不同溫度糖氧剝奪對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞表達(dá)小泛素樣修飾蛋白化相關(guān)蛋白的影響

呂若寧，童媛媛，劉晉萍

深低溫停循環(huán)（deep hypothermic circulatory arrest，DHCA）是復(fù)雜先天性心臟病矯治手術(shù)中的關(guān)鍵技術(shù)，雖然近年來(lái)選擇性腦灌注的應(yīng)用一定程度增強(qiáng)腦保護(hù)效果，但DHCA的患者術(shù)后神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥仍高達(dá)8%～26%［1-2］。DHCA期間的低溫可確?；颊吣X部代謝維持在較低水平，延長(zhǎng)大腦缺血耐受時(shí)間。然而深低溫本身具有一定副作用并且會(huì)增加降溫復(fù)溫所需的體外循環(huán)時(shí)間，可能增加術(shù)后神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，臨床工作中對(duì)于停循環(huán)溫度的選擇存在較大爭(zhēng)議［3］。小泛素樣修飾蛋白（small ubiquitin-like modifier，SUMO）是一種通過(guò)對(duì)翻譯后蛋白進(jìn)行修飾，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的小分子蛋白質(zhì)［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)，SUMO化是誘導(dǎo)大腦產(chǎn)生缺血缺氧耐受的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，過(guò)表達(dá)SUMO1或SUMO2／3可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)缺血缺氧的耐受能力［6］。

目前為止，尚缺乏從體外循環(huán)角度對(duì)不同停循環(huán)溫度影響神經(jīng)細(xì)胞SUMO化方面的研究。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SHSY5Y）是一種分化程度較低的腫瘤細(xì)胞，其細(xì)胞形態(tài)、生理生化功能類似于正常神經(jīng)細(xì)胞，在人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的基礎(chǔ)研究應(yīng)用廣泛。本實(shí)驗(yàn)以糖氧剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）模擬停循環(huán)時(shí)缺血缺氧的狀態(tài)，觀察4 h不同程度低溫干預(yù)對(duì)缺血缺氧狀態(tài)下SHSY5Y細(xì)胞表達(dá)SUMO化相關(guān)蛋白的影響，并于再灌注24 h后觀察細(xì)胞凋亡情況，從SUMO化這一小分子水平探討不同停循環(huán)溫度對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胰酶、優(yōu)級(jí)胎牛血清（Gibco公司）；BCA蛋白定量試劑盒、超敏電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑盒（碧云天生物科技公司）；UBC9抗體、SUMO2+3抗體、SUMO1抗體、caspase-3抗體、β-actin抗體（abcam公司）；Talent熒光定量檢測(cè)試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）；乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）檢測(cè)試劑盒（南京建成）；1300A型1374生物安全柜、HERAcell150二氧化碳培養(yǎng)箱、Sorvall SF16R低速離心機(jī)（Thermo公司）；Infinite M200pro光柵型多功能酶標(biāo)儀（Tecan公司）；FCE型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Protein Simple公司）；7500熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）儀（ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心，解凍復(fù)蘇后使用RPMI 1640完全培養(yǎng)液（含14%滅活胎牛血清，1%雙抗），以3×105／ml種于 25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在 37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度至80%左右時(shí)，以1∶3比例傳代，培養(yǎng)10 d后，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均介于C10至C15代。

本實(shí)驗(yàn)在不同溫度環(huán)境中對(duì)SHSY5Y細(xì)胞進(jìn)行4 h的OGD，根據(jù)體外循環(huán)常用溫度管理策略，將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為對(duì)照組、37℃ OGD組、26℃ OGD組和18℃ OGD 組［7］。

1.2.2 低溫OGD模擬離體人神經(jīng)細(xì)胞DHCA模型

缺氧體系由厭氧產(chǎn)氣袋和密封培養(yǎng)罐組成，厭氧產(chǎn)氣袋可在0.5～1 h內(nèi)吸收氧氣，將培養(yǎng)罐中含氧量降至0.1%，營(yíng)造缺氧環(huán)境［8］。 SHSY5Y 細(xì)胞培養(yǎng)至融合度80%左右時(shí)，以3×105／ml鋪于35 mm培養(yǎng)皿或六孔板中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁，24 h后用PBS緩沖液沖洗兩次，更換無(wú)糖RPMI 1640培養(yǎng)液2 ml，置于密封培養(yǎng)罐內(nèi)進(jìn)行不同溫度的缺氧處理。缺氧4 h后，更換培養(yǎng)液恢復(fù)正常培養(yǎng)24 h。

1.2.3 Western Blot檢測(cè)蛋白水平 取 OGD 結(jié)束時(shí)及再灌注24 h細(xì)胞，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。細(xì)胞鏟子鏟下培養(yǎng)皿上的細(xì)胞，離心后用Complete Lysis-M蛋白裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取20 μg蛋白質(zhì)上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，一抗孵育過(guò)夜，次日用洗膜緩沖液（Tris Buffered Saline with Tween-20，TBST）洗膜三次后，二抗孵育1 h，再用TBST緩沖液洗膜三次，加 ECL電發(fā)光液，化學(xué)發(fā)光成像儀中顯影。操作中使用的抗體分別為UBC9兔抗人單克隆抗體（1 ∶5 000），SUMO2／3兔抗人單克隆抗體（1 ∶5 000），SUMO1 兔抗人單克隆抗體（1 ∶5 000），caspase-3兔抗人單克隆抗體（1 ∶500），β-actin兔抗人單克隆抗體（1∶5 000），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶5 000）。

1.2.4 培養(yǎng)液上清LDH含量測(cè)定 細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，取上清液，4℃離心，按LDH含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書方法在酶標(biāo)板上樣，在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)吸光度，BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)上清液蛋白濃度，計(jì)算LDH含量。1.2.5 RT-qPCR 測(cè)定 UBC9 的 mRNA 表達(dá) 取OGD 4 h結(jié)束后細(xì)胞，棄上清，按總RNA提取試劑盒方法提取總RNA，無(wú)RNA酶水（Rnase-free水）14 μl、cDNA 第一鏈合成預(yù)混 Mix 5 μl、RNA 模板 1 μl配成20 μl逆轉(zhuǎn)錄體系，梯度 PCR儀設(shè)置程序“42℃ 15 min，95℃ 3 min”進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，所得 cDNA根據(jù)Talent熒光定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行熒光定量qPCR。根據(jù)qPCR反應(yīng)的溶解曲線評(píng)價(jià)引物特異性并記錄各樣本的 Ct值，計(jì)算2-△△Ct結(jié)果為樣本mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料用（±s）表示，組間顯著性差異采用方差分析法檢驗(yàn)，組間兩兩比較用 LSD（Least Significant Difference）和 SNK（Student-Newman-Keuls）法，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 缺血再灌注損傷細(xì)胞效果

2.1.1 形態(tài)學(xué)觀察 光學(xué)顯微鏡相位差模式下觀察，可見(jiàn)正常培養(yǎng)的SHSY5Y細(xì)胞呈梭型或多邊形，形態(tài)飽滿、較為透亮；OGD使細(xì)胞縮小、變圓并聚集成團(tuán)，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)暗色空泡，且OGD溫度越高，細(xì)胞形態(tài)變化越明顯（見(jiàn)圖1）。

2.1.2 OGD 4 h再灌注 24 h后細(xì)胞培養(yǎng)液上清LDH濃度 培養(yǎng)液LDH濃度測(cè)定結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組LDH漏出均明顯增多（P＜0.05，n＝6），其中37℃ OGD組LDH漏出明顯較低溫組增多（P＜0.05，n＝6），而低溫干預(yù)組中 30℃組 LDH 漏出明顯少于 18℃及26℃組（P＜0.05，n＝6）（見(jiàn)圖2）。

2.1.3 OGD 4 h 再灌注 24 h 后 Caspase-3 蛋白表達(dá)情況 Western Blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，37℃OGD組Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯增高（P＜0.05，n＝6），低溫干預(yù)下調(diào) Caspase-3 表達(dá)（P＜0.05，n＝6），見(jiàn)圖 3。

圖1 SHSY5Y細(xì)胞正常培養(yǎng)及OGD干預(yù)后細(xì)胞狀態(tài)

圖2 微板法檢測(cè)OGD／再灌注后細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH漏出情況（n＝6）

2.2 溫度對(duì)SUMO相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.2.1 SUMO1 蛋白表達(dá)情況 Western Blot結(jié)果顯示：OGD損傷4 h后，結(jié)合態(tài)SUMO1蛋白表達(dá)水平變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，n＝6），低溫干預(yù)上調(diào)結(jié)合態(tài) SUMO1蛋白表達(dá)（P＜0.05，n＝6），且溫度越低表達(dá)量越高，其中18℃組結(jié)合態(tài)SUMO1蛋白表達(dá)水平明顯高于30℃組（P＜0.05，n＝6）；OGD 損傷4 h后，游離態(tài)SUMO1蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05，n＝6），低溫組對(duì)游離態(tài) SUMO1蛋白表達(dá)水平影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，n＝6）；低溫使SUMO1蛋白結(jié)合態(tài)與游離態(tài)比值增加（P＜0.05，n＝6），但各低溫組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，n＝6）（見(jiàn)圖 4）。

2.2.2 SUMO2／3 蛋白表達(dá)情況 Western Blot結(jié)果顯示：OGD損傷4 h后，結(jié)合態(tài)SUMO2／3蛋白表達(dá)水平變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，n＝6），低溫干預(yù)上調(diào)結(jié)合態(tài) SUMO2／3 蛋白表達(dá)（P＜0.05，n＝6），各低溫組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，n＝6）；OGD損傷4 h后，游離態(tài)SUMO2／3蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05，n＝6），低溫干預(yù)上調(diào)游離態(tài) SUMO2／3蛋白表達(dá)（P＜0.05，n＝6），各低溫組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；OGD使SUMO2／3結(jié)合態(tài)與游離態(tài)比值增加（P＜0.05，n＝6），增加低溫干預(yù)后 SUMO2／3結(jié)合態(tài)與游離態(tài)比值變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖5）。

圖3 不同溫度OGD的SHSY5Y細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)情況

圖4 不同溫度下OGD的SHSY5Y細(xì)胞SUMO1蛋白表達(dá)情況

2.3.3 UBC9 蛋白表達(dá)情況 Western Blot結(jié)果示，與對(duì)照組相比，OGD干預(yù)4 h后UBC9蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且低溫組UBC9蛋白表達(dá)水平變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，n＝6）（見(jiàn)圖 6A 和圖6B）。qPCR結(jié)果與Western Blot結(jié)果一致，各組UBC9的mRNA表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，n＝3）（見(jiàn)圖 6 C）。

3 討 論

DHCA條件下的大腦與哺乳動(dòng)物冬眠時(shí)所處環(huán)境相似，均為低溫、缺血、缺氧狀態(tài)，且都需經(jīng)歷復(fù)溫、再灌注環(huán)節(jié)，但動(dòng)物大腦卻可耐受這些變化，未遭致神經(jīng)系統(tǒng)損傷。對(duì)冬眠期地松鼠和非冬眠期地松鼠腦組織的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，冬眠期動(dòng)物腦組織SUMO化水平和UBC9（SUMO化過(guò)程唯一的結(jié)合酶）表達(dá)顯著升高，提示SUMO化可能參與哺乳動(dòng)物冬眠期缺血耐受的調(diào)控［9］。他們的研究還發(fā)現(xiàn)，單純低溫可增加SUMO1結(jié)合蛋白的表達(dá)，低溫預(yù)處理可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)OGD的耐受能力?；谝陨媳尘?，本實(shí)驗(yàn)選擇神經(jīng)系統(tǒng)病理狀態(tài)研究常采用的SHSY5Y細(xì)胞，依據(jù)體外循環(huán)手術(shù)常見(jiàn)管理策略設(shè)定溫度梯度及干預(yù)時(shí)間，有針對(duì)性的研究溫度對(duì)SUMO化的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，三種損傷指標(biāo)結(jié)果均說(shuō)明，低溫確實(shí)可減輕缺血缺氧造成的細(xì)胞損傷，但淺低溫、中低溫及深低溫的細(xì)胞保護(hù)作用差異并不大。形態(tài)學(xué)方面，細(xì)胞縮小、聚集、內(nèi)含暗色空泡均為損傷性形態(tài)改變，低溫干預(yù)的溫度越低缺血缺氧期細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變?cè)叫?。LDH多存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞死亡或細(xì)胞膜受損時(shí)，會(huì)釋放到細(xì)胞外。OGD后細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量增加，但低溫干預(yù)降低培養(yǎng)液中LDH水平。但筆者發(fā)現(xiàn)，中低溫組培養(yǎng)液中LDH含量最少，這可能與復(fù)溫時(shí)劇烈的溫度改變，增加細(xì)胞膜損傷有關(guān)。從凋亡蛋白Caspase-3結(jié)果看，經(jīng)歷37℃缺氧的細(xì)胞，凋亡蛋白表達(dá)明顯增高，而低溫可減少細(xì)胞凋亡。值得一提的是，Caspase-3蛋白在剛結(jié)束OGD時(shí)表達(dá)量極低難以檢測(cè)，于再灌注期間逐漸升高，至復(fù)氧24 h時(shí)可充分表達(dá)。而SUMO化相關(guān)蛋白的表達(dá)方面的結(jié)果顯示，在缺血缺氧條件下，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏，常溫狀態(tài)下神經(jīng)細(xì)胞SUMO1、SUMO2／3蛋白表達(dá)量總體呈減少趨勢(shì)，且缺血缺氧對(duì)SUMO1結(jié)合狀況影響較小，但可增加SUMO2／3 結(jié)合率，這一結(jié)果與 Hochrainer［10］等人2015年動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符。另一方面，低溫對(duì)SUMO1蛋白影響較大，可顯著增加結(jié)合態(tài)SUMO1蛋白表達(dá)量及SUMO1蛋白結(jié)合率，溫度越低影響越大，但26℃和18℃間差異不顯著；且低溫可進(jìn)一步增加SUMO2／3結(jié)合蛋白的表達(dá)量，但溫度梯度的影響不明顯。Western Blot結(jié)果顯示缺血缺氧和低溫干預(yù)后UBC9變化均不顯著，為驗(yàn)證這一結(jié)果可靠性，筆者又通過(guò)RT-qPCR在mRNA水平檢測(cè)了UBC9表達(dá)，結(jié)果與Western Blot一致，提示低溫促進(jìn)SUMO蛋白結(jié)合的作用，可能不通過(guò)UBC9蛋白表達(dá)量變化體現(xiàn)，而是與UBC9蛋白或SUMO蛋白的位置變動(dòng)有關(guān)。

SUMO化是一種可逆的內(nèi)源性調(diào)節(jié)過(guò)程，通過(guò)對(duì)翻譯后的功能性蛋白進(jìn)行修飾，參與蛋白質(zhì)相互作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、核轉(zhuǎn)位、維持基因組穩(wěn)定和抗泛素化等多種生物學(xué)功能調(diào)節(jié)過(guò)程［4］。許多研究結(jié)果顯示，結(jié)合態(tài)SUMO蛋白可保護(hù)細(xì)胞抵抗缺血缺氧損傷，減少結(jié)合態(tài)SUMO蛋白，增加OGD后細(xì)胞死亡率［11-13］。 Wang［14］等人的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，低溫可引起UBC9蛋白向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，SUMO2／3蛋白由游離態(tài)轉(zhuǎn)化為結(jié)合態(tài)在細(xì)胞核內(nèi)積聚，發(fā)揮主動(dòng)的神經(jīng)保護(hù)作用。以往多數(shù)觀點(diǎn)肯定了SUMO化的保護(hù)作用，但最近也有研究顯示，缺血再灌注時(shí)期，SUMO特異性蛋白酶的去SUMO化作用也可減少細(xì)胞死亡［15］。SUMO化的作用與其修飾的功能性蛋白密切相關(guān)，其最終效果以保護(hù)性為主，但不乏涉及一些損傷性調(diào)節(jié)通路，不同細(xì)胞、不同培養(yǎng)方式、在體離體都有可能對(duì)SUMO化檢測(cè)產(chǎn)生一定影響［16-17］。

本實(shí)驗(yàn)由于條件限制，無(wú)法控制降溫復(fù)溫速度，導(dǎo)致溫度變化過(guò)快，未能完全模擬DHCA的溫度變化過(guò)程。但結(jié)果可初步證實(shí)，低溫可增加SUMO蛋白總體表達(dá)水平，促進(jìn)SUMO1蛋白結(jié)合能力，提高神經(jīng)細(xì)胞抗缺血缺氧耐受能力。短時(shí)間缺血缺氧情況下，中低溫和淺低溫的神經(jīng)保護(hù)作用可能不比深低溫效果差。在外科醫(yī)生技術(shù)純熟的情況，可考慮將停循環(huán)溫度提升至中低溫，在縮短體外循環(huán)時(shí)間的同時(shí)，可達(dá)到與深低溫相近的神經(jīng)保護(hù)效果。少數(shù)外科操作用時(shí)短的術(shù)式，甚至可以考慮將停循環(huán)溫度調(diào)整至淺低溫。

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