Ubc9在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與化療藥物敏感性之間的關(guān)系

張建偉+鄭繪霞+梁建芳+肖虹

【摘要】 目的：研究小泛素相關(guān)修飾物泛素結(jié)合酶9（Ubc9）在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與化療藥物敏感性之間的關(guān)系。方法：收集手術(shù)切除的結(jié)直腸癌及癌旁新鮮標(biāo)本50例，腺瘤30例，免疫組化法檢測Ubc9蛋白的表達(dá)，分析其表達(dá)與患者臨床病理資料的關(guān)系。原代培養(yǎng)結(jié)直腸癌細(xì)胞，MTT法檢測不同結(jié)直腸癌組織對順鉑及5-氟尿嘧啶的藥物敏感性，分析Ubc9蛋白的表達(dá)與藥物敏感性之間的關(guān)系。結(jié)果：Ubc9在結(jié)直腸癌中的表達(dá)均顯著高于癌旁和腺瘤組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；Ubc9蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡及分化程度均無關(guān)（P>0.05），與腫瘤的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)（P<0.05）；Ubc9蛋白的高表達(dá)與順鉑的耐藥呈正相關(guān)（r=0.323，P<0.05），Ubc9蛋白的表達(dá)與5-氟尿嘧啶藥物敏感性無顯著相關(guān)性（r=0.283，P>0.05）。結(jié)論：Ubc9蛋白在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，與患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與順鉑的耐藥性呈正相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 結(jié)直腸癌； 泛素結(jié)合酶9； 免疫組織化學(xué)

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of ubiquitin-conjugating enzyme 9（Ubc9） in colorectal adenocarcinoma，and its relationship with the clinicopathological features and sensitivity of chemotherapeutic drugs.Method：The expression of Ubc9 in 50 colorectal adenocarcinoma，paracancerous specimens and 30 adenoma were detected by immunocytochemistry，and the sensitivities of the tumor to Cisplatin and 5-fluorouracil chemotherapeutic drugs were detected by MTT assay.Result：Ubc9 protein expression in colorectal adenocarcinoma was significantly higher than those in paracancerous and adenoma specimens（P<0.05）.The expression of Ubc9 was correlated with TNM stage and lymph node memtastasis（P<0.05），but was not correlated with sex，age and differential degree（P>0.05）.The expression of Ubc9 protein was positively correlated with the drug resistance of Cisplatin（r=0.323，P<0.05），and had no significant correlation with the sensitivity of 5-fluorouracil（r=0.283，P>0.05）.Conclusion：Ubc9 protein is highly expressed in colorectal cancer，which is related to clinical stage，lymph node metastasis and positive correlation with drug resistance of Cisplatin.

【Key words】 Colorectal adenocarcinoma； Ubiquitin-conjugating enzyme 9； Immunohistochemistry

First-authors address：First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.23.010

小泛素相關(guān)修飾物（small ubiquitin-related modifier，SUMO）是一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾途徑，在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定和功能方面發(fā)揮著重要的作用，對細(xì)胞的增殖、分化、凋亡過程起重要作用[1]。SUMO途徑需要激活酶、結(jié)合酶和連接酶共同參與，泛素結(jié)合酶9（ubiquitin-conjugating enzyme 9，Ubc9）是該途徑的唯一結(jié)合酶。據(jù)報道：Ubc9在頭頸部腫瘤、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤組織中普遍高表達(dá)[2-4]，并且與抗腫瘤藥物的化療敏感性有關(guān)[5-6]，目前Ubc9在結(jié)直腸癌中的研究鮮見報道。本研究觀察Ubc9在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，分析其與結(jié)直腸癌常用化療藥物敏感性之間的關(guān)系，為結(jié)直腸癌的研究提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普通外科2016年1-9月收治的經(jīng)手術(shù)切除結(jié)直腸癌及癌旁（距瘤體邊緣>5 cm）新鮮標(biāo)本50例，腺瘤30例。標(biāo)本收集要求不影響術(shù)后病理診斷，癌組織一部分組織用于細(xì)胞原代培養(yǎng)，另一部分固定包埋后用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。所有患者均無家族史，未經(jīng)任何放化療，術(shù)后經(jīng)組織病理診斷為結(jié)直腸腺癌。入組患者中：男29例，女21例；年齡47～82歲，中位年齡59歲；分化程度：高分化11例，中分化25例，低分化14例；TNM分期（美國抗癌聯(lián)合會/國際抗癌聯(lián)盟）：Ⅰ期9例，Ⅱ期23例，Ⅲ期18例；無淋巴結(jié)32例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例。endprint

1.2 免疫組織化學(xué) 石蠟切片4 μm于多聚賴氨酸處理的載玻片上，烤片機(jī)上60 ℃過夜，切片脫蠟至水后磷酸鹽緩沖液洗片3次。于0.01 M、pH值6.4的枸櫞酸緩沖液中高壓修復(fù)10 min，磷酸鹽緩沖液洗片3次，滴加山羊血清封閉，孵育15 min。滴加Ubc9一抗（Abcam公司，貨號：ab21193，濃度1∶200），4 ℃過夜孵育。滴加生物素標(biāo)記的二抗（北京中杉金橋公司），37 ℃箱孵育30 min；DAB顯色5 min，自來水終止顯色；蘇木素復(fù)染30 s，封片；每次染色用PBS液代替一抗做陰性對照。Ubc9陽性細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)或/和細(xì)胞核，免疫組化結(jié)果判定方法參考文獻(xiàn)[7]：以陽性細(xì)胞百分比（0分，0～4%；1分，5%～24%；2分，25%～49%；3分，50%～74%；4分，>75%和染色強(qiáng)度（陰性0分，弱陽1分，中等陽2分和強(qiáng)陽3分）的乘積進(jìn)行評分，評分<6分為低表達(dá)，≥6分為高表達(dá)。

1.3 細(xì)胞原代培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn) 電子天平稱取新鮮組織1 g。青鏈霉素即用液反復(fù)沖洗，將組織剪碎置于清潔塑料EP管中盡量剪碎至稀糊狀，加入

5 mL消化酶，恒溫?fù)u床37 ℃震蕩孵育1 h，將組織消化液通過200目不銹鋼濾網(wǎng)，1000 r/min離心濾液10 min，棄去上清。細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/mL，將細(xì)胞懸液均勻接種到96孔板中，培養(yǎng)基采用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后替換含順鉑、5-氟尿嘧啶的培養(yǎng)基，濃度為血藥峰值濃度[8]，每組設(shè)6個平行孔及對照組（無藥物）。培養(yǎng)24 h后取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT液20 μL（5 mg/mL），入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去液體，每孔加150 mL DMSO，室溫輕搖5 min，立即置于酶標(biāo)儀測定490 nm波長下吸光度值（A）。計算細(xì)胞生長抑制率（IR），IR（%）=1-試驗(yàn)孔A均值/對照孔A均值×100%。按照實(shí)體瘤體外敏感標(biāo)準(zhǔn)[9-10]，抑制率≥30%為敏感，<30%為耐藥。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ubc9在結(jié)直腸癌旁、腺瘤及腺癌組織中的表達(dá) Ubc9在癌旁、腺瘤及結(jié)直腸癌組織中均有不同程度的表達(dá)，Ubc9在結(jié)直腸癌中的表達(dá)顯著高于癌旁及腺瘤組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），腺瘤及癌旁組織中Ubc9的表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖1和表1。

2.2 Ubc9蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理資料的關(guān)系 通過對結(jié)直腸癌患者的臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)，Ubc9蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡及分化程度均無明顯關(guān)聯(lián)（P>0.05），與腫瘤的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)（P<0.05），即TNM分期高及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中Ubc9蛋白的高表達(dá)率越高，見表2。

2.3 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其與Ubc9表達(dá)的關(guān)系 原代培養(yǎng)及MTT最終成功評價了42例結(jié)直腸癌細(xì)胞體外對順鉑及5-氟尿嘧啶的藥物敏感性，其中對順鉑敏感者17例，耐藥者25例；對5-氟尿嘧啶敏感者20例，耐藥者22例。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：Ubc9蛋白的高表達(dá)與順鉑的耐藥呈正相關(guān)（r=0.323，P<0.05），Ubc9蛋白的表達(dá)與5-氟尿嘧啶藥物敏感性無顯著相關(guān)性（r=0.283，P>0.05），見表3。

3 討論

人Ubc9基因定位于16p13.3，編碼含158個氨基酸的蛋白，1997年Ubc9被確定為SUMO化途徑唯一的E2結(jié)合酶，可識別特異性的靶蛋白結(jié)合位點(diǎn)，在SUMO化修飾中發(fā)揮重要作用。Ubc9在惡性腫瘤中作用越來越受到關(guān)注，其參與的SUMO化過程在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后中的重要作用[11]。

本研究首先觀察了結(jié)直腸癌組織、癌旁組織及良性腺瘤組織中Ubc9蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，Ubc9在不同組織中均有不同程度的表達(dá)，但在結(jié)直腸癌組織Ubc9蛋白的高表達(dá)率顯著高于癌旁及腺瘤組織，說明Ubc9的高表達(dá)可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Ubc9蛋白在TNM分期高以及淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中表達(dá)更高，說明Ubc9的高表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的進(jìn)展程度及預(yù)后相關(guān)。就可能的機(jī)制而言，目前的研究表明，Ubc9所參與的SUMO化的動態(tài)失衡與腫瘤關(guān)系密切，生理狀態(tài)下SUMO化參與DNA的穩(wěn)定性、細(xì)胞程序性死亡及癌基因的轉(zhuǎn)錄修飾等過程[12]，病理狀態(tài)下的SUMO化在腫瘤的發(fā)生及演進(jìn)具發(fā)揮一定作用，由此導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性破壞、細(xì)胞凋亡過程受阻及癌基因的過度轉(zhuǎn)錄等分子生物事件[13]，作為SUMO化的唯一E2結(jié)合酶，Ubc9的過表達(dá)對上述過程具有促進(jìn)作用[14]，而腫瘤的發(fā)生發(fā)展與Ubc9上調(diào)兩者之間何為因果目前尚無明確定論，但Ubc9在腫瘤中的普遍高表達(dá)是值得肯定的。

研究表明，抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7中Ubc9的表達(dá)可使抗癌藥物托泊替康、順鉑及替尼泊苷的敏感性增加[15]，siRNA干擾Ubc9基因的表達(dá)可顯著增強(qiáng)抗癌藥對黑色素瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用[16]，提示Ubc9可能與化療藥物的敏感性相關(guān)。本研究通過原代培養(yǎng)方式體外評價了50例結(jié)直腸癌對常用化療藥物順鉑及5-氟尿嘧啶的敏感性，結(jié)果顯示：順鉑耐藥率為59.5%，5-氟尿嘧啶耐藥率為52.4%，結(jié)合免疫組化結(jié)果相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：Ubc9蛋白的高表達(dá)與順鉑的耐藥呈正相關(guān)，而與5-氟尿嘧啶藥物敏感性無顯著相關(guān)性，提示Ubc9的高表達(dá)可能參與了順鉑的耐藥過程。目前Ubc9參與耐藥的機(jī)制尚不明確，可能與Fas相關(guān)蛋白-死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（death domain associate protein，Daxx）的定位改變有關(guān)，通過Daxx介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來影響細(xì)胞對化療藥物的敏感性[17-18]。endprint

總之，本研究初步探討了Ubc9在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及其與常用化療藥物敏感性之間的關(guān)系，為結(jié)直腸癌的研究提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前，已有以Ubc9為治療靶點(diǎn)的相關(guān)研究報道，相信Ubc9有望成為腫瘤治療的有效藥物和基因靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2017-03-20） （本文編輯：程旭然）endprint