和金屬氧化物親和色譜法[10-15]。其中,金屬氧化物親和色譜法中已有多種金屬氧化物(如TiO2、ZrO2、Al2O3等)被開發(fā)應(yīng)用于磷酸化多肽的富集,但是由于金屬氧化物表面性質(zhì)的差異,它們對(duì)磷酸化多肽的選擇性存在較大的差別[16,17],如ZrO2和TiO2, Zr和Ti在晶體中的配位數(shù)不同會(huì)導(dǎo)致它們對(duì)磷酸化多肽不一樣的結(jié)合能力;不僅如此,采用不同方法制備得到的不同晶型的同種類型金屬氧化物對(duì)磷酸化多肽也會(huì)有不同的選擇性[18]。因此,磷酸化多肽預(yù)富集新方法及富集材料的開發(fā)一直是磷酸化蛋白質(zhì)組研究的重要課題,具有重要意義。

液相沉積法(liquid phase deposition,簡(jiǎn)稱LPD)是濕化學(xué)法中發(fā)展起來的一種全新的成膜方法[19,20],該方法為向金屬氟代絡(luò)離子([MFn]m-n,m為金屬M(fèi)離子的價(jià)態(tài),n為F原子個(gè)數(shù))中添加反應(yīng)物水,其基本原理可用以下反應(yīng)式表示:

同時(shí)加入它們的反應(yīng)產(chǎn)物HF的消耗劑硼酸(H3BO3)或金屬鋁使金屬氧化物薄膜沉積在基質(zhì)表面。該方法操作簡(jiǎn)單、不受基底形狀限制、制備過程中不需要熱處理,并且不需要昂貴的設(shè)備,它是專為制備氧化物薄膜而發(fā)展起來的,因此被廣泛應(yīng)用于催化材料或電極材料等材料中功能性氧化物薄膜的制備。

基于LPD的特點(diǎn),本課題組將該方法應(yīng)用于分離介質(zhì)材料的制備中[11,14,20-23],目前我們已采用LPD分別在毛細(xì)管和硅膠基質(zhì)上沉積了納米氧化鈦、納米氧化硅及納米氧化鎳等多種納米氧化物涂層材料,目前還未見采用LPD制備的納米氧化鋯涂層應(yīng)用于分離科學(xué)領(lǐng)域中的報(bào)道。

棉花作為一種豐富的天然生物材料,具有廉價(jià)、生物相容性好、穩(wěn)定性好等特點(diǎn),近年來被引入到分離科學(xué)領(lǐng)域,本課題組將進(jìn)行功能化修飾后的棉花應(yīng)用于一種微型化的SPE裝置,即將功能化的棉花填裝于注射器內(nèi)或者移液槍的吸頭中,從而對(duì)待分析物進(jìn)行快速萃取[24-29]。因棉花的表面含有大量的羥基,可以作為液相沉積的基底。本工作采用液相沉積法制備了納米氧化鋯沉積棉花纖維(ZrO2-CF)材料,對(duì)材料進(jìn)行了表征,并將其應(yīng)用于磷酸化多肽的選擇性富集。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器、試劑與材料

冷凍離心濃縮儀(美國(guó)Labconco公司), 掃描電鏡(Quanta 200，荷蘭FEI公司)及其附帶的能量色散型光譜儀(EDAX GENSIS, 美國(guó)Ametek公司)。Axima TOF型MALDI-TOF MS儀(日本Shimadzu公司)。

磷酸(H3PO4)、三氟乙酸(TFA)、2,5-二羥基苯甲酸(2,5-DHB)、β-酪蛋白(β-casein)、牛血清白蛋白(BSA)、碘乙酰胺(IAA)、二硫蘇糖醇(DTT)、胰蛋白酶等購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。氟鋯酸(H2ZrF6)購(gòu)自阿拉丁公司。鋁片購(gòu)自國(guó)材科技有限公司。分析純氨水、乙酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)有限公司。脫脂棉花購(gòu)買于徐州衛(wèi)材有限公司。純水使用Millipore公司的Milli-Q裝置(Bedford,美國(guó))制備得到。脫脂牛奶購(gòu)于武漢大學(xué)自強(qiáng)超市。血清是來自武漢大學(xué)校總醫(yī)院健康人的血清,存放在-80 ℃冰箱中,備用。

1.2　二氧化鋯涂覆脫脂棉花(ZrO2-CF)的制備

在裝有75 mL二次水的100 mL的塑料燒杯中裝入約2 g棉花,1片16 cm2的鋁片,然后加入2 mL的H2ZrF6(45%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)),磁力攪拌沉積3天,讓納米氧化鋯均勻地沉積在棉花的表面,接著將棉花取出,在砂芯漏斗中抽濾、二次水潤(rùn)洗5～6次,放入烘箱中100 ℃烘干6 h。用LPD法制備得到ZrO2的過程如反應(yīng)式(1)和(2)所示:

(1)

(2)

1.3　樣品的制備

β-酪蛋白酶解物:采用100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)緩沖溶液稀釋?duì)?酪蛋白配制1 g/L的β-酪蛋白溶液,然后按照酶與β-酪蛋白質(zhì)量比為1∶50的比例在上述溶液中加入胰蛋白酶,將加入了酶的β-酪蛋白溶液在37 ℃下反應(yīng)16 h,β-酪蛋白溶液經(jīng)酶解后得到的產(chǎn)物在真空離心濃縮儀中旋干,存放在-80 ℃冰箱中備用。

BSA酶解物:首先配制含8 mol/L尿素的100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)緩沖溶液,然后將1 mg BSA加入到100 μL上述緩沖溶液中,待BSA溶解后,再加入DTT(DTT終濃度為10 mmol/L),放于37 ℃烘箱中反應(yīng)30 min,然后在上述溶液體系中繼續(xù)加入IAA(IAA終濃度為20 mmol/L),避光室溫反應(yīng)30 min;之后,再加入300 μL 100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)稀釋,按照酶與蛋白質(zhì)質(zhì)量比為1∶50的比例加入胰蛋白酶,置于37 ℃烘箱中反應(yīng)16 h。酶解后的產(chǎn)物經(jīng)真空離心濃縮儀旋干后存放于-80 ℃冰箱中備用。

脫脂牛奶酶解物:將100 μL脫脂牛奶放在真空離心濃縮儀中旋干,然后加入100 μL含8 mol/L尿素的100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)緩沖溶液復(fù)溶牛奶。剩余的步驟與BSA的酶解步驟相同。

1.4　磷酸化多肽的富集過程

稱取3 mg的ZrO2-CF裝填在200-μL吸頭前端,控制材料填裝的高度在4 mm左右,將裝填了ZrO2-CF的吸頭裝在移液槍上,通過移液槍的多次吸/推使用。

圖 1　棉花(CF)及納米氧化鋯沉積棉花(ZrO2-CF)的(a,b)掃描電鏡圖及(c,d)能量色散光譜表征圖Fig. 1　(a, b) Scanning electron microscopy (SEM) and (c, d) energy-dispersive spectroscopy (EDS) characterization images of CF and ZrO2-CFa. CF; b. ZrO2-CF; c. CF; d. ZrO2-CF.

1.4.1多肽溶液的富集

先將移液槍吸/推20次50 μL 3% (體積分?jǐn)?shù),下文中若無特殊說明,均為體積分?jǐn)?shù))TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)對(duì)材料平衡處理,然后將50 μL加入了多肽的3%TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)上樣液進(jìn)行上樣,為使磷酸化多肽充分吸附在ZrO2-CF材料上,吸/推移液槍40次上樣液,然后用50 μL 3%TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)清洗兩次,每次吸/推移液槍30次,之后采用50 μL 5%的氨水進(jìn)行解吸兩次,兩次各吸/推移液槍30次。將兩次所得的解吸液合并,真空離心濃縮儀旋干。最后,用2 μL的基質(zhì)溶液(20 g/L 2,5-DHB于50%乙腈、1% H3PO4的水溶液中)對(duì)旋干的解吸液進(jìn)行復(fù)溶,取1 μL的復(fù)溶液點(diǎn)在質(zhì)譜儀靶上進(jìn)行MALDI-TOF2MS分析。

1.4.2血清中磷酸化多肽的富集

與1.4.1節(jié)方法基本一致,先將2 μL血清樣品用3%TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)稀釋至50 μL,再作為上樣液進(jìn)行上樣,其他操作同1.4.1節(jié)。

1.4.3脫脂牛奶酶解物中磷酸化多肽的富集

將2 μL脫脂牛奶酶解物用3%TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)稀釋500倍,取50 μL的稀釋液作為上樣液,其他操作同1.4.1節(jié)。

1.5　儀器分析條件

MALDI-TOF2MS分析時(shí)采用波長(zhǎng)為337 nm的氮?dú)饧す馄?其脈沖寬度為3 ns;采用20 kV的加速電壓,在正離子反射模式下進(jìn)行檢測(cè)。質(zhì)荷比(m/z)掃描范圍為1 000～3 500,每張譜圖是500次激光掃描的平均結(jié)果。

2　結(jié)果與討論

2.1　ZrO2-CF的表征

我們利用掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)棉花和ZrO2-CF的表面形貌進(jìn)行了表征。結(jié)果如圖1所示,相比于棉花(圖1a), ZrO2-CF的表面出現(xiàn)了一層致密的納米二氧化鋯顆粒(圖1b)。同時(shí)采用能量色散型光譜儀表征了棉花和ZrO2-CF表面元素的差異(圖1c, 1d),證明了ZrO2-CF表面ZrO2的存在。結(jié)果表明,ZrO2-CF中Zr的含量為5.59%(圖1d)。

2.2　ZrO2-CF對(duì)磷酸化多肽的富集性能考察

2.2.1萃取條件的優(yōu)化

多肽混合物中除含有磷酸化多肽外,還含有大量的非磷酸化多肽,在一定的酸度條件下,含有羧酸根等基團(tuán)的非磷酸化多肽也會(huì)與氧化鋯產(chǎn)生路易斯酸堿作用,從而干擾磷酸化多肽的富集,因而需對(duì)上樣溶液的酸度進(jìn)行優(yōu)化。我們將ZrO2-CF用于β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物(物質(zhì)的量比為1∶10)混合樣品的磷酸化多肽的富集分析研究。上樣液中有機(jī)相為50%乙腈時(shí),考察水相中不同體積分?jǐn)?shù)的TFA對(duì)多肽混合物萃取效果的影響。當(dāng)上樣液的水相中TFA的體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí),非磷酸化多肽的信號(hào)較1%TFA和3%TFA時(shí)的弱,但信噪比較低;上樣液的水相中TFA含量為1%時(shí),磷酸化多肽的信噪比較高,但是由于溶液的酸度較低,所以羧酸根等離子也被電離,也與納米氧化鋯產(chǎn)生路易斯酸堿作用,因而非磷酸化多肽的信號(hào)也較高,綜合比較,最后選擇3%TFA水溶液作為上樣液的酸度條件。

仍然將β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物(物質(zhì)的量比為1∶10)混合樣品作為考察對(duì)象,固定上樣液的酸度為3%TFA,考察上樣液中乙腈含量對(duì)萃取效果的影響。如圖2所示,上樣液中含有20%乙腈或者80%乙腈的時(shí)候,解吸液譜圖中都含有大量的非磷酸化多肽(圖2a, 2c),而上樣液中乙腈的含量為50%時(shí),解吸液譜圖中的非磷酸化多肽比較少,磷酸化多肽的峰較為明顯(圖2b)。圖中標(biāo)有數(shù)字的峰為磷酸化多肽信號(hào)峰,所標(biāo)的數(shù)字為對(duì)應(yīng)磷酸化多肽的質(zhì)荷比(m/z)。這可能與磷酸化多肽與大部分非磷酸化多肽的疏水性不同有關(guān)。故選擇50%乙腈作為上樣液的有機(jī)相。

圖 2　β-酪蛋白和BSA酶解混合物經(jīng)ZrO2-CF富集后的MALDI-TOF2譜圖Fig. 2　MALDI-TOF2 mass spectra of the tryptic digest mixtures of β-casein and BSA after the ZrO2-CF enrichment Sampling solution: a. 3%(v/v) TFA aqueous solution-ACN (80∶20,v/v); b. 3%(v/v) TFA aqueous solution-ACN (50∶50, v/v); c. 3%(v/v) TFA aqueous solution-ACN (20∶80,v/v). Molar ratio of β-casein to BSA is 1∶10. Phosphopeptides are labeled with their observed m/z.

綜上,選擇3%TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)作為上樣液。采用填裝了3 mg ZrO2-CF材料的吸頭對(duì)3 pmol溶解于3%TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)的β-酪蛋白酶解物中磷酸化多肽進(jìn)行萃取,將萃取后的萃余液用MALDI-TOF2MS進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)萃余液中無磷酸化多肽信號(hào),表明ZrO2-CF對(duì)3 pmolβ-酪蛋白酶解物中磷酸化多肽萃取沒達(dá)到吸附飽和,滿足少量生物樣品分析。

2.2.2萃取性能的考察

分別采用ZrO2-CF和未修飾的棉花纖維CF對(duì)β-酪蛋白酶解物(3 pmol)進(jìn)行萃取分析,考察它們對(duì)磷酸化多肽的富集能力。如圖3a所示,當(dāng)β-酪蛋白酶解物未經(jīng)材料富集直接進(jìn)行MALDI-TOF2MS檢測(cè)分析時(shí),雖然可以檢測(cè)到4個(gè)磷酸化多肽的信號(hào)峰,但是譜圖中還有大量非磷酸化多肽的信號(hào)峰,并且檢測(cè)到的磷酸化多肽的信號(hào)都較弱。而經(jīng)ZrO2-CF富集后,萃余液(圖3b)中幾乎看不到磷酸化多肽的峰,表明ZrO2-CF材料對(duì)磷酸化多肽具有較強(qiáng)的作用,解吸液(圖3c)中可以看到9個(gè)磷酸化多肽的峰,幾乎看不到非磷酸化多肽的峰,說明在用ZrO2-CF處理后能有效地去除大部分的非磷酸化多肽,表明材料對(duì)磷酸化多肽有較好的萃取選擇性。然而用未修飾的棉花富集β-酪蛋白酶解物后的解吸液中只能檢測(cè)到1個(gè)磷酸化多肽(圖3d),表明CF表面沉積的納米ZrO2顆粒對(duì)磷酸化多肽具有較好的選擇性作用。

圖 3　β-酪蛋白的酶解物萃取前后的MALDI-TOF2的質(zhì)譜圖Fig. 3　MALDI-TOF2 mass spectra of tryptic digest of β-casein a. direct analysis; b. analysis after enrichment with ZrO2-CF; c. analysis of sampling eluate; d. analysis after enrichment with cotton fiber. Phosphopeptides are labeled with their observed m/z.

圖 4　不同比例的β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物的混合物經(jīng)ZrO2-CF富集前后的質(zhì)譜圖Fig. 4　MALDI-TOF2 mass spectra obtained by direct analysis and after ZrO2-CF enrichment of the tryptic digest mixtures of β-casein and BSA Molar ratio of β-casein and BSA are 1∶1 (a, d), 1∶10 (b, e), and 1∶100 (c, f). The concentration of β-casein was 6.0×10-8 mol/L. a, b, c is obtained by direct analysis; d, e, f is obtained after enrichment with ZrO2-CF.

圖 5　血清酶解物和脫脂牛奶酶解物直接進(jìn)樣和經(jīng)ZrO2-CF富集后的MALDI-TOF2質(zhì)譜圖Fig. 5　MALDI-TOF2 mass spectra of tryptic digest of human serum and non-fat milk obtained by direct analysis or after enrichment with the ZrO2-CF a, b: tryptic digest of human serum obtained by (a) direct analysis and (b) after enrichment with the ZrO2-CF ; c, d: tryptic digest of non-fat milk obtained by (c) direct analysis and (d) after enrichment with the ZrO2-CF.

為了進(jìn)一步考察ZrO2-CF對(duì)磷酸化多肽的萃取選擇性,將它用于β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物不同比例混合后的磷酸化多肽的富集。如圖4所示,酶解物混合后未經(jīng)富集直接進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí),譜圖中無法觀察到磷酸化多肽的信號(hào)(圖4a, 4b, 4c),基本上都是非磷酸化多肽的信號(hào)峰,說明非磷酸化多肽嚴(yán)重干擾了磷酸化多肽的質(zhì)譜分析,因此質(zhì)譜檢測(cè)磷酸化多肽前需將其選擇性地從復(fù)雜樣品中萃取出來。圖4d、4e和4f分別為1∶1、1∶10、1∶100(物質(zhì)的量比)的β-酪蛋白和BSA酶解物的混合物經(jīng)ZrO2-CF富集后質(zhì)譜檢測(cè)的譜圖,可以看出,當(dāng)β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物的比例為1∶1時(shí),經(jīng)材料處理后能觀察到5個(gè)磷酸化多肽的信號(hào)峰;當(dāng)其混合比例提高到1∶10, ZrO2-CF富集后的溶液能仍觀察到5個(gè)磷酸化多肽的信號(hào)峰;而當(dāng)其比例達(dá)到1∶100后,ZrO2-CF富集后的溶液依然能觀察到4個(gè)磷酸化多肽的信號(hào)峰,且3個(gè)比例的酶解混合物經(jīng)ZrO2-CF富集后的質(zhì)譜圖中基本上看不到非磷酸化多肽的峰。以上結(jié)果表明,ZrO2-CF可以有效地從多肽混合物中選擇性地萃取磷酸化多肽。

為考察方法的靈敏度,將ZrO2-CF用于β-酪蛋白酶解物中磷酸化多肽的萃取,當(dāng)β-酪蛋白的濃度低至10 fmol時(shí),其酶解物經(jīng)過ZrO2-CF富集后仍然可以檢測(cè)到m/z3 122的信號(hào),這說明方法靈敏度高。

2.3　ZrO2-CF材料對(duì)血清和牛奶中磷酸化多肽的富集應(yīng)用

由于磷酸化多肽與人類疾病有著密切關(guān)系,人血清中內(nèi)源性磷酸化多肽的測(cè)定受到越來越多的關(guān)注。由于血清樣品含有大量蛋白質(zhì)、多肽等復(fù)雜成分,對(duì)其中的磷酸化多肽進(jìn)行分析仍是一項(xiàng)挑戰(zhàn)性的工作。將血清樣品稀釋后,未經(jīng)材料富集直接進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí),如圖5a所示,譜圖中沒有磷酸化多肽的信號(hào);而在經(jīng)ZrO2-CF富集后,如圖5b所示,解吸液的質(zhì)譜圖中可看到4個(gè)磷酸化多肽的信號(hào)峰,它們的序列信息分別為DSGEGDFLAEGGGV(m/z1 389.5)、ADSGEGDFLAEGGGV(m/z1 460.5)、DSGEGDFLAEGGGVR(m/z1 545.5)和ADSGEGDFLAEGGGVR(m/z1 616.5)。

為了進(jìn)一步證明ZrO2-CF對(duì)復(fù)雜樣品中磷酸化多肽的萃取能力,將脫脂牛奶的酶解產(chǎn)物作實(shí)際樣品,繼續(xù)考察ZrO2-CF從實(shí)際樣品中捕獲磷酸化肽段的選擇性。牛奶中含有大量的蛋白質(zhì)和碳水化合物,基質(zhì)非常復(fù)雜,當(dāng)將脫脂牛奶酶解物直接經(jīng)MALDI-TOF2質(zhì)譜分析時(shí),如圖5c所示,僅有6個(gè)標(biāo)示的譜峰為磷酸化多肽的信號(hào)峰,且信號(hào)較弱,譜圖中大多數(shù)是非磷酸化多肽的信號(hào)峰;然而經(jīng)過ZrO2-CF富集后,如圖5d所示,非磷酸化多肽被有效去除,有9個(gè)磷酸化多肽被檢測(cè)到且信號(hào)得到極大的提高,這9個(gè)被檢測(cè)到的磷酸化肽段分別為β1(FQSEEQQQTEDELQDK,m/z2 061.5)、β2(FQSEEQQQTEDELQDKIHPF,m/z2 556.8)、β3(RELEELNVPGEIVESLSSSEESITR,m/z3 122.1)、α1 (TVDMESTEVFTK,m/z1 466.3)、α2(TVDM- ESTEVFTKK,m/z1 594.4)、α3 (VPQLEIVPNSAEER,m/z1 660.4)、α4(YLGEYLIVPNSAEER,m/z1 832.6)、α5(DIGSESTEDQAMEDIK,m/z1 927.4)、α6(YKVPQLEIVPNSAEER,m/z1 951.7)和α7(FPQYLQYLYQGPIVLNPWDQVKR,m/z3 024.9)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ZrO2-CF可以從復(fù)雜的實(shí)際樣品中高選擇性地萃取磷酸化多肽,與文獻(xiàn)報(bào)道的萃取材料相比(見表1), ZrO2-CF與其他材料對(duì)磷酸化多肽的富集靈敏度基本相當(dāng),但是材料的制備方法及萃取方式更簡(jiǎn)單,適用于少量樣品的磷酸化多肽的快速萃取分析。

表 1　ZrO2-CF與文獻(xiàn)報(bào)道的磷酸化富集材料的比較Table 1　Comparison of ZrO2-CF with the reported different materials for phosphopeptide enrichment

MDE: matrix dispersion extraction; MSPE: magnetic solid-phase extraction; SPE: solid-phase extraction.

3　結(jié)論

本文采用液相沉積法成功制備了納米氧化鋯沉積棉花纖維ZrO2-CF材料,并將其填裝于移液槍的吸頭內(nèi),應(yīng)用于磷酸化多肽的簡(jiǎn)單、快速富集萃取。不論對(duì)簡(jiǎn)單的磷酸化蛋白質(zhì)的酶解物樣品還是混有大量非磷酸化蛋白的酶解物樣品,ZrO2-CF材料對(duì)磷酸化多肽均表現(xiàn)出較高的萃取選擇性。將ZrO2-CF材料應(yīng)用于人血清和脫脂牛奶酶解物中磷酸化多肽的富集萃取,也表現(xiàn)出了較好的選擇性。材料制備簡(jiǎn)單、成本低,且生物相容性好,對(duì)磷酸化多肽具有較好的萃取選擇性;將材料裝填到移液槍后的抽吸萃取方法簡(jiǎn)單、快速、具有較好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn):

[1]Bodenmiller B, Mueller L N, Mueller M, et al. Nat Method, 2007, 4: 231

[2]Li X S, Yuan B F, Feng Y Q, et al. TrAC-Trends Anal Chem, 2016, 78: 70

[3]Long X Y, Lian H Z. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34(4): 357

龍星宇, 練鴻振. 色譜, 2016, 34(4): 357

[4]Lu J, Li Y, Deng C. Nanoscale, 2011, 3: 1225

[5]Dai J Y, Wang M D, Liu H L. Talanta, 2017, 164: 222

[6]Capriotti A L, Cavaliere C, Ferraris F, et al. Talanta, 2018, 178: 274

[7]Wang Q, He X M, Chen X, et al. J Chromatogr A, 2017, 1499: 30

[8]Jiang J B, Sun X N, Li Y, et al. Talanta, 2018, 178: 600

[9]Li X S, Xu L D, Zhu G T, et al. Analyst, 2012, 137: 959

[10]Ma W F, Zhang C, Zhang Y T, et al. Langmuir, 2014, 30: 6602

[11]Wu J H, Li X S, Zhao Y, et al. J Chromatogr A, 2011, 1218: 2944

[12]Posewitz M C, Tempst P. Anal Chem, 1999, 71: 2883

[13]Qin H Q, Wang F J, Wang P Y, et al. Chem Commun, 2012, 48: 961

[14]Lin B, Li T, Zhao Y, et al. J Chromatogr A, 2008, 1192: 95

[15]Wan H, Yan J, Yu L, et al. Talanta, 2010, 82: 1701

[16]Zeng Y Y, Chen H J, Shiau K J, et al. Proteomics, 2012, 12: 380

[17]Chen C T, Chen Y C. Anal Chem, 2005, 77: 5912

[18]Li X S.[PhD Dissertation]. Wuhan: Wuhan University, 2014

李小水. [博士學(xué)位論文]. 武漢: 武漢大學(xué), 2014

[19]Nagayama H, Honda H, Kawahara H. J Electrochem Soc, 1988, 135: 2013

[20]Yu Q W, Feng Y Q. Progress in Chemistry, 2011, 23(6): 1211

余瓊衛(wèi), 馮鈺锜. 化學(xué)進(jìn)展, 2011, 23(6): 1211

[21]Yu Q W, Ma Q, Feng Y Q. Talanta, 2011, 84(4): 1019

[22]Wu J H, Zhao Y, Li T, et al. J Sep Sci, 2010, 33(12): 1806

[23]Sun H, He H B, Lu Q, et al. J Agric Food Chem, 2016, 64(1): 356

[24]Wang Q, He X M, Feng Y Q. Chinese Journal of Analytical Science, 2017, 33(5): 613

王倩, 何小梅, 馮鈺锜. 分析科學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 33(5): 613

[25]He X M, Chen X, Zhu G T, et al. ACS Appl Mater Interfaces, 2015, 7(31): 17356

[26]He X M, Zhu G T, Zhu Y Y, et al. ACS Appl Mater Interfaces, 2014, 6 (20): 17857

[27]He X M, Chen X, Yuan B F, et al. J Chromatogr A, 2017, 1484: 49

[28]He X M, Zhu G T, Lu W, et al. J Chromatogr A, 2015, 1405: 188

[29]He X M, Yuan B F, Feng Y Q. J Chromatogr B, 2017, 1043: 122