右美托咪定對體外循環(huán)下心內(nèi)直視手術(shù)患者外周血單核細胞信號通路的影響

羅 琳，魏 曉，李美霞

在心臟直視手術(shù)中，體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass，CPB）一旦建立，機體不可避免地面臨多方面打擊，迅速激活機體體液及細胞免疫，通過Toll樣受體（toll-like receptor，TLRs）2、TLR4 信號傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor KappaB，NF-κB）激活，產(chǎn)生并釋放多種促炎細胞因子，啟動炎癥的“級聯(lián)”反應(yīng)，誘發(fā)全身性炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome， SIRS），甚至多器官功能衰竭［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定對機體免疫功能有調(diào)節(jié)作用［3］，可降低CPB下心臟直視手術(shù)患者血漿中的炎性細胞因子水平，減輕CPB誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)［4］。本研究擬評價右美托咪定對CPB下心內(nèi)直視手術(shù)患者外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）TLRs／髓樣分化因子（myeloid differentiation factor，MyD88）／NF-κB信號通路的影響，進一步探討右美托咪定的抗炎機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究已獲本院醫(yī)學倫理委員會批準［2016-（倫審）-029］，并與患者簽署知情同意書。選取擇期在CPB下行心臟瓣膜置換術(shù)的患者90例，年齡30～64歲，體重45～68 kg，ASA 分級Ⅱ或Ⅲ級，NYHA心功能分級Ⅱ或Ⅲ級，左室射血分數(shù)＞50%，既往無心臟手術(shù)史，無嚴重哮喘病史，無肺部慢性疾病史，無肝腎器質(zhì)性病變，無竇性心動過緩、重度房室傳導(dǎo)阻滯或病態(tài)竇房結(jié)綜合征。采用隨機數(shù)字表法分為3組（n＝30）：右美托咪定組1（D1組）、右美托咪定組2（D2組）和對照組（C組）。

1.2 麻醉方法 入室前30 min肌肉注射東莨菪堿0.01 mg／kg、嗎啡 0.1 mg／kg。 入室后面罩吸氧，開放外周靜脈通道，監(jiān)測ECG、BP及脈搏氧飽和度（SpO2），局麻下行橈動脈穿刺置管術(shù)，監(jiān)測有創(chuàng)動脈血壓。D1組和D2組分別在麻醉誘導(dǎo)前靜脈泵注右美托咪定 0.5 μg／kg 和 1.0 μg／kg 負荷量，隨后分別以 0.2 μg／（kg·h）和 0.4 μg／（kg·h）速率輸注至術(shù)畢，C組則以等容量生理鹽水代替。麻醉誘導(dǎo)：靜脈注射咪唑安定 0.04 mg／kg，舒芬太尼 1～2 μg／kg，依托咪酯 0.1～0.2 mg／kg，羅庫溴銨 0.6 mg／kg。麻醉誘導(dǎo)后行氣管內(nèi)插管術(shù)，連接Dr?ger Primus麻醉機（德爾格Dr?ger德國），行機械通氣，呼吸機參數(shù)設(shè)置：潮氣量6～8 ml／kg、呼吸頻率10～12次／min、吸呼比1∶2、吸入氧濃度60%，維持呼氣末二氧化碳分壓35～45 mm Hg。右頸內(nèi)靜脈穿刺置管監(jiān)測中心靜脈壓。術(shù)中吸入1%～2%七氟烷，靜脈輸注丙泊酚2～4 mg／（kg·h）、舒芬太尼 1～2 μg／（kg·h）和羅庫溴銨 5～6 μg／（kg·min）維持麻醉，BIS值維持40～60。術(shù)中監(jiān)測鼻咽溫度和直腸溫度。 靜脈輸注多巴胺2～10 μg／（kg·min）和硝酸甘油 0.2 ～1.0 μg／（kg·min），維持血流動力學平穩(wěn)（心率及平均動脈壓波動幅度不超過基礎(chǔ)值的20%）。

1.3 CPB 選取胸部正中切口，切開心包前頸內(nèi)靜脈注射肝素3 mg／kg，待全身肝素化（活化凝血時間＞480 s）后常規(guī)行主動脈及上、下腔靜脈插管，建立CPB。CPB采用stocker SC型心肺機和美敦力膜式氧合器進行中度低溫心肺轉(zhuǎn)流術(shù)。CPB均以醋酸林格液加聚明膠肽注射液預(yù)充，非搏動性灌注，保持灌注流量在 60～80 ml／（kg·min），維持灌注壓在40～60 mm Hg，CPB期間采用α穩(wěn)態(tài)維持酸堿、電解質(zhì)平衡。使用StockertⅢ型變溫水箱控制血溫，血流降溫至鼻咽溫度28～32℃，降溫速度均為0.5～1.0℃ ／min，復(fù)溫速度為 1℃ ／（3 ～5 min）。 CPB 結(jié)束后，用魚精蛋白中和肝素（1～1.5 ∶1），止血，關(guān)胸。術(shù)畢患者帶氣管導(dǎo)管轉(zhuǎn)入ICU。

1.4 觀察指標 分別在麻醉誘導(dǎo)前（T0）、CPB后1 h（T1）、3 h（T2）、5 h（T3）、12 h（T4）和 24 h（T5）這6個時間點采集橈動脈血6 ml，取4 ml血用淋巴細胞分離液按密度梯度離心法分離PBMC，加Trizol置-70℃冰箱保存。待標本收集齊以后，復(fù)蘇PBMC，用PBS液稀釋細胞密度為 2×109／L，取細胞懸浮液 100 μl，加入 20 μl CD14-PC5 標記 PBMC，加入 10 μl TLR2 抗體（Anti-Human CD282）和 10 μl TLR4抗體（Anti-Human CD284），4℃下避光孵育25 min，經(jīng)震蕩離心后再加入30 μl NK-κB抗體（Alexa Fluor 687 Mouse anti-NK-κBp65），4℃避光靜置50 min，定容待測。另取細胞懸浮液100 μl，加入 20 μl CD14-PC5 標記 PBMC，先后加入 5 μl MyD88 一抗（anti-MyD88 antibody）和 5 μl MyD88二抗（Rat Anti-Mouse IgG2a-PE），4℃下避光孵育30 min，同時制備同型對照樣本待測。使用流式細胞儀（FACSCanto美國BD）檢測，用CXP Cytometer流式細胞儀分析軟件分析CD14+PBMC TLR2、TLR4和NK-κB的陽性表達率，以及MyD88的平均熒光強度。 另2 ml血室溫下放置2 h，4℃ 2 500 r／min離心15 min，留取分離血漿，置于-70℃冰箱保存待測。用ELISA法檢測血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）濃度。 為消除CPB時血液稀釋對結(jié)果的影響，用Tavlor公式校正，校正值＝實測值×麻醉誘導(dǎo)前紅細胞比容（hematocrit，HCT） ／取樣時 HCT。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS16.0軟件進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，重復(fù)測量設(shè)計的計量資料比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，各實驗組間比較用方差分析，兩兩比較用LSD 法，計數(shù)資料比較采用 χ2檢驗，（P＜0.05）為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般結(jié)果 經(jīng)單因素方差分析，3組患者年齡、性別比例、ASA分級比例、左室射血分數(shù)、體重、主動脈阻斷時間、CPB時間和手術(shù)時間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 見表 1。

表1 三組患者一般情況和手術(shù)情況各指標的比較（n＝30）

2.2 各組不同時間點CD14+PBMC比較 與T0比較，三組患者在T1～T5時CD14+PBMC TLR2陽性表達率水平增高（P＜0.05）；與 C組比較，D1組和D2組患者在T1～T5時CD14+PBMC TLR2陽性表達率降低（P＜0.05）；與D1組比較，D2組患者在T1～T5時CD14+PBMC TLR2陽性表達率降低（P＜0.05）。 見表 2。

表2 三組患者不同時點CD14+PBMC TLR2（n＝30，±s）

表2 三組患者不同時點CD14+PBMC TLR2（n＝30，±s）

注：與 T0 時比較，aP ＜0.05；與 C 組比較，bP ＜0.05；與 D1 組比較，cP ＜0.05。

項目 D1組 D2組 C組 F值 P值T0 0.81±0.05 0.79±0.07 0.79±0.06 0.518 0.597 T1 3.38±0.23ab 2.02±0.24abc 4.54±0.31a 684.623 ＜0.001 T2 4.81±0.40ab 3.84±0.27abc 5.68±0.41a 186.952 ＜0.001 T3 5.98±0.30ab 4.53±0.42abc 6.51±0.38a 224.242 ＜0.001 T4 4.79±0.32ab 4.16±0.26abc 5.15±0.29a 89.665 ＜0.001 T5 4.15±0.25ab 3.72±0.25abc 4.56±0.31a 72.791 ＜0.001 F 值 1 689.324 1 598.619 1 944.763 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 三組患者不同時點CD14+PBMC TLR4陽性表達率的比較 與T0比較，三組患者在T1～T5時CD14+PBMC TLR4陽性表達率增高（P＜0.05）；與C組比較，D1組和D2組患者在T1～T5時CD14+PBMC TLR4陽性表達率降低（P＜0.05）；與 D1組比較，D2組患者在T1～T5時CD14+PBMC TLR4降低（P＜0.05）。 見表3。

2.4 三組患者不同時點CD14+PBMC NF-κB陽性表達率的比較 與T0比較，三組患者在T1～T5時CD14+PBMC NF-κB 陽性表達率增高（P＜0.05）；與C組比較，D1組和D2組患者在T1～T5時CD14+PBMC NF-κB 陽性表達率降低（P＜0.05）；與 D1組比較，D2組患者在T1～T5時CD14+PBMC NF-κB陽性表達率降低（P＜0.05）。 見表4。

2.5 三組患者不同時點CD14+PBMC MyD88熒光強度的比較 與T0比較，三組患者在T1～T5時CD14+PBMC MyD88熒光強度水平增高（P＜0.05）；與C組比較，D1組和D2組患者在T1～T5時CD14+PBMC MyD88熒光強度水平降低（P＜0.05）；與 D1組比較，D2組患者在T1～T5時CD14+PBMC MyD88熒光強度水平降低（P＜0.05）。見表5。

2.6 三組患者不同時點血漿中TNF-α濃度的比較

與T0比較，三組患者在T1～T5時血漿中TNF-α濃度均升高（P＜0.05）；與C組比較，D1組和D2組患者在T1～T5時血漿中TNF-α濃度降低（P＜0.05）；與D1組比較，D2組患者在T1～T5時血漿中TNF-α濃度降低（P＜0.05）。 見表 6。

表3 三組患者不同時點CD14+PBMC TLR4陽性表達率的比較（n＝30，%，±s）

表3 三組患者不同時點CD14+PBMC TLR4陽性表達率的比較（n＝30，%，±s）

注：與 T0 時比較，aP ＜0.05；與 C 組比較，bP ＜0.05；與 D1 組比較，cP ＜0.05。

項目 D1組 D2組 C組 F值 P值T0 0.95±0.03 0.96±0.02 0.96±0.03 0.328 0.721 T1 3.54±0.37ab 1.88±0.22abc 4.67±0.29a 649.734 ＜0.001 T2 4.76±0.29ab 2.97±0.24abc 5.88±0.31a 812.995 ＜0.001 T3 6.25±0.29ab 3.93±0.29abc 7.73±0.30a 1 240.778 ＜0.001 T4 5.10±0.24ab 3.03±0.27abc 6.15±0.34a 930.911 ＜0.001 T5 4.08±0.27ab 1.97±0.27abc 5.07±0.32a 908.067 ＜0.001 F 值 2 116.420 1 108.279 3 440.292 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表4 三組患者不同時點CD14+PBMC NF-κB陽性表達率的比較（n＝30，%，±s）

表4 三組患者不同時點CD14+PBMC NF-κB陽性表達率的比較（n＝30，%，±s）

注：與 T0 時比較，aP ＜0.05；與 C 組比較，bP ＜0.05；與 D1 組比較，cP ＜0.05。

項目 D1組 D2組 C組 F值 P值T0 0.29±0.04 0.30±0.03 0.29±0.03 0.565 0.546 T1 3.23±0.43ab 1.57±0.27abc 6.31±0.37a 1 299.977 ＜0.001 T2 5.37±0.39ab 2.55±0.34abc 9.49±0.38a 2 604.258 ＜0.001 T3 8.25±0.33ab 4.24±0.36abc 12.27±0.44a 3 343.472 ＜0.001 T4 8.80±0.39ab 4.81±0.37abc 13.74±0.48a 3 430.694 ＜0.001 T5 7.57±0.45ab 3.97±0.38abc 11.75±0.47a 2 407.816 ＜0.001 F 值 3 514.969 1 876.924 7 153.617 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表5 三組患者不同時點CD14+PBMC MyD88熒光強度的比較（n＝30，±s）

表5 三組患者不同時點CD14+PBMC MyD88熒光強度的比較（n＝30，±s）

注：與 T0 時比較，aP ＜0.05；與 C 組比較，bP ＜0.05；與 D1 組比較，cP ＜0.05。

項目 D1組 D2組 C組 F值 P值T0 10.87±1.43 10.92±1.27 10.72±1.14 0.212 0.818 T1 15.77±1.42ab 13.93±1.32abc 18.67±1.08a 103.158 ＜0.001 T2 17.65±1.46ab 15.11±1.24abc 21.62±1.06a 198.027 ＜0.001 T3 19.72±1.46ab 16.97±1.28abc 23.65±1.59a 185.479 ＜0.001 T4 18.56±1.48ab 14.98±1.31abc 21.09±0.95a 163.812 ＜0.001 T5 16.72±1.41ab 12.06±1.31abc 19.11±1.01a 223.783 ＜0.001 F 值 5 605.621 2 266.100 6 268.185 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討 論

本研究參照文獻［5-6］選擇分別在麻醉誘導(dǎo)前靜脈泵注右美托咪定 0.5 和 1.0 μg／kg 負荷量，隨后分別以 0.2 μg／（kg·h）和 0.4 μg／（kg·h）速率輸注至手術(shù)結(jié)束，術(shù)中維持血流動力學穩(wěn)定。

CPB通過多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激發(fā)炎癥反應(yīng)。CPB可導(dǎo)致機體釋放內(nèi)源性危險信號，比如熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）、壞死細胞、氧自由基等［7］，它們可結(jié)合并激活細胞膜上的 TLR2、TLR4，啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使NF-κB激活并轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，誘導(dǎo)特異mRNA的產(chǎn)生，從而轉(zhuǎn)錄、產(chǎn)生和釋放各種炎性細胞因子，故TLRs／MyD88／NF-κB信號通路的激活在CPB所誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［8］。TNF-α是參與全身炎癥反應(yīng)中最重要的炎性介質(zhì)，其啟動瀑布式炎癥級聯(lián)反應(yīng)，可活化各種炎性細胞釋放白細胞介素，激活凝血系統(tǒng)和補體系統(tǒng)，對臟器損傷起關(guān)鍵性作用［9］。本研究中證實，與T0比較，三組在CPB后（T1～T5）外周血CD14+PBMC TLR2、TLR4和 NF-κB陽性表達率和MyD88熒光強度水平均增高，而且血漿中TNF-α濃度升高，提示 CPB 激活了 TLRs／MyD88／NF-κB 信號通路，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)。

表6 三組患者不同時點血漿中TNF-α濃度的比較（n＝30，±s）

表6 三組患者不同時點血漿中TNF-α濃度的比較（n＝30，±s）

注：與 T0 時比較，aP ＜0.05；與 C 組比較，bP ＜0.05；與 D1 組比較，cP ＜0.05。

項目 D1組 D2組 C組 F值 P值T0 26.04±2.36 24.90.±2.99 25.37±2.76 1.323 0.272 T1 33.07±2.70 26.81±2.61 35.20±2.58 81.917 ＜0.001 T2 37.52±3.24 28.48±2.17 43.92±4.29 161.101 ＜0.001 T3 44.12±2.08 32.80±2.22 50.91±3.36 366.215 ＜0.001 T4 41.16.±2.29 30.58.±2.19 45.82±3.23 267.509 ＜0.001 T5 39.31±2.17 29.35±2.15 41.19±3.04 224.017 ＜0.001 F 值 575.411 300.647 727.627 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

右美托咪定是高選擇性α2腎上腺素受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮及交感神經(jīng)抑制等作用。近年研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定不僅對感染引起的炎癥反應(yīng)具有抗炎作用［10］，而且在缺血-再灌注損傷和休克中也具有抑制炎性因子的作用，對心、腦和腎臟等具有器官保護作用［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，與C組比較，D1組和D2組患者在T1～T 5時血漿中TNF-α濃度降低；與D1組比較，D2組患者在T1～T 5時血漿中TNF-α濃度降低。提示右美托咪定可降低血漿中炎性細胞因子的水平，減輕CPB所誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)，且此效應(yīng)與劑量相關(guān)。本研究結(jié)果表明，與C組比較，D1組和D2組患者在T1～T 5時CD14+PBMC TLR2、TLR4和 NF-κB陽性表達率和MyD88熒光強度水平均降低；與D2組比較，D2組患者在T1～T 5時CD14+PBMC TLR2、TLR4和 NF-κB陽性表達率和MyD88熒光強度水平均降低，提示右美托咪定可通過抑制 TLRs／MyD88／NF-κB 信號通路激活，降低血漿中TNF-α濃度，且此抑制作用與劑量相關(guān)。

綜上所述，右美托咪定減輕CPB下心內(nèi)直視手術(shù)患者全身炎癥反應(yīng)且呈劑量依賴，其機制與抑制TLRs／MyD88／NK-κB 信號通路的激活有關(guān)。

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