原發(fā)性肝癌外周血免疫抑制細(xì)胞表達(dá)與中醫(yī)辨證關(guān)系＊

張 巍，邵明亮，苗同國(guó)，吳宗耀，王 蕊

（1.石家莊市第五醫(yī)院研究中心 石家莊 050000；2.河北中醫(yī)學(xué)院 石家莊 050000）

原發(fā)性肝癌（Primary liver cancer，PLC）是一種多因素綜合形成的惡性腫瘤之一，是世界范圍內(nèi)發(fā)病率第六位，死亡率第四位的腫瘤[1]。東亞地區(qū)病毒性肝炎（包括慢性乙型肝炎、丙型肝炎），脂肪性肝病構(gòu)成肝癌發(fā)病最重要的病原因素。慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染者經(jīng)過長(zhǎng)期抗病毒治療仍然不能徹底清除病毒，乙肝病毒進(jìn)一步整合到宿主基因，組形成共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），導(dǎo)致HBV感染慢性化，將近35%-60%風(fēng)險(xiǎn)發(fā)為乙型肝炎病毒相關(guān)肝硬化、肝功能衰竭和肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）。免疫功能調(diào)節(jié)與HBV感染控制及疾病進(jìn)展密切相關(guān)。免疫抑制細(xì)胞（MDSC）是一類的參與炎癥、腫瘤過程的重要免疫細(xì)胞，能夠強(qiáng)烈抑制細(xì)胞應(yīng)答功能,近年來成為研究腫瘤免疫逃逸中的作用的熱點(diǎn)[2]。

中醫(yī)根據(jù)肝癌主要的癥狀、體征及臨床發(fā)展過程，與“黃疸”、“脅痛”、“積聚”、“鼓脹”、“疫毒”、“郁證”、“肝瘟”、“血證”等病證的記載密切關(guān)聯(lián)[3]。“濕、熱、瘀、痰、毒、虛”構(gòu)成本病的病因，個(gè)體表現(xiàn)各異，呈現(xiàn)一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的發(fā)展過程，諸多醫(yī)家因此界定肝癌中醫(yī)基本證候?yàn)檠?、脾氣虛、肝膽濕熱、肝氣郁結(jié)、肝陰虛、腎陰虛的六證。肝癌病機(jī)包括肝郁、氣滯、脾虛、痰濕、血瘀、腎陰虛，隨著病情的加重，證型有所不同。肝癌隨著臨床分期以及病情的加重，證型表現(xiàn)為為肝郁脾虛證-氣滯血瘀證-濕瘀互結(jié)-肝腎陰虛證改變。我們長(zhǎng)期臨床觀察發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌屬本虛標(biāo)實(shí)之證，以正虛為本，血瘀濁毒壅絡(luò)為標(biāo)。素體本虛，邪氣則乘虛侵入而發(fā)病；病邪侵襲，又傷正氣，互為因果。病程初期邪毒內(nèi)蘊(yùn)侵及肝膽，導(dǎo)致肝失調(diào)達(dá)、肝失疏泄，繼則濕熱氣滯，濕、毒、痰、氣相互壅結(jié)，濕阻痰盛，痰氣郁滯，氣血不通，而致虛實(shí)夾雜之證[5]。關(guān)注臨床的腫瘤分期，腫瘤進(jìn)展相關(guān)的免疫機(jī)制、免疫分子表達(dá)與中醫(yī)辨證分型存在內(nèi)在的聯(lián)系，正是本課題的研究目的。旨在通過分析肝癌患者中醫(yī)辨證分型是否與MDSC表達(dá)以及相關(guān)免疫細(xì)胞、因子水平有關(guān)，便于盡早預(yù)警腫瘤病情進(jìn)展，提高患者生存率。

1 研究對(duì)象及方法

選取2011年5月至2015年1月于石家莊市第五醫(yī)院接受治療的HBV相關(guān)肝癌患者237例。其中男性151例，女性86例（性別比1.75∶1），年齡59.36±6.57歲（30-77歲）；按照BCLC分期A期98例，B期139例。所有病例均為初診病例，未采用抗腫瘤治療。

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

①診斷符合原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2011年版）[4]；②病例資料記錄完整者；③患者可以持續(xù)隨訪者。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

①非原發(fā)性性肝癌的患者：如肉瘤、惡性淋巴瘤、轉(zhuǎn)移性肝癌等；②臟器功能嚴(yán)重衰竭，頑固性大量腹水，明顯的惡液質(zhì)，意識(shí)障礙等已不再適合治療的患者；③病例資料記錄不完善者；④患者無法再次隨訪者。

1.3 主要試劑和儀器

人淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll）購(gòu)于天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?；FBS購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，人單克隆熒光抗體CD33-PE-Cy5購(gòu)于美國(guó)Biolegend公司，CDll b/Mac-1-PE-Cy7、HLA—DR-APC、CDl4-F1TC、CD3-FITC、CD4-PE-Cy5、CD8-PE-Cy7、同型對(duì)照抗體均購(gòu)于美國(guó)BD公司；Centrifuge 5810R臺(tái)式高速離心機(jī)，購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司；BD FACS TM流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.4 外周血分離PBMC及抗體標(biāo)記

術(shù)后6個(gè)月抽取患者外周靜脈血10 mL血于EDTA抗凝管，2 h內(nèi)18℃2000 r·min-1（離心半徑9.5 cm）離心8 min。取血細(xì)胞加PBS稀釋至18 mL，分兩支管，每只管加4.5 mL Ficoll，將稀釋的血細(xì)胞緩慢加到Ficol液面上方，18℃2000 r·min-1（離心半徑9.5 cm）離心20 min。

吸取100 mL細(xì)胞懸液于流式管中，加入單克隆熒光抗CD33-PE-Cy5 5 μL、CD11b／Ma-1-PE-Cy7 5 μL、HLA-DR—APC 20 μL、CDl4一FITC 20 μL，同型對(duì)照管中加入同型對(duì)照抗體防止非特異性染色。輕彈流式管管底，混勻細(xì)胞與抗體，置于冰上避光溫育30 min后，加PBS洗滌細(xì)胞2次，1500 r·min-1（離心半徑9.5 cm）離心6 min。棄上清液，加300 μL PBS重懸細(xì)胞，再用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MDSC在單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)頻率。

1.5 HBV免疫學(xué)、腫瘤標(biāo)志物檢查

乙肝五項(xiàng)定量采用上海實(shí)業(yè)科華生物技術(shù)有限公司試劑盒常規(guī)酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)。HBV-DNA檢測(cè)采用羅氏公司熒光定量PCR法，檢測(cè)靈敏度為＞500IU/L。AFP采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，正常值＜10 mg·L-1。

1.6 Child-pugh評(píng)分

Child-pugh評(píng)分以ALB＞35 g·L-1（1分），Tbil＜34.2 μmol（1分），無腹水（1分），凝血時(shí)間延長(zhǎng)1-3 s（1分），無肝性腦?。?分），總分＜6分為A級(jí)，7-9分為B級(jí)，＞10分為C級(jí)。

1.7 中醫(yī)臨床癥狀分型

腫瘤相關(guān)體格檢查，如：是否伴肝區(qū)疼痛、消瘦乏力、伴發(fā)腹水、肝性腦病、黃疸等；中醫(yī)分型標(biāo)準(zhǔn)參考衛(wèi)生部年頒發(fā)的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行》標(biāo)準(zhǔn)[6]，脾虛證：神疲乏力，納呆食少，腹脹，腹瀉，舌淡，有齒痕，脈細(xì)弦。肝郁：情緒激動(dòng)，脈弦，噯氣不爽，矢氣較多；氣滯證：右脅悶脹竄痛，胸悶，易怒，右脅助下痞塊舌苔薄膩，脈弦。血瘀證：脅痛引背，納差食少，便血，腹內(nèi)包塊，痛處不移，拒按，形體消瘦，舌質(zhì)紫暗，脈沉細(xì)。陰虛證：腰膝酸軟，五心煩熱，排便困難，舌紅少苔，脈細(xì)而數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

患者基線臨床資料應(yīng)用描述性分析，組間計(jì)數(shù)資料比較Fisher精確概率法，計(jì)量資料進(jìn)行Shapiro-Wilk正態(tài)分布檢驗(yàn)，用χ±s表示。非正態(tài)分布組間比較用秩和檢驗(yàn)。采用SPSS17.0錄入數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 患者的基線資料

對(duì)入組患者的情況統(tǒng)計(jì)資料（表1），男性患者（63.71%），年齡≥60歲（53.59%），具有肝癌家族史占（54.85%），Child-pugh B期占55.7%，肝硬化代償期占（72.99%），未發(fā)生乙肝血清學(xué)轉(zhuǎn)換占（77.63%），AFP ≥ 400 ng?mL-1占（56.55%）。

表1 237例原發(fā)性肝癌患者一般資料

表2 肝癌患者不同證型影響MDSC分析

表3 肝癌患者中醫(yī)證型影響Th1/Th2分析

表4 肝癌患者IL-12/IL-4表達(dá)分析

2.2 肝癌患者不同證型影響MDSC分析

肝癌早期氣滯血瘀證MDSC（24.21%）明顯高于肝郁脾虛證（5.54%）差異具有顯著性（Χ2=11.544，P＜0.05）（表2）。肝癌進(jìn)展期濕瘀互結(jié)證MDSC（21.03%）表達(dá)高于肝腎陰虛證（5.10%）差異具有顯著性（Χ2=8.223，P ＜ 0.005）

2.3 肝癌患者中醫(yī)證型影響Th1/Th2分析

氣滯血瘀證Th2表達(dá)高于肝郁脾虛組，組間比較具有顯著性差異（t=10.341，P ＜ 0.05）（表3）。濕瘀互結(jié)證Th2表達(dá)高于肝腎陰虛組，組間比較具有顯著性差異（t=16.307，P ＜ 0.01）。

2.4 肝癌患者中醫(yī)證型影響IL-12/IL-4表達(dá)分析

氣滯血瘀組IL-4（121.70±6.22）高于肝郁脾虛組（76.57±5.01）；組間比較具有顯著性差異（t=21.414，P ＜ 0.05）（表4）。肝腎陰虛組IL-4（375.12± 5.31）高于濕瘀互結(jié)（115.46±4.15）組間比較具有顯著性差異（t=12.455，P ＜0.05）。肝腎陰虛組IL-12（36.15±4.43）低于肝郁脾虛組（70.43±2.49），組間比較具有顯著性差異（t=19.050，P＜0.05）。

3 討論

《內(nèi)經(jīng)》云：“正氣存內(nèi)，邪不可干”，“邪之所湊，其氣必虛”。《靈樞·百病始生》日：“虛邪之中人也……．留而不去，息而成積，或著孫絡(luò)，或著輸脈，或著于伏沖之脈，或著于膂筋，或著于胃腸之募原，上連于緩筋，邪氣淫溢，不可勝論?！蓖庑爸阅芮秩?；而對(duì)人體而致瘤，關(guān)鍵還在于正虛，可見正氣是維系人體正常生命活動(dòng)、抗御外邪及防治疾病的基本物質(zhì)。原發(fā)性肝癌發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，病情發(fā)展與固有免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)異常均有關(guān)[7]。本研究結(jié)果顯示，肝癌患者氣滯血瘀證MDSC（24.21%）明顯高于肝郁脾虛（5.54%），肝癌進(jìn)展期（＞5 cm）濕瘀互結(jié)MDSC（21.03%）表達(dá)高于肝腎陰虛（5.10%）。同類研究顯示，肝癌患者進(jìn)行短期隨訪觀察后發(fā)現(xiàn)，外周血MDSC頻率與患者病死率有關(guān)，可作為預(yù)測(cè)該類患者病死率潛在的指標(biāo)。提示肝癌增殖過程中，突破細(xì)胞免疫防御同時(shí)[8]，“形諸于外”在中醫(yī)體征上，發(fā)生辨證的改變，證實(shí)辨證分型更替具備免疫調(diào)節(jié)基礎(chǔ)。

長(zhǎng)期的慢性病毒性肝炎以及肝硬化病史致使肝癌患者肝臟內(nèi)環(huán)境長(zhǎng)期處于慢性炎癥的狀態(tài)，殺傷性T細(xì)胞被大量耗竭，肝臟處于免疫抑制狀態(tài)。多種免疫細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、DC、Thl7細(xì)胞、Treg均被認(rèn)為在HBV相關(guān)肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要的作用[9]。原發(fā)性肝癌患者血清中展期肝癌組患者M(jìn)DSC的比例明顯高，Th1相關(guān)細(xì)胞因子IL-12、IL-2、IFN-γ的濃度明顯升高，Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4的水平顯著升高。

MDSC分為兩個(gè)亞型，即粒細(xì)胞樣MDSC（G-MDSC）和單核細(xì)胞樣MDSC（M-MDSC）。在早期腫瘤發(fā)生階段，MDSC具有抗腫瘤免疫效果，進(jìn)展期則轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤免疫抑制，進(jìn)而發(fā)揮負(fù)性作用[10]。多項(xiàng)研究證實(shí)，多個(gè)器官來源腫瘤細(xì)胞及骨髓來源細(xì)胞分泌的酶類通過MDSC有促進(jìn)腫瘤的惡性化和侵襲（invasion）的作用[11]。一方面腫瘤細(xì)胞的生命活動(dòng)受到周圍“新生的”微環(huán)境中因子的調(diào)控，另一方面腫瘤細(xì)胞也通過自身的分泌活動(dòng)影響周圍的微環(huán)境。MDSC具有明顯的免疫抑制功能，不僅能夠抑制機(jī)體自身的抗腫瘤免疫，還可能削弱免疫治療的效果。MDSC可能通過抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)促進(jìn)了原發(fā)性肝癌的發(fā)生和進(jìn)展。MDSC調(diào)節(jié)腫瘤免疫紊亂機(jī)制表現(xiàn)為：①M(fèi)DSC通過募集前列腺素E、干細(xì)胞因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、IL-6等細(xì)胞因子誘導(dǎo)活化T淋巴細(xì)胞；②經(jīng)過γ-干擾素、IL-4、IL-10、TGF等細(xì)胞因子激活后，通過分泌精氨酸酶1（Ar91）與一氧化氮合成酶，或誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生；③同時(shí)產(chǎn)生大量活性氧自由基和氧化亞硝酸鹽，抑制T淋巴細(xì)胞功能，發(fā)揮間接免疫抑制作用。細(xì)胞因子的“級(jí)聯(lián)激活”，造成全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），患者機(jī)體存在類敗血癥樣的免疫麻痹現(xiàn)象，導(dǎo)致細(xì)胞免疫抑制[12]。

本研究進(jìn)一步分析，氣滯血瘀證組Th2表達(dá)高于肝郁脾虛組，濕瘀互結(jié)Th2表達(dá)高于肝腎陰虛組。氣滯血瘀組IL-4（121.70±6.22）高于肝郁脾虛組（76.57±5.01）肝腎陰虛證組IL-4（375.12±5.31）高于濕瘀互結(jié)組（115.46±4.15）組間比較具有顯著性差異。相關(guān)研究證實(shí)代謝性肝病中氣陰兩虛證IL-4高于痰濁遏阻證，痰濁遏阻證Th1/Th2高于氣陰兩虛證組，細(xì)胞免疫通過多種免疫相關(guān)機(jī)制參與肝臟病理生理功能調(diào)節(jié)[13]。T細(xì)胞亞群是反映機(jī)體免疫功能的主要標(biāo)志，腫瘤細(xì)胞可直接激活或誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞，使其含量上升抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+比值均下降。當(dāng)機(jī)體免疫功能降低，腫瘤細(xì)胞得以逃避免疫監(jiān)視而呈進(jìn)行性生長(zhǎng)。

在肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展過程中存在Th1/Th2比值下降Th2型細(xì)胞功能亢進(jìn)而合成分泌大量的抑制性細(xì)胞因子，直接導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降，該比值及對(duì)應(yīng)的指標(biāo)在兩組人群中的差別表明肝癌的發(fā)生與機(jī)體免疫功能有密切關(guān)系IL-4主要由Th2細(xì)胞分泌，隨患者病情進(jìn)展而逐漸升高，調(diào)控體液免疫反應(yīng)，IL-4能增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的免疫原性，更有效地激活特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，能上調(diào)肝癌細(xì)胞ICAM-1表達(dá)，下調(diào)肝癌細(xì)胞表面CIM4的表達(dá)，與細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸、膠原蛋白、纖黏蛋白、層黏蛋白等基質(zhì)分子結(jié)合，參與細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)。與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合，啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，并抑制肝癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分纖維連接蛋白和Ⅳ型膠原的親和力[14]。

本研究揭示在氣滯血瘀組中IL-4與痰濕、血瘀體征密切有關(guān)，推斷在腫瘤局部具有微小栓塞形成保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)的攻擊，提高腫瘤細(xì)胞在血管內(nèi)皮上黏附的效率，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞成功外滲進(jìn)入遠(yuǎn)端組織與組織內(nèi)環(huán)境相互作用。多數(shù)研究認(rèn)為原發(fā)性肝癌患者體內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的失衡是肝癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制之一[15]。隨著對(duì)細(xì)胞因子在原發(fā)性肝癌中作用機(jī)制的研究逐步深入，腫瘤炎性微環(huán)境中存在大量細(xì)胞因子，如IL-1、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-17、IL-10和TGF-β等。它們不僅可以引起血管擴(kuò)張，募集炎性細(xì)胞到腫瘤部位，放大炎癥效應(yīng)，還可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，刺激血管、淋巴管生成以及促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移示。

血清IL-2、IL-4濃度的動(dòng)態(tài)變化可反映原發(fā)性肝癌的發(fā)生及發(fā)展過程，為原發(fā)性肝癌療效及預(yù)后評(píng)估提供重要依據(jù)16。IL-12主要由活化的巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，促使NK細(xì)胞活性增加，淋巴細(xì)胞數(shù)量的上升，與靶細(xì)胞的結(jié)合力增加，清除肝炎病毒，但同時(shí)也導(dǎo)致免疫損傷，影響趨化因子炎性局部浸潤(rùn)。IL-12增強(qiáng)免疫防御效應(yīng)，相對(duì)正常健康者，慢性肝炎、肝肝硬化患者顯著上升。癌癥患者體內(nèi)IL-12能夠刺激NK細(xì)胞的增殖，在腫瘤免疫中起到重要作用。IL-12水平升高調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌患者Th1細(xì)胞功能降低和Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)現(xiàn)象，而這將導(dǎo)致患者機(jī)體免疫功能降低，并引起腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。

中醫(yī)腫瘤學(xué)臨床實(shí)踐是典型的實(shí)施個(gè)體化醫(yī)療的過程，體現(xiàn)在由復(fù)雜的外在局部的病變表現(xiàn)結(jié)合整體推斷內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行辨證論治，證候是辨證論治的核心，抓住證候才能推出治法，指導(dǎo)組方用藥，實(shí)現(xiàn)腫瘤個(gè)體化治療。但是中醫(yī)辨證又是參雜醫(yī)者一個(gè)的主觀實(shí)踐過程，在某種程度上會(huì)受到就診當(dāng)時(shí)人為因素的影響，中醫(yī)證候確立客觀化依據(jù)、量化指標(biāo)仍缺乏。因此，對(duì)肝癌證候的生物學(xué)標(biāo)志和分子免疫學(xué)甄別確定尤其重要?？偨Y(jié)上述研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)氣滯血瘀證、肝腎陰虛證存在明顯的細(xì)胞免疫功能抑制，通過MDSC調(diào)節(jié)IL-4表達(dá)，上調(diào)Th2細(xì)胞，參與腫瘤增殖，侵襲，轉(zhuǎn)移過程。可以推斷肝癌的體征變化導(dǎo)致了MDSC細(xì)胞免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)通過參與分子水平的變化，進(jìn)一步觀察免疫分子、細(xì)胞變化深入研究各個(gè)證型的演變機(jī)制，提高中 醫(yī)辨證的精確性具有重要的臨床價(jià)值。