斷體地龍促進(jìn)創(chuàng)傷愈合活性成分篩選研究

段曉杰，楊雨薇，賡迪，羅世林，王雄飛，丁玉婷，鄭竹宏，趙仁云，孫毅坤

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488)

據(jù)一項最新研究報道，創(chuàng)傷已成為中國除腦中風(fēng)和冠心病之后的第三大死亡原因[1]。可見創(chuàng)傷已嚴(yán)重威脅到了國人身體健康[2]，需引起高度重視。而傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療創(chuàng)傷愈合方面有著自身獨特的優(yōu)勢。地龍，又名“蚯蚓”，作為傳統(tǒng)中藥，在我國應(yīng)用已有上千年歷史。地龍主要含有酶類、蛋白質(zhì)、多肽、脂類及微量元素等，有抗凝血、抗血栓、降壓、抗腫瘤[3]、解熱抗炎鎮(zhèn)痛、加速傷口愈合等作用[4]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，斷體三天的地龍?zhí)崛∫汉写龠M(jìn)創(chuàng)傷愈合的物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)鹽析后得到的飽和度為45%～60%的組分活性最強，本實驗將采用DEAE-Sepharose Fast Flow對該組分進(jìn)行進(jìn)一步分離，并通過測定其對NIH3T3增殖作用的影響篩選活性較強組分，為探討斷體地龍促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的活性成分奠定基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

核酸蛋白酶檢測儀(HD-4，上海滬西分析儀器有限公司);pHS-3C型酸度計(上海偉業(yè)儀器廠);萬分之一天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司);紫外分光光度計(TU-1901，北京普析通用儀器有限公司);潔凈工作臺(HD-1360，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);血球計數(shù)板(上海市求精生化試劑儀器有限公司);細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific);倒置顯微鏡(OPTEC BDS200，重慶市奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司);離心機(Anke TDL-50B，上海安亭科學(xué)儀器廠);酶標(biāo)儀(ELX800，湘智離心機廠)。

1.2 實驗藥材與試劑

鹽酸(分析純，北京化工廠);Tris(C4H11NO3，AMRESCO);氯化鈉(NaCl，分析純，北京化工廠);牛血清白蛋白(AMERSCO);考馬斯亮藍(lán)G-250(北京欣經(jīng)科生物);DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司);Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒，日本同仁化學(xué)公司);bFGF(美國Peprotech);雙抗(北京拜耳迪生物科技有限公司);胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司);0.25%Trypsin-EDTA(GIBCO公司);25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(corning公司);無菌0.22 μm過濾膜等。

赤子愛勝蚓(天津市東麗區(qū)成功蚯蚓養(yǎng)殖場);NIH3T3(北京協(xié)和細(xì)胞資源中心)。

2 實驗方法

2.1 DEAE-Sepharose Fast Flow分離蛋白

采用濕法裝柱[5]將DEAE-Sepharose Fast Flow裝入處理好的層析柱(2.0 cm×17 cm)中，裝好的層析柱用10倍量的平衡緩沖液(pH 7.5[6]，0.01 M Tris HCl溶液)充分平衡。樣品經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上樣，先后用0.1～0.5 M NaCl溶液梯度洗脫，流速為1 mL/min，檢測波長為280 nm，收集各信號峰的洗脫液，低溫透析后于-20℃保存。

2.2 蛋白含量測定

采用Bradford法測定蛋白濃度。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，加入適量考馬斯亮藍(lán)染液和去離子水，配制濃度分別為0、3.7、7.4、11.1、14.8、18.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，分別于595 nm波長處測定吸光度值。分別取200 μL的1～5號洗脫液，用去離子水稀釋至1 mL后加入適量染液，用紫外分光光度計測定吸光度。

2.3 活性組分篩選

2.3.1 NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)

“速融法”復(fù)蘇NIH3T3細(xì)胞，用DMEM高糖完全培養(yǎng)液(含10%的胎牛血清、1%的雙抗)于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞鋪滿80%～90%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.3.2 分組與給藥方法

實驗分為給藥組(1～5號給藥組)、陰性對照組和陽性對照組。給藥組加入含有一定濃度藥物的完全培養(yǎng)液，每組均設(shè)六個蛋白濃度(分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3 μg/mL)，陰性對照組只加完全培養(yǎng)液，陽性對照組加含有0.1 μg/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的完全培養(yǎng)液，每組設(shè)3個復(fù)孔，另設(shè)調(diào)零孔。

細(xì)胞生長至對數(shù)期后進(jìn)行傳代，Trypan Blue法計數(shù)后將細(xì)胞稀釋至一定濃度，吹打均勻，使得每100 μL含有5 000個左右細(xì)胞。按照每孔100 μL將細(xì)胞接種到96孔板上，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出培養(yǎng)板，棄去舊的培養(yǎng)液，分別加入等量的新鮮的含藥培養(yǎng)液、完全培養(yǎng)液及含有bFGF的完全培養(yǎng)液。給藥后將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3.3 CCK-8法測定細(xì)胞增殖率

給藥48 h后，取出培養(yǎng)板，同時按照一定比例配制含有CCK-8的完全培養(yǎng)液。棄去舊的培養(yǎng)液，每孔加入含有CCK-8的完全培養(yǎng)液110 μL(含DMEM完全培養(yǎng)液100 μL，CCK-8溶液10 μL)。在培養(yǎng)箱中孵育1.5 h后用酶標(biāo)儀測定吸光度，計算增殖率。陰性對照組以100%計。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0軟件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分

3 實驗結(jié)果

3.1 DEAE-Sepharose Fast Flow洗脫圖譜

樣品經(jīng)陰離子交換層析分離結(jié)果見圖1。由圖1可知，用0.1 M～0.5 M NaCl溶液梯度洗脫后，一共得到5個洗脫峰(每個濃度均得到一個洗脫峰)。

圖1 離子交換層析洗脫圖譜注：1：0.1 M NaCl 洗脫峰；2：0.2 M NaCl 洗脫峰；3：0.3 M NaCl 洗脫峰；4：0.4 M NaCl 洗脫峰；5：0.5 M NaCl 洗脫峰

3.2 不同洗脫液的蛋白含量

以牛血清白蛋白濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，得回歸方程A=15.598C+0.02(R=0.988 3)。經(jīng)計算得1～5號洗脫液蛋白濃度分別為0.137、0.150、0.154、0.127、0.165 mg/mL。由此可見各洗脫峰蛋白含量差異較小，峰4含量較低，峰5含量相對較高。

3.3 不同洗脫液對NIH3T3細(xì)胞增殖率的影響

洗脫液對NIH3T3細(xì)胞增殖作用的影響見表1。由表1可知，在一定濃度下，各洗脫液對NIH3T3細(xì)胞均有促進(jìn)增殖的作用，陽性對照組(bFGF)與實驗組、陰性對照組相比具有顯著性差異。當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?.5 μg/mL時，各組細(xì)胞增殖率達(dá)到最大值，分別為115.39%、115.78%、124.99%、121.58%和109.34%。

表1 不同離子交換成分對NIH3T3增殖率的影響

注：與陰性對照組比較，#P<0.05,##P<0.01

根據(jù)表1繪制各實驗組細(xì)胞增殖率曲線圖，見圖2。由圖2可看出，各實驗組細(xì)胞增殖率呈現(xiàn)相近的趨勢，在蛋白濃度≤1.5 μg/mL時細(xì)胞增殖率均隨著蛋白濃度的升高而增大，之后隨著蛋白濃度的升高增殖率呈下降趨勢。其中2、4、5號洗脫液組在蛋白濃度高于2.5 μg/mL時呈現(xiàn)細(xì)胞生長抑制的現(xiàn)象。當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?.5 μg/mL時，各組細(xì)胞增殖率均達(dá)到最大值，其中3號洗脫液組增殖率最大，且該組在各蛋白濃度下對細(xì)胞增殖促進(jìn)作用較穩(wěn)定。

圖2 不同洗脫液促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞的增殖率曲線

4 討論

創(chuàng)傷愈合主要包括三個階段：炎癥期、肉芽組織形成期和瘢痕形成期[7]。成纖維細(xì)胞是肉芽組織形成的關(guān)鍵細(xì)胞，其增殖可認(rèn)為是組織形成的先兆[8]。而bFGF能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖分化[9],因此實驗中以bFGF為陽性對照，通過觀察實驗組對成纖維細(xì)胞增殖作用的影響來篩選提取液中促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的活性成分。

本實驗是將課題組前期得到的活性組分通過DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱進(jìn)行純化，采用不同濃度的NaCl溶液梯度洗脫先后得到5個洗脫液。對蛋白進(jìn)行含量測定后，采用不同濃度的各洗脫液作用于NIH3T3細(xì)胞，并通過CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3號洗脫液對細(xì)胞增殖促進(jìn)作用最強，且促增殖作用呈濃度依賴關(guān)系，但蛋白濃度過高時細(xì)胞生長呈現(xiàn)抑制作用。表明其可能含有促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的成分，后期可結(jié)合凝膠過濾層析和SDS-PAGE對活性蛋白進(jìn)行純化研究。

本研究通過NIH3T3增殖實驗篩選促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的活性成分，尚有不足之處，其體內(nèi)活性及具體作用機制尚不明確，有待進(jìn)一步的探討。

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