南陽野生烏頭整株植物不同部位的生物堿和多糖含量比較研究＊

孫美玲，張 荳，楊 碩，彭詩濤，宋肖樺，劉 鵬，杜 紅，李 飛，胡慧華

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 102488）

烏頭，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為下品，后有附子入藥。烏頭、附子分別為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的干燥母根及子根的加工品，中國藥典2015年版中烏頭其性熱，味辛、苦，有大毒，歸心、肝、腎、脾經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕，溫經(jīng)止痛的功效，用于風(fēng)寒濕痹，關(guān)節(jié)疼痛，心腹冷痛，寒疝作痛等癥；附子性大熱，味辛、甘，有毒，歸心、腎、脾經(jīng)，具有回陽救逆，補(bǔ)火助陽，散寒止痛的功效，用于亡陽虛脫，肢冷脈微，心陽不足等癥[1]。漢代《金匱要略方論》提到烏頭“熬，去皮，?咀，水煮去滓，內(nèi)蜜再煎”?！秱摗穂2]和《金匱要略》[3]中對烏頭和附子的使用“炮或生，去皮，破八片”?！妒?jì)總錄》中提及“烏頭蛤粉同炒裂，去皮臍”?！毒霸廊珪穂4]中記載“面裹而煨”。張仲景及歷代醫(yī)家對烏頭和附子的使用未提及去除須根，2015版《中國藥典》[1]對烏頭、附子的描述中均要求去除須根。

宋代由國家校正醫(yī)書局的高保衡、孫奇、林億編寫的《傷寒論》序中談及：“張仲景，南陽人，名機(jī)，仲景乃其字也。舉孝廉，官至長沙太守。始受術(shù)于同郡張伯祖，時人言，識用精微過其師”[5]。張仲景最早使用附子，《傷寒論》[2]及《金匱要略》[3]使用烏頭有20首，使用附子經(jīng)方有33首。據(jù)考證，張仲景生活的年代大約為公元150-219年，具體出生地點在今河南省南陽，為南陽人，故本課題組赴河南南陽采集野生烏頭整株植物進(jìn)行研究。

生物堿和多糖是烏頭、附子的主要有效成分[6,7]，生物堿其主要包括脂溶性生物堿和水溶性生物堿。脂溶性生物堿主要為雙酯型和單酯型的酯型生物堿，水溶性生物堿包括一些微量生物堿如附子亭等。雙酯型生物堿性質(zhì)不穩(wěn)定且毒性較大，易被水解，經(jīng)一級水解失去一分子醋酸生成相應(yīng)低毒的單酯型生物堿，再進(jìn)一步水解生成幾乎無毒的胺醇型生物堿[8]。烏頭、附子都含有多糖，據(jù)研究報道，烏頭多糖有降血糖作用[9]，附子多糖有顯著的抑瘤作用、抗過氧化損傷、提高免疫力的作用[10,11]。歐水平等[12]從烏頭各組織部位總堿與單酯、雙酯型生物堿的比較可以看出，須根總生物堿含量很高，地上部分莖葉由于雙酯型生物堿含量較低，毒性較子根、母根、須根小。曾榮等[13]檢測到須根的總生物堿和雙酯型生物堿含量明顯高于附子且其所含淀粉、蛋白質(zhì)較少，耐貯藏特性明顯好于附子，說明了須根有較大的藥用開發(fā)價值。

表1 流動相梯度洗脫條件

故本實驗以3種單酯型生物堿（苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿）、3種雙酯型生物堿（新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿）及總生物堿和多糖含量為指標(biāo)，對南陽野生烏頭、附子、須根、地上部分進(jìn)行研究，探討須根及地上部分的藥用價值，欲為是否擴(kuò)大烏頭、附子藥用部位提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SB25-12DTDN型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；Waters2498高效液相色譜儀（DAD檢測器、自動進(jìn)樣器、在線脫氣、四元泵）；BT125D十萬分之一分析天平（Sartorius）；pH902-Ad110pH計（泰州市正大科教儀器設(shè)備廠）；18系列紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）。

1.2 試劑

新烏頭堿（批號：110799-201106）、烏頭堿（批號：110720-201111）、次烏頭堿（批號：110798-201106）、苯甲酰新烏頭原堿（批號：111795-201102）、苯甲酰次烏頭原堿（批號：111796-201002）和苯甲酰烏頭原堿（批號：111794-201303）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；D（+）無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（20160913）、蒽酮、濃硫酸、無水乙醇、丙酮、乙腈、四氫呋喃（德國Merck公司，色譜純），其余試劑均為分析純；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

1.3 藥物

南陽野生烏頭整株植物，2016年10月采挖于河南南陽。經(jīng)中國食品藥品檢定研究院中藥所張繼主任藥師鑒定為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的整株植物。

2 方法

2.1 生物堿含量的測定

2.1.1 生物堿測定色譜條件

采用藥典法[1]，以乙腈-四氫呋喃（25∶15）為流動相A，以0.1 mol·L-1醋酸銨（每1 L含冰醋酸0.5 mL）為流動相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1；檢測波長235 nm。流動相梯度洗脫條件（表1）。

2.1.2 對照品溶液的制備

取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿對照品適量，精密稱定，加異丙醇—二氯甲烷（1∶1）混合溶液，制成每l ml各含苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿10 μg的混合溶液，制成每1 ml各含新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿5 ug的混合溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

分別精密稱取南陽野生烏頭、南陽野生附子、須根及地上部分的樣品（過三號篩），約2 g，置具塞錐形瓶中，加入氨試液3 mL，加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，稱定重量，超聲處理（功率400 W，頻率40 kHz，水溫在25℃以下）30 min，放至室溫，再稱定重量，加異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液補(bǔ)足減失重量，濾過，量取續(xù)濾液25 mL，40℃以下回收溶劑至干，加入異丙醇-二氯甲烷（1∶1）3 mL溶解殘渣，溶過0.45 μm微孔濾膜，為供試液[1]。

2.1.4 線性關(guān)系考察

分別吸取2.1.2項下的混合溶液2、1、0.5、0.2、0.1、0.05 mL定容到10 mL容量瓶中制成不同濃度的對照品溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過。精密量取各濃度溶液10 μL注入高效液相中（表2）。

2.1.5 樣品測定

分別精密吸取各供試品溶液10 μL按上述色譜條件進(jìn)行檢測。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線（表2）計算各供試品中新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿及苯甲酰次烏頭原堿的含量（表3）。

表2 6種生物堿對照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 南陽野生烏頭整株植物不同部位中6種酯型生物堿的含量平均值（n=4）（g/g）

2.2 多糖含量的測定

2.2.1 供試品溶液的制備

南陽野生烏頭、南陽野生附子、須根及地上部分的樣品各精密稱取1 g，加入10 mL 95%乙醇回流提取2次每次2 h，棄去乙醇液，藥渣揮干乙醇，加入40 mL純水于90℃恒溫水浴鍋中浸提2次，每次2 h，濾過，濾液濃縮至一定體積，加95%乙醇使含醇量為80%，4℃冰箱中靜置48 h，沉淀依次用乙醚、丙酮、無水乙醇洗滌2次，得粗多糖，將粗多糖溶于水，加水定容至250 mL，作為供試品溶液[14]。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密吸取濃度為0.0198 mg·mL-1葡萄糖對照品溶液 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分別置于6支干燥的具塞刻度試管中，各加純水補(bǔ)至2.0 mL，緩緩加入新鮮配制的0.2%硫酸－蒽酮試劑8.0 mL，搖勻，沸水浴10 min，取出，冰水浴冷卻，放置10 min，以相應(yīng)試劑為空白，于592 nm處測定吸光度，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程：Y=147.4901 × C-0.03722，R=0.9991。結(jié)果表明，葡萄糖在0.00198-0.0198 mg·mL-1內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2.3 多糖含量測定

精密吸取2.2.1項下各供試品溶液1 mL于具塞試管中，按2.2.2項下方法顯色并測定吸光度，計算多糖含量。

圖1 南陽野生烏頭整株植物

圖2 南陽野生附子

圖3 南陽野生烏頭

圖4 南陽野生烏頭和附子的須根

表4 南陽烏頭整株植物不同部位中單、雙酯和總酯型生物堿的含量平均值（n=4）（g/g）

圖5 南陽野生烏頭整株植物不同部位單酯型生物堿含量

圖6 南陽野生烏頭整株植物不同部位雙酯型生物堿含量

圖7 南陽野生烏頭整株植物不同部位總生物堿含量

3 結(jié)果

3.1 性狀

鮮南陽野生烏頭植株，地下部分烏頭、附子、須根是褐色，主根連著的是烏頭，子根是附子（圖1）。

南陽野生附子為圓錐形，長4-7 cm，直徑3-5 cm。表面深褐色，頂端有印陷的芽痕，周圍有瘤狀突起的支根或支根痕（圖2）。

南陽野生烏頭呈不規(guī)則長圓錐形，質(zhì)硬，略彎曲，長2-7 cm，直徑0.6-1.8 cm。頂端有殘莖和少數(shù)不定根殘基，頂端一側(cè)有一枯萎的芽，一側(cè)有一圓形或扁圓形不定根殘基。表面灰褐色或黑棕褐色，皺縮，有縱皺紋、點狀須根痕及數(shù)個瘤狀側(cè)根（圖3）。

南陽野生烏頭附子的須根為褐黃色，長3-7 cm，直徑0.1-3.0 mm，細(xì)長，柔軟，主根和子根上均有生長。干燥的烏頭須根黃褐色或褐色，卷曲，質(zhì)脆，易折斷（圖4）。

3.2 南陽野生烏頭整株植物不同部位活性成分生物堿含量對比

從單酯型生物堿含量分析可知，南陽野生烏頭＞南陽野生附子＞須根＞地上部分（P＜0.05），含量比為2.48∶2.53∶1.79∶1。須根單酯型生物堿含量是南陽野生附子的72%，是南陽野生烏頭70%；地上部分單酯型生物堿含量是南陽野生附子40%，是南陽野生烏頭的39%。由實驗結(jié)果可以看出須根單酯型生物堿含量僅次于南陽野生附子、烏頭；地上部分單酯型生物堿含量不到南陽野生附子、烏頭的1/2。

從雙酯型生物堿含量分析可知，南陽野生附子＞須根＞南陽野生烏頭＞地上部分（P＜0.05）,含量比為2232∶2129∶430∶1。須根雙酯型生物堿含量是南陽野生附子的95%,是南陽野生烏頭的4.95倍；地上部分雙酯型生物堿含量是南陽野生附子的0.45%，是南陽野生烏頭的0.23%。須根雙酯型生物堿含量和附子相近，比南陽野生烏頭雙酯型生物堿含量還高出很多；地上部分雙酯型生物堿含量較少。

從總生物堿含量分析可知，南陽野生附子＞須根＞南陽野生烏頭＞地上部分（P＜0.05），含量比為30∶28∶8∶1。須根總生物堿含量是南陽野生附子的94%，須根總生物堿含量是南陽野生烏頭的370%。地上部分總生物堿含量是南陽野生附子的3%，地上部分總生物堿含量是南陽野生烏頭含量的13%。

3.3 南陽野生烏頭整株植物不同部位活性成分多糖含量對比

南陽野生烏頭不同部位的多糖含量：南陽野生附子＞南陽野生烏頭＞地上部分＞須根（P＜0.05），含量比為2.52∶2.05∶1.19∶1。從單因素方差分析結(jié)果來看，須根多糖含量是南陽野生附子的40%，是南陽野生烏頭的49%，是地上部分的84%。地上部分多糖含量是南陽野生附子的47%，是南陽野生烏頭的58%，是須根的119%。

4 結(jié)論與討論

分析對比結(jié)果可知，須根3種單酯型生物堿和3種雙酯型生物堿含量均和南陽野生附子相近，有很好的藥用價值。地上部分3種單酯型生物堿和3種雙酯型生物堿含量相對其他部位很低，但是其所含3種單酯型生物堿含量滿足2015版《中國藥典》不得少于0.010%的規(guī)定，3種雙酯型生物堿含量滿足2015版《中國藥典》不得過0.020%的規(guī)定，地上部分也有一定的藥用價值。

須根、地上部分多糖含量約是南陽野生附子和南陽野生烏頭的1/2，須根和地上部分多糖含量相近。呂永磊等[15]研究得須根中還含有甘露糖、鼠李糖、木糖是烏頭和附子不含有的，須根多糖含量不同，其臨床應(yīng)用可能與烏頭、附子也不同，有待結(jié)合藥理進(jìn)一步研究。地上部分多糖含量和須根相近，具體單糖組成及臨床應(yīng)用需進(jìn)一步研究。

單、雙酯型生物堿和多糖是烏頭和附子的有效成分，本實驗中南陽野生烏頭須根部位中單、雙酯型生物堿含量極高與南陽野生附子相近；南陽野生烏頭地上部分中單、雙酯型生物堿含量滿足2015版《中國藥典》中的要求；南陽野生烏頭須根部位和地上部位的多糖含量約是烏頭、附子的1/2，含量不及烏頭附子高但是其單糖組成和臨床應(yīng)用有待研究。這些說明須根和地上部位有一定的藥用價值，去除須根和地上部位會造成一定的資源浪費。通過南陽實地的采收發(fā)現(xiàn)，南陽江油須根在烏頭附子表面分布很密集。目前人們對須根和地上部位的認(rèn)識還不全面，張仲景對烏頭附子藥用過程中未有去除須根和地上部位的凈制過程，所以對2015版《中國藥典》中對烏頭附子規(guī)定的去除須根還需從化學(xué)成分、生物活性、藥理功效等做進(jìn)一步的研究，以確定是否需要去除須根和地上部位。現(xiàn)在我們?nèi)コ毟偷厣喜课坏淖龇〞斐梢欢ǖ馁Y源浪費。本研究對須根和地上部位的開發(fā)利用提供了有價值的參考。

表5 南陽烏頭不同部位的多糖含量（g/g）

圖8 南陽野生烏頭整株植物不同部位的多糖含量