穗發(fā)芽抗性相關(guān)分子標(biāo)記Ｔａｍｙｂ１０Ｄ和Ｖｐ１Ｂ３在紅白粒小麥中的有效性驗(yàn)證

陳泠 高春保 王翠 朱展望 佟漢文 劉易科 張宇慶 鄒娟 何偉杰

摘要：為了篩選出有效的穗發(fā)芽抗性相關(guān)分子標(biāo)記，利用240份小麥品種（系）4年的整穗發(fā)芽率數(shù)據(jù)對(duì)Tamyb10D和Vp1B3標(biāo)記的有效性進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，①紅粒比白?？顾氚l(fā)芽;②在不區(qū)分紅白粒的情況下，兩標(biāo)記可用，Tamyb10D標(biāo)記相對(duì)更好;③在區(qū)分紅白粒的情況下，Tamyb10D標(biāo)記僅在紅粒中可用，而Vp1B3標(biāo)記不可用;④Tamyb10-D1b和Vp-1Bc基因型在紅粒中的出現(xiàn)頻率高于白粒，特別是前者差異大（紅粒、白粒分別為64.79%和1.78%）。由此推斷，在不考慮子粒顏色時(shí)，兩標(biāo)記與穗發(fā)芽抗性的相關(guān)性主要是由其與紅色子粒的相關(guān)性決定的，而非其自身作用。綜上所述，Tamyb10D標(biāo)記可用于紅?？顾氚l(fā)芽種質(zhì)篩選，Vp1B3標(biāo)記不可用于紅粒和白粒抗穗發(fā)芽種質(zhì)篩選。

關(guān)鍵詞：小麥;穗發(fā)芽;分子標(biāo)記;Tamyb10D;Vp1B3

中圖分類(lèi)號(hào)：S512.1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）24-0066-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.018? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： To acquire valuable marker for pre-harvest sprouting resistance（PHS），the value of two markers（Tamyb10D and Vp1B3） were estimated in 240 wheat varieties during four years. The results were as follows：①Red-grained wheat were more tolerant to PHS than white-grained wheat.②Two makers were effective to select PHS resistant varieties without considering grain color. And Tamyb10D was more better than Vp1B3. ③Tamyb10D was associated with PHS resistance in red-grained wheat but not in white-grained wheat. While Vp1B3 was not associated with PHS resistance either in red-grained wheat or white-grained wheat.④The frequencies of Tamyb10-D1b and Vp-1Bc were higher in red-grained wheat than those in white-grained wheat. Especially for the allele Tamyb10-D1b，its frequency was 64.79% in red-grained wheat while only 1.78% in white-grained wheat. Above results indicated that the correlations between these two markers and PHS resistance were mostly determined by their correlation with red grained wheat，not by their own functions. In conclusion， marker Tamyb10D can be used to select PHS resistant varieties in red-grained wheat. But marker Vp1B3 can not be used to select PHS resistant varieties both in red-grained and white-grained wheat.

Key words： wheat; pre-harvest sprouting; molecular marker; Tamyb10D; Vp1B3

小麥穗發(fā)芽是指小麥即將成熟未收獲時(shí)遇連陰雨天氣，導(dǎo)致子粒在穗上萌動(dòng)發(fā)芽的現(xiàn)象。子粒發(fā)芽過(guò)程中會(huì)代謝掉營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)淀粉，引起產(chǎn)量下降，子粒品質(zhì)劣化，萌動(dòng)或發(fā)芽的子粒種用價(jià)值降低。小麥穗發(fā)芽分布范圍廣、危害嚴(yán)重。中國(guó)長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)、東北春麥區(qū)和西南冬麥區(qū)以及加拿大、澳大利亞等國(guó)內(nèi)外小麥主產(chǎn)區(qū)都時(shí)有發(fā)生，對(duì)小麥產(chǎn)量的提升和品質(zhì)的保障帶來(lái)了威脅。如2018年夏收期間湖北地區(qū)遭遇連陰雨，特別是鄂北等主產(chǎn)區(qū)小麥減產(chǎn)達(dá)50%左右。發(fā)芽嚴(yán)重小麥只能作為飼料出售，價(jià)格降低一半以上，致使種麥效益嚴(yán)重下滑，極大地挫傷了農(nóng)民的種麥積極性。

抗穗發(fā)芽品種的應(yīng)用是解決穗發(fā)芽危害的最經(jīng)濟(jì)有效的方法，利用功能標(biāo)記可加快品種培育進(jìn)程。目前，已鑒定與穗發(fā)芽抗性相關(guān)的基因有TaVp-1[1，2]、Tamyb10[3]、TaSdr[4]、TaPHS1[5，6]、PM19[7]、TaDFR[8]和MKK3[9]等。其中對(duì)標(biāo)記有效性評(píng)價(jià)研究較多的是TaVp-1和Tamyb10的分子標(biāo)記。轉(zhuǎn)錄因子Tamyb10推測(cè)可能是控制小麥種皮顏色R基因的候選基因[3]。Wang等[10]利用Tamyb10的分子標(biāo)記對(duì)103個(gè)小麥品種（系）的基因型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記Tamyb10B和Tamyb10D與穗發(fā)芽抗性相關(guān)，前者效應(yīng)大于后者，Tamyb10A標(biāo)記與穗發(fā)芽抗性相關(guān)性不顯著。Vp-1基因是種子成熟、干燥及休眠的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能促進(jìn)胚成熟，加速休眠并抑制其萌發(fā)[1]。Yang等[2]利用Vp-1基因3B染色體上的不同基因型開(kāi)發(fā)了Vp1B3標(biāo)記，檢測(cè)到3種基因型：Vp-1Ba、Vp-1Bb和Vp-1Bc，前者與感穗發(fā)芽有關(guān)，后兩者與抗穗發(fā)芽相關(guān)。

為了篩選穩(wěn)定可靠的分子標(biāo)記用于穗發(fā)芽抗性育種，本研究利用240份小麥群體的4年穗發(fā)芽表型數(shù)據(jù)對(duì)已報(bào)道的穗發(fā)芽抗性分子標(biāo)記Tamyb10D和Vp1B3進(jìn)行了有效性鑒定，以期為穗發(fā)芽抗性分子育種工作提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

240份小麥群體含國(guó)內(nèi)近20年育成的小麥品種（系）229份，分別來(lái)自河南（62份）、江蘇（38份）、山東（27份）、陜西（21份）、湖北（20份）、四川（18份）、河北（13份）、甘肅（9份）、北京（7份）、山西（6份）、寧夏（5份）和安徽（3份）。另含有國(guó)外材料11份，其中CIMMYT材料8份。2014-2018年共計(jì)4年度種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所稻茬田（武漢洪山）。

1.2? 整穗發(fā)芽率測(cè)定

小麥材料生理成熟后，采集無(wú)病害小麥穗10穗（含穗下節(jié)10 cm），室內(nèi)自然干燥7 d后，保存在-20 ℃冰柜中備用。整穗發(fā)芽在溫室內(nèi)采用自動(dòng)模擬降雨設(shè)備進(jìn)行，每4 h噴霧20 min，溫度設(shè)定為20 ℃，連續(xù)處理5 d后發(fā)芽穗保存在-20 ℃冰柜。人工脫粒統(tǒng)計(jì)發(fā)芽粒數(shù)和未發(fā)芽粒數(shù)，以芽長(zhǎng)度超過(guò)1/2種子長(zhǎng)度記為發(fā)芽。

發(fā)芽率（SGR）=10穗發(fā)芽粒數(shù)×100%/（10穗發(fā)芽粒數(shù)+10穗未發(fā)芽粒數(shù)）。

1.3? 抗穗發(fā)芽分子標(biāo)記檢測(cè)

采用CTAB法[11]提取葉片基因組總DNA。分子標(biāo)記引物Tamyb10D[10]和Vp1B3[2]由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成（表1），PCR試劑為康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)的2×Es Taq MasterMix（Dye），擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后觀察拍照。

1.4? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用IBM SPSS Statistics 20對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)系數(shù)和單因素方差分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 子粒顏色與穗發(fā)芽抗性關(guān)系

240份小麥材料的SGR分布較廣，特別是2018年為1.21%～99.70%，而2016年SGR較高，為30.40%～99.19%（表2）。不同年份間SGR呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為0.355～0.650（表3），說(shuō)明測(cè)定的SGR可用于進(jìn)一步分析。

240份小麥群體中有71份紅粒小麥，169份白粒小麥。不同年份紅粒小麥SGR均值都小于白粒小麥，且兩者差異均達(dá)到極顯著水平（表4），說(shuō)明紅粒小麥比白粒小麥抗穗發(fā)芽。

2.2? Tamyb10D標(biāo)記的有效性分析

用Tamyb10D標(biāo)記分析240份材料，共檢測(cè)到191份材料為T(mén)amyb10-D1a基因型，49份材料為抗穗發(fā)芽基因型Tamyb10-D1b[10]，出現(xiàn)頻率分別為79.58%和20.42%（表5）。兩種基因型的各年份SGR均值比較顯示，Tamyb10-D1b基因型的SGR均值均低于Tamyb10-D1a基因型，除2016年外，兩者SGR均值差異都達(dá)到極顯著水平（P<0.001）。

對(duì)紅粒材料中Tamyb10-D1a和Tamyb10-D1b基因型進(jìn)行分析，結(jié)果（表5）表明，71份紅粒材料中，抗穗發(fā)芽基因型Tamyb10-D1b占比為64.79%，說(shuō)明紅粒小麥中該基因型出現(xiàn)頻率較高。SGR均值分析發(fā)現(xiàn)，除2016年外，Tamyb10-D1b基因型的SGR均值都低于Tamyb10-D1a基因型，但差異分析顯示，僅2018年兩者差異達(dá)到極顯著水平（P=0.005）。

169份白粒材料分析（表5）發(fā)現(xiàn)，僅有3份材料含有Tamyb10-D1b基因型，出現(xiàn)頻率為1.78%。SGR均值比較顯示，2018年Tamyb10-D1b基因型的SGR均值高于Tamyb10-D1a基因型，其他年份則相反，但差異都未達(dá)顯著水平。綜上所述，在紅粒小麥中Tamyb10-D1b基因型對(duì)穗發(fā)芽抗性有顯著作用，但在白粒小麥中對(duì)穗發(fā)芽抗性沒(méi)有明顯作用。

2.3? Vp1B3標(biāo)記的有效性分析

240份材料中，利用Vp1B3標(biāo)記共檢測(cè)到4種基因型，其中基因型Vp-1Ba和抗穗發(fā)芽基因型Vp-1Bc[2]出現(xiàn)頻率較高，分別為27.92%和70.83%（表6）。此外，檢測(cè)到Vp-1Bd基因型2份和Vp-1Bb基因型1份。SGR均值比較顯示，除2016年外，Vp-1Ba基因型的SGR均值均高于Vp-1Bc基因型，但僅2018年兩者差異達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。

對(duì)紅粒材料中Vp-1Ba和Vp-1Bc基因型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Vp-1Bc基因型在紅粒中出現(xiàn)頻率高達(dá)87.32%，而含Vp-1Ba基因型的材料只有8份。SGR均值比較顯示，除2015年外，各年份Vp-1Ba基因型的SGR均值均低于Vp-1Bc基因型，但差異均未達(dá)到顯著水平（表6）。

在白粒材料中，Vp-1Ba和Vp-1Bc基因型分別占34.91%和63.91%，Vp-1Ba基因型的出現(xiàn)頻率在白粒中比紅粒中高。兩基因型各年份SGR均值比較顯示，2018和2015年，Vp-1Bc基因型的SGR均值低于Vp-1Ba基因型，而2017和2016年結(jié)果相反，但各年份兩者差異都較小，均未達(dá)顯著水平（表6）。表明Vp1B3標(biāo)記不能用于紅粒和白粒穗發(fā)芽抗性品種篩選。

3? 小結(jié)與討論

通過(guò)比較240份紅白粒材料在4個(gè)年份的SGR，發(fā)現(xiàn)紅粒材料的SGR均值都極顯著小于白粒材料，即紅粒材料比白粒材料抗穗發(fā)芽，與前人研究結(jié)果一致[12]。但紅粒材料中同樣有SGR較高的材料，如川麥43和寧春47號(hào)，4個(gè)年份的SGR變異范圍分別為62.02%～91.25%和72.53%～84.25%。因此，紅粒小麥也需要進(jìn)行穗發(fā)芽抗性性狀鑒定以便準(zhǔn)確選出抗性品種。

前人研究證實(shí)Tamyb10-D1b和Vp-1Bc基因型與抗穗發(fā)芽相關(guān)，Tamyb10-D1a和Vp-1Ba基因型與感穗發(fā)芽相關(guān)[2，10]。本研究發(fā)現(xiàn)，在不區(qū)分紅白粒的情況下，SGR均值說(shuō)明Tamyb10-D1b和Vp-1Bc基因型較Tamyb10-D1a和Vp-1Ba基因型抗穗發(fā)芽。但在區(qū)分紅白粒的情況下，僅紅粒中2018年數(shù)據(jù)顯示Tamyb10-D1b基因型較Tamyb10-D1a基因型抗穗發(fā)芽，兩者差異顯著。分析基因型出現(xiàn)頻率發(fā)現(xiàn)，抗穗發(fā)芽基因型Tamyb10-D1b和Vp-1Bc在紅粒中的出現(xiàn)頻率高于白粒，紅粒中兩者出現(xiàn)頻率分別是64.79%和87.32%，在白粒中則為1.78%和63.91%。由此推測(cè)，在不區(qū)分紅白粒的情況下，抗穗發(fā)芽基因型與感穗發(fā)芽基因型間的SGR均值差異是由于紅白粒穗發(fā)芽抗性差異造成的，而非基因型本身的作用。

本研究證實(shí)，Tamyb10D標(biāo)記可用于紅粒小麥的穗發(fā)芽抗性篩選，Vp1B3標(biāo)記不能用于紅粒和白粒穗發(fā)芽抗性品種篩選，該結(jié)果與部分前人研究結(jié)果一致[13-15]。如王根平等[13]證實(shí)Tamyb10D標(biāo)記在紅粒小麥中有效。楊燕等[14]分析了67份紅粒春小麥的發(fā)芽指數(shù)與Vp1B3標(biāo)記相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者無(wú)相關(guān)性。孫果忠等[15]對(duì)中國(guó)75個(gè)品種進(jìn)行分析，也證實(shí)Vp1B3標(biāo)記與穗發(fā)芽抗性關(guān)系不密切。本研究結(jié)論也與一些已報(bào)道結(jié)果不一致[16，17]，可能是由于研究群體和研究環(huán)境不同以及未區(qū)分紅白粒情況下分析數(shù)據(jù)造成的。

綜上所述，本研究通過(guò)240份材料4年的穗發(fā)芽性狀數(shù)據(jù)，對(duì)Tamyb10D標(biāo)記和Vp1B3標(biāo)記進(jìn)行有效性鑒定，證實(shí)前者可用于紅粒小麥的穗發(fā)芽抗性篩選，后者不可用于紅粒和白粒穗發(fā)芽抗性品種篩選。

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