CD4+CD25+Foxp3+Tregs在自身免疫性甲狀腺疾病中的作用研究

黃廣英+禤文婷+何靈杰

【摘要】 目的：探討CD4+CD25+Foxp3+Tregs在自身免疫性甲狀腺疾?。ˋITD）中的作用。方法：收集2014年2月-2016年11月在本院進(jìn)行檢查的AITD患者80例為治療組，其中Graves（GD）患者40例，為GD組；橋本甲狀腺炎（HT）患者40例，為HT組；選取健康體檢人員20例為對(duì)照組。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD4+T、CD4+CD25+Tregs細(xì)胞數(shù)量和比例，采用RT-PCR檢測(cè)外周血Foxp3 mRNA表達(dá)水平，采用化學(xué)發(fā)光法對(duì)血清中甲狀腺素（TSH）、總?cè)饧谞钕僭彼幔═T3）、總甲狀腺素（TT4）、甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）和甲狀腺過(guò)氧化酶抗體（TPOAb）的水平進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：三組TSH、TT3、TT4、TgAb、TPOAb比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；三組外周血CD4+T細(xì)胞數(shù)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；GD組外周血CD4+CD25+Tregs占CD4+T細(xì)胞的比率與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；HT組外周血CD4+CD25+Tregs占CD4+T細(xì)胞的比率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；GD組和HT組外周血Foxp3 mRNA表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；自身免疫性甲狀腺疾病的CD4+CD25+Foxp3+Tregs與TSH、TT3、TT4、TgAb和TPOAb有明顯正相關(guān)性（P<0.05）。結(jié)論：CD4+CD25+Foxp3+Tregs可能在AITD的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起著一定的作用，深入研究CD4+CD25+Foxp3+Tregs在AITD中的作用將有助于建立新的預(yù)防和治療策略。

【關(guān)鍵詞】 自身免疫性甲狀腺疾?。?Graves； 橋本甲狀腺炎； CD4+CD25+Foxp3+

【Abstract】 Objective：To study the role of CD4+CD25+Foxp3+Tregs in autoimmune thyroid diseases（AITD）.Method：80 cases of AITD were collected from February 2014 to November 2016 in our hospital.Included 40 patients with Graves（GD），as GD group，40 patients with Hashimoto's thyroiditis（HT），as HT group，20 cases healthy people were selected as the control group.The peripheral blood flow cytometric detection of CD4+T and the number and proportion of CD4+CD25+Tregs cells were detected by flow cytometry，the peripheral blood Foxp3 expression level was detected by RT-PCR，the levels of total thyroxine（TSH），total three triiodothyronine（TT3），total thyroxine（TT4），thyroglobulin antibody（TgAb） and thyroid peroxidase（TPOAb） were measured by chemiluminescence method.Result：TSH，TT3，TT4，TgAb，TPOAb levels of three groups had significant differences（P<0.05）.The peripheral blood of CD4+T of three groups had no significant difference（P>0.05）.Peripheral blood CD4+CD25+Tregs cells and the ratio of CD4+T of GD group compared with the control group，there were no significant differences（P>0.05）.Peripheral blood CD4+CD25+Tregs cells and the ratio of CD4+T of HT group were significantly lower than those of the control group（P<0.05）.Foxp3 mRNA expression of GD group and HT group were significantly lower than that the control group（P<0.05）.CD4+CD25+Foxp3+Tregs of AITD was positively correlated with TSH，TT3，TT4，TgAb and TPOAb （P<0.05）.Conclusion：CD4+CD25+Foxp3+Tregs may play an important role in the occurrence and development of AITD.Further research on the role of CD4+CD25+Foxp3+Tregs in AITD will help to establish a new prevention and treatment strategy.

【Key words】 Autoimmune thyroid disease； Graves； Hashimotos thyroiditis； CD4+CD25+Foxp3+Tregsendprint

First-authors address：Dongguan Peoples Hospital，Dongguan 523000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.23.005

自身免疫性甲狀腺疾?。ˋuto Immune Thyroid Diseases，AITD）是人類最常見的器官特異性自身免疫性疾病，在人群中的發(fā)病率約為5%。隨著現(xiàn)代飲食結(jié)構(gòu)的改變和生活節(jié)奏的加快，AITD的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢(shì)[1-2]。CD4+CD25+Tregs是近年研究發(fā)現(xiàn)的一類具有維持自身免疫穩(wěn)定的T細(xì)胞亞群，它能夠識(shí)別自身抗原并抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，在免疫自穩(wěn)方面起著重要作用[3]。本研究通過(guò)患者檢測(cè)外周血CD4+CD25+Tregs細(xì)胞數(shù)量和比例的變化，以及Foxp3基因表達(dá)情況，與患者體內(nèi)相關(guān)激素和抗體水平等參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，探討其在AITD發(fā)病機(jī)制中的作用，并為免疫調(diào)控治療的策略提供有價(jià)值的參考依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年2月-2016年11月在本院進(jìn)行檢查的AITD患者80例，入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《內(nèi)科學(xué)》相應(yīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）抗甲狀腺球蛋白抗體和抗甲狀腺過(guò)氧化酶抗體滴度均明顯升高；（3）經(jīng)檢查確診為Graves病及橋本甲狀腺炎患者[4-5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重心、腦血管系統(tǒng)性疾病的患者；（2）檢查前進(jìn)行藥物治療及有相關(guān)病史的患者；（3）妊娠期及哺乳期婦女患者[5-6]。所有患者及其家屬知情并簽訂同意書。其中Graves（GD）患者40例，男17例，女23例，年齡36～53歲，平均（40.6±9.3）歲，作為GD組；橋本甲狀腺炎（HT）患者40例，男16例，女24例，年齡37～54歲，平均（41.3±10.2）歲，作為HT組；另外選取20例健康體檢人員作為對(duì)照組，男7例，女13例，年齡35～53歲，平均（39.8±9.1）歲。三組基本資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法 GD組、HT組及對(duì)照組患者分別在清晨采集空腹外周靜脈血15 mL作為標(biāo)本，取2 mL靜脈血，2000 r/min離心12 min，分離血清，采用化學(xué)發(fā)光試劑盒對(duì)血清中的血清中甲狀腺素（TSH）、總?cè)饧谞钕僭彼幔═T3）、總甲狀腺素（TT4）、甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）和甲狀腺過(guò)氧化酶抗體（TPOAb）進(jìn)行檢測(cè)。主要試劑：抗人CD4-FITC、CD25-PE購(gòu)買于美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司，人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)買于北京百奧萊博科技有限公司。（1）取5 mL靜脈血，將單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）快速進(jìn)行分離，并取3×105個(gè)PBMC加入抗人CD4-FITC和CD25-PE mAb放置于避光環(huán)境中進(jìn)行室溫孵育15 min，然后2000 r/min離心12 min，分離血清，采用流式細(xì)胞儀對(duì)CD4+T、CD4+CD25+Tregs進(jìn)行檢測(cè)[7]。（2）取5 mL靜脈血分離PBMC，根據(jù)試劑說(shuō)明書的操作要求將提取細(xì)胞總的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-PCR檢測(cè)外周血Foxp3 mRNA表達(dá)水平[8]。PCR反應(yīng)條件[8]：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性反應(yīng)45 s，52 ℃條件下退火45 s，72 ℃延伸反應(yīng)1.5 min，重復(fù)35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸反應(yīng)15 min，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后采用1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物?？刂齐娪倦妷?00 V，將電泳膠放入凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相。（3）取5 mL靜脈血分離PBMC，采用磁珠分選方法將CD4+CD25+Tregs和CD4+T進(jìn)行分離，然后將CD4+CD25+Tregs和CD4+T按照1∶1的比例混合并在96孔培養(yǎng)板上接種，向其中加入經(jīng)過(guò)滅活的自身抗原遞呈細(xì)胞，經(jīng)抗CD3抗體（100 ng/mL）刺激培養(yǎng)68 h后，吸去部分上清，向每孔加入20 μL的MMT（ 5 mg/ mL）溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后結(jié)束。將DMSO加入各孔并震蕩使其充分溶解后，采用酶標(biāo)儀測(cè)各孔的OD值[9]。計(jì)算CD4+CD25+Tregs對(duì)CD4+T抑制率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，計(jì)量資料用（x±s）表示，并進(jìn)行t或F檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)，采用線性回歸系數(shù)法進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組TSH、TT3、TT4、TgAb、TPOAb水平比較 三組TSH、TT3、TT4、TgAb、TPOAb比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 三組CD4+CD25+Tregs和CD4+T水平及Foxp3 mRNA表達(dá)水平比較 三組外周血CD4+T的細(xì)胞數(shù)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；GD組外周血CD4+CD25+Tregs占CD4+T細(xì)胞的比率與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；HT組外周血CD4+CD25+Tregs占CD4+T細(xì)胞的比率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；GD組和HT組外周血Foxp3 mRNA表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 三組CD4+CD25+Foxp3+Tregs與TSH、TT3、

TT4、TgAb、TPOAb的相關(guān)性 AITD的CD4+CD25+Foxp3+Tregs與TSH、TT3、TT4、TgAb和TPOAb具有明顯的正相關(guān)性（P<0.05），見表3。

3 討論

自身免疫性甲狀腺疾?。ˋuto Immune Thyroid Diseases， AITD）主要包括Graves病和橋本甲狀腺炎，兩者均可產(chǎn)生針對(duì)甲狀腺的自身抗體，是臨床上引起甲狀腺功能亢進(jìn)或減退的最常見原因之一，可導(dǎo)致多器官、多系統(tǒng)損害，或合并其他自身免疫性疾病，嚴(yán)重影響患者的心身健康[10-12]。大多數(shù)研究認(rèn)為，AITD是在遺傳和環(huán)境等因素的相互作用下，誘發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)機(jī)能失衡，從而產(chǎn)生針對(duì)自身抗原的免疫細(xì)胞和或自身抗體，導(dǎo)致器官損傷和功能障礙[13-15]。endprint

免疫學(xué)研究表明，CD4+T細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，通過(guò)對(duì)抗原識(shí)別、處理、提呈等作用，在穩(wěn)定機(jī)體的免疫平衡、維持機(jī)體免疫耐受等過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[16]。CD4+CD25+Tregs是近年研究發(fā)現(xiàn)的一類具有維持自身免疫穩(wěn)定的T細(xì)胞亞群，它能夠識(shí)別自身抗原并抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，在免疫自穩(wěn)方面起著重要作用[17]。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3對(duì)Treg細(xì)胞的分化成熟和功能維持都起著重要作用，研究證實(shí)，人體內(nèi)的CD4+CD25+Tregs部分表達(dá)Foxp3，并且Foxp3+的這群細(xì)胞具有免疫抑制功能[18]。

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3的基因多態(tài)性與兒童/青春期AITD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)具有正相關(guān)，因此FOXP3的基因在AITD存在高表達(dá)，而且對(duì)AITD的發(fā)生發(fā)展起到重要作用[19]。據(jù)研究報(bào)道，CD4+CD25+Tregs細(xì)胞亞群數(shù)量比正常兒童明顯減少，這也說(shuō)明AITD患者血液中存在明顯的CD4+CD25+Tregs細(xì)胞亞群數(shù)量的降低[20]。本研究結(jié)果顯示，三組外周血CD4+T的細(xì)胞數(shù)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；GD組外周血CD4+CD25+Tregs占CD4+T細(xì)胞的比率與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；HT組外周血CD4+CD25+Tregs占CD4+T細(xì)胞的比率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這說(shuō)明了橋本甲狀腺炎患者存在明顯的免疫反應(yīng)，而且這種反應(yīng)明顯比Graves病患者數(shù)量低。進(jìn)一步研究顯示，GD組和HT組外周血Foxp3 mRNA表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）這也表明AITD發(fā)生后就會(huì)導(dǎo)致Foxp3 的表達(dá)。

AITD患者中的Graves病和橋本甲狀腺炎血液中存在TSH、TT3、TT4、TgAb、TPOAb水平的差異，而且Graves病和橋本甲狀腺炎2種疾病中TSH、TT3、TT4、TgAb、TPOAb水平也存在一定的差異，本研究結(jié)果顯示，TSH、TT3、TT4、TgAb、TPOAb水平與健康人存在差異，而且Graves病血液中的TT3、TT4水平高于橋本甲狀腺炎患者，而TSH、TgAb、TPOAb水平明顯低于橋本甲狀腺炎患者，這也表明AITD患者的兩種類型的疾病存在明顯不同，而且AITD患者的兩種類型的疾病中的TSH、TT3、TT4、TgAb、TPOAb水平與CD4+CD25+Foxp3+Tregs的相關(guān)性進(jìn)行分析，可以顯示CD4+CD25+Foxp3+Tregs與AITD的發(fā)生發(fā)展有明顯關(guān)系。

綜上所述，CD4+CD25+Foxp3+Tregs可能在AITD的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起著一定的作用，深入研究CD4+CD25+Foxp3+Tregs在AITD中的作用將有助于建立新的預(yù)防和治療策略。

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（收稿日期：2017-04-12） （本文編輯：程旭然）endprint