EI注射液對鵝膏蕈氨酸基底核微量注射癡呆模型大鼠ATP/AMP及PI3K/AKT信號通路的影響＊

夏 鵬，鄭 航，秦莉霞，魏江平，高麗娟，申重陽，徐世軍＊＊

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腦病藥物整合轉(zhuǎn)化研究所成都 611137；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 成都 611137）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's Disease，AD）是老年癡呆的主要類型，其發(fā)病機制復(fù)雜、病理進程多變，面臨著治療和診斷的雙重挑戰(zhàn)。大量研究顯示AD發(fā)病過程中伴隨著明顯的葡萄糖利用率降低和胰島素抵抗，故本病有3型糖尿病之稱[1,2]。胰島素信號級聯(lián)參與AD病程多種病理過程[3]，磷脂?；?激酶/蛋白激酶B（Phosphatidyl alcohol kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）信號通路作為胰島素代謝的關(guān)鍵信號通路，參與調(diào)節(jié)葡萄糖攝取[4]。大腦是人體的高耗能器官[5,6]，基于其對能量的高需求及高敏感性，使得大腦很易受到缺血等外部損傷的危害[7]。葡萄糖是大腦重要的能量物質(zhì)，主要通過三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic Aic Cycle，TCA）等氧化分解代謝過程釋放三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP），為維持神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞功能及腦穩(wěn)態(tài)提供能量[6,8]。研究表明AD病理進程中伴隨著明顯的能量代謝障礙[9,10]。二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate，ADP）和 一 磷 酸 腺 苷（Adenosine Monophosphate，AMP）是ATP的代謝產(chǎn)物。ATP含量[11]、ADP/ATP 比值[12]、ATP/AMP[13]比值與葡萄糖代謝、AD病程密切相關(guān)[14]。EI注射液是一溫里藥活性成分制備而成的注射劑，前期預(yù)實驗顯示有一定的抗AD作用，但其對AD模型大鼠腦能量代謝的影響還未涉及。

1 材料

1.1 藥物與試劑

EI注射液活性成分，成都瑞特恩科技有限公司，批號：RL20140828；鵝膏蕈氨酸（IBO），Cayman，批號：14584；安理申，衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，批號：1511049；三磷酸腺苷二鈉（ATP），Sigma，批號：1001665433；二磷酸腺苷二鈉（ADP），Sigma，批號：1001726877；單磷酸腺苷二鈉（AMP），Sigma，批號：101606467；Rat Insulin 試劑盒，ExCell Bio，批號：21G286；PI3K 一抗，Cell Signaling Technology，批號：4257S；AKT一抗，Cell Signaling Technology批號：4685S；p-PI3K一抗，Cell Signaling Technology批號：4228S；p-AKT一抗，批號：4060S。

1.2 動物

SPF級，SD大鼠65只，雄性，體質(zhì)量240-300 g，由成都達碩生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK（川）2015-030，合格證號：51203500001591。

1.3 儀器

DW-5大鼠腦立體定位儀（成都泰盟）；Etho Vision Morris水迷宮分析系統(tǒng)（荷蘭，Noldus）；ODSHYPERSIL C18色譜柱（thermo）；1260高效液相色譜儀（Agilent）；3001酶標(biāo)儀（thermo electron corporation）；Champchemi 610Plus全自動多色熒光及化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）。

2 方法

2.1 動物造模與分組

根據(jù)文獻制備雙側(cè)基底核注射IBO擬癡呆模型[15]。假手術(shù)組除基底核注射無菌生理鹽水外，其他操作同造模。取造模大鼠32只，隨機分為模型組、安理申組（1.4 mg·kg-1）、EI高劑量組（2 mg·kg-1）、EI低劑量組（1 mg·kg-1），每組8只，取假手術(shù)大鼠8只為對照組。各組動物尾靜脈注射等體積相應(yīng)藥物（2 mL·kg-1），假手術(shù)組和模型組動物給予等體積生理鹽水（2 mL·kg-1）。每天一次，連續(xù)8周。

2.2 學(xué)習(xí)記憶功能測定

給藥50天開始，進行Morris水迷宮檢測[16]，期間繼續(xù)給藥。連續(xù)訓(xùn)練5天，記錄各組動物逃避潛伏期，定向航行實驗結(jié)束24 h后撤去平臺，進行空間探索實驗，記錄各動物穿越平臺目標(biāo)象限的時間、穿越平臺目標(biāo)象限的次數(shù)、穿越平臺次數(shù)及穿越平臺區(qū)域次數(shù)。

2.3 海馬及大腦皮層剛果紅染色檢測

Morris水迷宮檢測后，處死大鼠。分離腦組織，10%多聚甲醛固定、脫水、包埋、5μm切片、染色，鏡下觀察海馬及皮層的神經(jīng)細胞形態(tài)及Aβ沉積。

2.4 大鼠腦能量檢測

冰上分離腦組織，制樣、檢測腦組織ATP、ADP、AMP含量[17]。

2.5 腦組織胰島素含量的測定

胰島素檢測嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進行。

2.6 大鼠腦組織PI3K和AKT蛋白表達

取腦組織，制樣、凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗室溫孵育90 min，TBST洗膜。ECL化學(xué)發(fā)光顯色后分析各蛋白相對表達量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，Morris水迷宮逃避潛伏期用雙因素方差分析，其余符合正太分布數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用兩個獨立樣本t檢驗進行分析。

3 結(jié)果

3.1 EI注射液對IBO擬癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組動物逃避潛伏期均有不同程度的縮短（圖1）。與空白組相比，模型組動物逃避潛伏期明顯延長（F=32.92；P=0.0012），穿越平臺象限時間明顯縮短（P＜0.05）、穿越平臺次數(shù)、穿越平臺區(qū)域次數(shù)明顯縮短（P＜0.05）；與模型組相比，EI注射液高劑量組逃避潛伏期明顯縮短（F=9.812；P=0.0203），EI注射液低劑量組逃避潛伏期明顯縮短（F=20.61；P=0.0039），穿越平臺象限時間顯著延長（P＜0.05），穿越平臺次數(shù)和穿越平臺區(qū)域次數(shù)有增加趨勢但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

3.2 EI注射液對IBO擬癡呆模型大鼠海馬組織病理學(xué)及Aβ斑塊沉積的影響

模型組動物海馬CA1區(qū)及皮質(zhì)區(qū)均可見磚紅色染色深，β淀粉樣蛋白沉積分布廣泛，錐體細胞排列紊亂稀疏、細胞數(shù)量減少并伴隨細胞固縮；與模型組相比，EI注射液各劑量組海馬CA1區(qū)和皮質(zhì)區(qū)磚紅色染色減輕，β淀粉樣蛋白沉積減少，錐體細胞排列整齊、細胞數(shù)量增加（圖2，圖3）。

圖1 EI注射液對IBO模型大鼠Morris水迷宮的影響

3.3 EI注射液對IBO擬癡呆模型大鼠腦ADP/ATP和ATP/AMP的影響

由圖4可知，與空白組比較，模型組動物腦組織ATP/AMP明顯降低（P＜0.05）；ADP/ATP無明顯趨勢；與模型組相比，EI注射液各劑量組ATP/AMP明顯升高（P＜0.05），ADP/ATP無明顯趨勢。

3.4 EI注射液對IBO擬癡呆模型大鼠腦胰島素含量的影響

與空白組比較，模型組腦組織內(nèi)胰島素含量明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，EI注射液各劑量組胰島素含量明顯增高（P＜0.05）（圖5）。

3.5 EI注射液對IBO擬癡呆模型大鼠腦PI3K、AKT的影響

由圖5可知，與空白組比較，模型組腦PI3K和AKT蛋白呈低表達（P＞ 0.05）；與模型組相比，EI注射液干預(yù)組腦組織內(nèi)PI3K和AKT蛋白表達有激活趨勢（P＞0.05）。

4 討論

圖2 EI注射液對IBO模型大鼠海馬CA1區(qū)病理形態(tài)學(xué)的影響

圖4 EI注射液對IBO模型大鼠腦ADP/ATP、ATP/AMP的影響

AD是主要的老年癡呆病癥，其發(fā)病機制除Aβ級聯(lián)假說、Tau蛋白假說、氧化應(yīng)激等外，能量代謝障礙也扮演著重要角色。EI注射液是從某溫中中藥中提取的活性成分制備而成的注射劑。部分溫?zé)嵝灾兴幖捌浠钚猿煞直粓蟮揽娠@著改善多種疾病模型動物能量代謝障礙[18-21]。IBO是一種強烈的神經(jīng)毒素，腦內(nèi)注射可對大鼠造成嚴(yán)重的認知功能障礙等一系列擬AD病變[22]，從而被應(yīng)用于AD造模，本實驗結(jié)果也顯示該模型大鼠出現(xiàn)明顯的記憶障礙，而經(jīng)EI注射液干預(yù)后其認知記憶障礙得到明顯改善。ATP是大腦的主要能量來源，主要由葡萄糖經(jīng)TCA代謝提供[23]。胰島素是葡萄糖代謝的重要把控因子，研究發(fā)現(xiàn)AD病程中出現(xiàn)明顯的葡萄糖利用率降低和胰島素抵抗[24]。本實驗顯示IBO模型大鼠腦內(nèi)胰島素含量、ATP/AMP比值顯著降低，提示能量代謝不足，經(jīng)EI注射液干預(yù)后，該模型大鼠腦內(nèi)胰島素、ATP/AMP比值顯著上調(diào)，提示EI注射液可調(diào)節(jié)該模型大鼠腦內(nèi)能量代謝。PI3K/AKT信號通路是調(diào)節(jié)胰島素代謝的重要信號因子[4]，同時研究顯示該信號通路參與調(diào)節(jié)認知功能障礙和突觸功能障礙等AD相關(guān)病程[25]。本實驗結(jié)果顯示IBO模型大鼠腦內(nèi)PI3K/AKT蛋白表達呈抑制趨勢，但未見顯著統(tǒng)計學(xué)差異，提示EI注射液調(diào)節(jié)AD模型大鼠腦能量代謝可能與胰島素代謝其他機制相關(guān)，。綜上，本實驗結(jié)果顯示，EI注射液可改善IBO模型大鼠認知功能障礙，其可能機制與調(diào)節(jié)該模型大鼠腦內(nèi)胰島素能量代謝有關(guān)，但其如何調(diào)節(jié)該AD模型大鼠腦能量代謝還有待后續(xù)進一步研究。

圖5 EI注射液對IBO模型大鼠腦胰島素含量的影響

圖6 EI注射液對IBO模型大鼠腦PI3K/AKT信號通路的影響