貽貝的可控酶解及其酶解液的抗氧化活性

郭曉華，黃海，李玉環(huán)

（1.山東美佳集團(tuán)有限公司，山東日照276800；2.欽州學(xué)院食品工程學(xué)院，廣西欽州535011；3.日照職業(yè)技術(shù)學(xué)院海洋工程學(xué)院，山東日照276826）

貽貝的可控酶解及其酶解液的抗氧化活性

郭曉華1，黃海2，*，李玉環(huán)3

（1.山東美佳集團(tuán)有限公司，山東日照276800；2.欽州學(xué)院食品工程學(xué)院，廣西欽州535011；3.日照職業(yè)技術(shù)學(xué)院海洋工程學(xué)院，山東日照276826）

用Alcalase對貽貝進(jìn)行酶解能夠得到具有抗氧化活性的酶解物。通過控制酶解時間分別得到水解度（hydrolysis degree，DH）為12%、18%、24%和30%的4種酶解物，研究其抗氧化活性。結(jié)果表明，酶解物的還原力和羥基自由基清除率均隨DH升高而升高，但在DH 24%～30%范圍升高極緩；其DPPH自由基、超氧陰離子自由基清除率和脂質(zhì)過氧化抑制率均隨DH升高而呈現(xiàn)先增后降的趨勢，最高清除率均出現(xiàn)在DH 24%處。DH為24%的貽貝Alcalase酶解物具有最佳的抗氧化活性。

貽貝；水解度；抗氧化活性；酶解

貽貝是貝類養(yǎng)殖事業(yè)中的重要種類，世界許多地區(qū)都有養(yǎng)殖。日照近幾年貽貝產(chǎn)量迅速上升，2014年日照貽貝產(chǎn)量達(dá)到50萬t，約占全國總產(chǎn)量的70%，世界總產(chǎn)量的40%。而且由于日照貽貝的收獲是在每年的臘月到次年的清明節(jié)前后，收獲季節(jié)氣溫較低，產(chǎn)品品質(zhì)高。然而日照貽貝加工還是以生產(chǎn)單凍貽貝肉為主，生產(chǎn)工藝相對簡單，勞動力需求大，產(chǎn)品附加值不高。

蛋白質(zhì)可控酶解技術(shù)就是通過控制水解度（hydrolysis degree，DH）來獲得需要的具有某種活性的目標(biāo)肽組分。許多研究表明，通過可控酶解技術(shù)可以獲得抗氧化活性肽[1-2]、礦物元素結(jié)合活性肽[3-4]、降血壓活性肽[5-6]等?？寡趸木哂邢杂苫种蒲趸磻?yīng)的功能，在食品行業(yè)可用于抗氧化劑，延長食品的保質(zhì)期；在生物體內(nèi)可具有減輕自由基對機(jī)體的損傷、延緩衰老等功能[7]。本論文通過可控酶解技術(shù)制備具有抗氧化活性的酶解物，為貽貝抗氧化保健產(chǎn)品的開發(fā)提供理論支持，促進(jìn)貽貝加工行業(yè)的快速健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮貽貝：日照嵐山水產(chǎn)批發(fā)市場。

風(fēng)味蛋白酶（12 kU/g）、胰蛋白酶（190 kU/g）、胃蛋白酶（20 kU/g）：南寧龐博生物工程有限公司；Alcalase（103 kU/g）、中性蛋白酶（150 kU/g）：丹麥諾維信；福林酚試劑、牛血清白蛋白、甘氨酸：上海生工；還原型谷胱甘肽、DPPH：Sigma公司；抗壞血酸、鄰苯二胺、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、Tris、鄰苯三酚、甲基紫等試劑均為分析純及以上。

PHS-3C型精密pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；FDU-1200型EYELA冷凍干燥機(jī)：上海愛朗儀器有限公司；UV-2550型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

貽貝取肉后，用清水清洗，去除足絲、雜質(zhì)等，控干水分，置于組織搗碎機(jī)中勻漿，漿液用95%乙醇（4倍體積）在50℃萃取6 h，重復(fù)2次，抽濾除去脂肪，濾餅用少量乙醇沖洗后，真空干燥后粉碎過100目篩，即得脫脂貽貝粉。

1.2.2 貽貝酶解物制備

選取合適的蛋白酶在試驗(yàn)確定的條件下對脫脂貽貝粉進(jìn)行酶解。酶解過程中采用0.1 mol/L NaOH和HCl維持pH值穩(wěn)定。酶解完成后在100℃加熱10 min滅酶，冷卻至室溫，于6 000 r/min、4℃條件下離心20 min得到上清液，上清液過0.22 μm微孔濾膜后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥即得貽貝酶解物（enzymatic mussel powder，EMP）。

1.2.3 抗氧化活性檢測

將EMP配成系列濃度，以同濃度的谷胱甘肽（Glutathione，GSH）為參照，分別測定樣液的總還原力[8]、DPPH自由基清除率[9]、超氧陰離子自由基清除率[10]、羥基自由基清除率[11]、亞油酸脂質(zhì)過氧化抑制率[12]。運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件得到各抗氧化活性指標(biāo)的半數(shù)清除率（Half scavenging concentration，SC50），即達(dá)到 50%清除率時的濃度。

1.2.4 其他指標(biāo)的測定

DH（DH）測定按照茚三酮比色法進(jìn)行[13]，蛋白質(zhì)濃度測定采用福林酚比色法[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 貽貝酶解工藝優(yōu)化

2.1.1 酶的選擇

以酶解液的蛋白回收率（酶解液蛋白質(zhì)質(zhì)量占底物蛋白質(zhì)質(zhì)量的百分比）和總還原力為評價指標(biāo)進(jìn)行酶的篩選。各種酶均在其推薦的pH值、溫度下以相同的料液比、加酶量水解相同時間，得到酶解液。各種酶的水解條件如表1所示，各種酶解物的蛋白質(zhì)回收率和還原力見圖1。

表1 各種酶的酶解條件Table 1 The enzymolysis parameters of enzymes

圖1 各種酶解物的蛋白質(zhì)回收率和還原力Fig.1 The protein recovery rate and reducing power of hydrolysates

由圖1可知，Alcalase的蛋白質(zhì)回收率最高，達(dá)到82.36%，顯著高于其它酶（P<0.05），其余從高到低依次為胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶。從酶解液總還原力方面來看，還原力從高到低依次為Alcalase、胰蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和胃蛋白酶。這說明不同酶的專一性不同，得到的肽鏈組成、大小均不相同，從而導(dǎo)致還原力的差異。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，Alcalase的蛋白質(zhì)回收率和總還原力均顯著高于其它酶，因此選擇Alcalase作為水解用酶。

2.1.2 Alcalase酶解條件優(yōu)化

以DH為評價指標(biāo)，對Alcalase的溫度、pH值、料液比、加酶量4個條件進(jìn)行優(yōu)化，水解時間均為2 h，結(jié)果如圖2所示。Alcalase在60℃時DH最高，達(dá)到22.57%，溫度超過60℃時，Alcalase開始失活（圖2A）。Alcalase在pH10.0時活性最高，此時DH達(dá)到26.35%，當(dāng)pH值超過10.0酶活力開始下降（圖2B）。試驗(yàn)表明當(dāng)料液比為1∶40（g/mL）時，DH最高（圖2C）。隨著加酶量的增加，DH呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)加酶量達(dá)3 000 U/g時，DH幾乎不變，所以最適加酶量為3 000 U/g（圖2D）。由此可確定貽貝的最佳Alcalase水解條件為：溫度60 ℃、pH 10.0、料液比 1 ∶40（g/mL）、加酶量 3 000 U/g。

圖2 Alcalase水解條件優(yōu)化Fig.2 The optimization of hydrolysis with Alcalase

2.2 貽貝酶解物化學(xué)成分分析

在上述優(yōu)化條件下控制酶解時間得到不同DH的酶解物。本文制備了DH分別為12%、18%、24%和30%的4種酶解物（酶解時間分別為45、90、160、240 min），對其化學(xué)成分進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。

表2 貽貝酶解物化學(xué)成分Table 2 The contents of mussel hydrolysates %

隨著DH升高，酶解物中蛋白質(zhì)含量逐漸升高，而多糖含量逐漸降低，這是由于隨著水解的進(jìn)行，越來越多的蛋白質(zhì)溶解，酶解液中蛋白質(zhì)所占比例越來越大。

2.3 貽貝酶解物抗氧化活性

2.3.1 貽貝酶解物的還原力

不同DH的貽貝酶解物的還原力大小如圖3所示。

圖3 DH對貽貝酶解物還原力的影響Fig.3 The influence of DH on reducing power of hydrolysates

GSH和4個DH的貽貝酶解物的還原力均呈現(xiàn)量效關(guān)系，即隨著濃度的增加而增加，GSH的還原力顯著高于同濃度各種DH的貽貝酶解物。在DH12%至30%范圍內(nèi)，貽貝酶解物還原力隨著DH的增加而升高，當(dāng)DH達(dá)到24%后，還原力基本維持穩(wěn)定，略有上升。綜合分析各DH酶解物的化學(xué)成分和還原力可知，隨著DH上升，酶解物蛋白質(zhì)含量和還原力均升高，可見還原力主要體現(xiàn)在蛋白質(zhì)上。由于DH為24%和30%的酶解物蛋白質(zhì)含量基本相同（P＞0.05），所以具有的還原力也相當(dāng)。

2.3.2 貽貝酶解物的DPPH自由基清除率

DH對貽貝酶解物DPPH自由基清除率的影響見圖4。

由圖4可知，GSH的DPPH自由基清除率顯著高于同濃度各酶解物，且所有組的DPPH自由基清除率也呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。在DH 12%～24%范圍內(nèi)，DH對貽貝酶解物DPPH自由基清除能力的影響表現(xiàn)為正相關(guān)，這可能是由于酶解物隨著DH的升高蛋白質(zhì)含量也升高。然而當(dāng)DH從24%升高到30%時，酶解物的DPPH自由基清除率卻下降，由于這兩個DH的酶解物蛋白質(zhì)含量幾乎相等，由此可知酶解物的DPPH自由基清除能力不僅與蛋白質(zhì)的含量相關(guān)，還與蛋白肽的分子大小有關(guān)。

圖4 DH對貽貝酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.4 The influence of DH on scavenging rate of DPPH free radical of hydrolysates

2.3.3 貽貝酶解物的超氧陰離子自由基清除率

DH對貽貝酶解物超氧陰離子自由基清除率的影響見圖5。

圖5 DH對貽貝酶解物超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.5 The influence of DH on scavenging rate of superoxide anion radical of hydrolysates

由圖5可知，GSH的超氧陰離子自由基清除率也顯著高于同濃度各酶解物，且所有組的超氧陰離子自由基清除率也呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。在DH12%～24%范圍內(nèi)各酶解物超氧陰離子自由基清除率隨著DH的升高而顯著升高。當(dāng)濃度為3 mg/mL時，DH為12%、18%、24%的貽貝酶解物超氧陰離子自由基清除率分別為27.59%、34.01%、76.89%。同樣當(dāng)DH超過24%時，也觀察到清除率下降的情況，3 mg/mL DH為30%的酶解物超氧陰離子自由基清除率降為63.32%。這與DPPH自由基清除率的趨勢相一致，說明酶解物對超氧陰離子自由基清除能力也與蛋白肽的分子大小有關(guān)。

2.3.4 貽貝酶解物的羥基自由基清除率

DH對貽貝酶解物羥基自由基清除率的影響見圖6。

圖6 DH對貽貝酶解物羥基自由基清除率的影響Fig.6 The influence of DH on scavenging rate of hydroxyl radical of hydrolysates

由圖6可知，4種酶解物的羥基自由基清除能力與DH呈現(xiàn)正相關(guān)。與酶解物對超氧自由基清除作用不相同的是并未出現(xiàn)清除率隨著DH升高呈現(xiàn)先升后降的情況，而是呈現(xiàn)一直上升的趨勢，但從DH24%到30%時，清除率上升不顯著（P>0.05）。這一變化趨勢與You[15]等研究泥鰍蛋白木瓜蛋白酶解液以及張艷萍[16]等用堿性蛋白酶水解貽貝蛋白所得的研究結(jié)果基本一致。

2.3.5 貽貝酶解物的脂質(zhì)過氧化抑制作用

DH對貽貝酶解物脂質(zhì)過氧化抑制率的影響見圖7。

圖7 DH對貽貝酶解物脂質(zhì)過氧化抑制率的影響Fig.7 The influence of DH on inhibition rate of lipid peroxidation of hydrolysates

2.3.6 貽貝酶解物自由基清除作用及脂質(zhì)過氧化抑制作用的SC50

通過二次曲線擬合，求出DH12%、DH18%、DH24%、DH30%4種酶解物對3種自由基清除作用及脂質(zhì)過氧化抑制作用的SC50，結(jié)果如表3所示。

表3 貽貝酶解物自由基清除和脂質(zhì)過氧化抑制的SC50Table 3 The SC50of radical scavenging and lipid peroxidation inhibition of mussel hydrolysates mg/mL

DH24%酶解物對DPPH自由基、超氧陰離子自由基的清除作用和對脂質(zhì)過氧化抑制作用最強(qiáng)，其SC50分別為0.89、1.25、1.43 mg/mL。DH24%酶解物對羥基自由基也具有較強(qiáng)的清除作用，其SC50為1.40 mg/mL，僅略高于DH30%酶解物的1.37 mg/mL。因此DH24%酶解物顯示出最佳的抗氧化活性。

由于不同的氧化體系氧化機(jī)制不同，所以試驗(yàn)中貽貝酶解物在不同的氧化體系中活性不同。通過比較DH24%酶解物對3種自由基清除作用及脂質(zhì)過氧化抑制作用的SC50可知，其清除DPPH自由基活性最高，其次是羥基自由基，脂質(zhì)過氧化抑制作用最低。

3 結(jié)論

Alcalase酶解貽貝的效果最佳，蛋白回收率及其酶解物還原力均顯著高于其它酶。Alcalase最佳酶解工藝條件為：溫度 60 ℃、pH 10.0、料液比 1 ∶40（g/mL）、加酶量3 000 U/g。通過控制酶解時間制備得到DH分別為12%、18%、24%和30%的4種酶解物，隨著DH升高，酶解物中蛋白質(zhì)含量逐漸升高，而多糖含量逐漸降低。蛋白質(zhì)含量和肽分子大小是影響酶解物抗氧化活性的兩個因素。酶解物的還原力和羥基自由基清除率均隨DH升高而升高，但在DH24%～30%范圍升高極緩，說明還原力和羥基自由基清除活性主要與蛋白質(zhì)含量有關(guān)。酶解物的DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除率和脂質(zhì)過氧化抑制率均隨DH升高而呈現(xiàn)先增后降的趨勢，最高清除率出現(xiàn)在DH24%處，說明DPPH、超氧陰離子自由基清除活性和脂質(zhì)過氧化抑制活性不但與蛋白質(zhì)含量有關(guān)，還與肽分子大小有關(guān)。DH為24%的貽貝酶解物具有最佳的抗氧化活性。

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Controllable Enzymatic Hydrolysis of Mussel and Antioxidant Activity of Hydrolysates

GUO Xiao-hua1，HUANG Hai2，*，LI Yu-huan3
（1.Shandong Meijia Group Co.，Ltd.，Rizhao 276800，Shandong，China；2.College of Food Engineering，Qinzhou University，Qinzhou 535011，Guangxi，China；3.College of Ocean Engineering，Rizhao Polytechnic，Rizhao 276826，Shandong，China）

The enzymolysis to mussel with Alcalase could obtain enzymatic hydrolysate with antioxidant activity.The hydrolysates with hydrolysis degree（DH）of 12%，18%，24%and 30%respectively were prepared by controlling hydrolysis time.The results showed that the hydrolysate's reducing power and hydroxyl radical scavenging rate increased with the increase of DH，and they increased very slowly in the range of 24%to 30%DH.The scavenging rate of DPPH free radical and superoxide anion radical and the inhibition rate of lipid peroxidation all increased first and then decreased with the increase of DH，and they all reached the maximum at DH 24%.Thus the mussel hydrolysate by Alcalase with DH 24%possessed the best antioxidant activity.

mussel；hydrolysisdegree；antioxidant activity；enzymatic hydrolysis

2017-02-12

山東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013GGA11027）

郭曉華（1970—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：水產(chǎn)品加工及資源利用。

*通信作者：黃海（1977—），男（漢），副教授，博士，研究方向：水產(chǎn)品加工及資源利用。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.005