金蕎麥總黃酮提取工藝優(yōu)化研究

趙炎軍　蔡田恬　錢松　吳凡　黃蓓蓓

[摘要] 目的 優(yōu)選金蕎麥總黃酮的最佳提取工藝。 方法 采用乙醇回流提取金蕎麥方法，以總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇乙醇濃度、溶媒倍數(shù)、提取時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行單因素考察，并通過(guò) L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化金蕎麥總黃酮的提取工藝。 結(jié)果 建立了金蕎麥總黃酮的最佳提取工藝： 向金蕎麥藥材粉末中加入15 倍量65%的乙醇，80℃水浴回流提取3 次，每次提取2.0 h。 結(jié)論 優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定、合理、可行，能正確反映金蕎麥總黃酮含量。

[關(guān)鍵詞] 金蕎麥;總黃酮;提取工藝;單因素;正交設(shè)計(jì)

[中圖分類號(hào)] R284.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）34-0034-04

金蕎麥[Fagopyrum cymosum（Trev.）Meisn]別名野蕎麥、金鎖銀開(kāi)、蕎麥三七、苦蕎頭等，系雙子葉蓼科蕎麥屬（Fagopyrum）植物，多見(jiàn)于海拔500～3000 m的陰濕山地、灌木叢、溪道旁等，資源非常豐富，為民間常用的清熱解毒類中草藥，臨床應(yīng)用也非常廣泛[1，2]?，F(xiàn)代臨床上主要用于治療阻塞性肺疾病[3，4]、肺膿腫[5]、支氣管炎[6]、潰瘍性結(jié)腸炎[7]、外感風(fēng)熱[8]等癥。近年研究發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗氧化[9，10]、降低血脂血糖[11，12]、抑制腫瘤[13]、抗菌[14]等作用，具有較高的研究?jī)r(jià)值。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，金蕎麥的化學(xué)成分主要有黃酮類、甾體、有機(jī)酸類、萜類、苷類等，其中黃酮類成分是其主要的藥理活性成分，主要包括蘆丁、槲皮素木犀草素、表兒茶素、原矢車菊素等[15-17]。

金蕎麥傳統(tǒng)的入藥部位是地下根，因加工的需求，其地上部分都被直接丟棄，造成嚴(yán)重浪費(fèi)。本文首次選用金蕎麥的全草作為研究對(duì)象，采用乙醇回流提取方法，通過(guò)單因素考察結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化金蕎麥總黃酮的提取工藝，以期能提高金蕎麥資源的利用率，為金蕎麥地上部分的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

金蕎麥源自浙江省杭州市五云山，秋季10月采摘，為多年野生金蕎麥植物，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)俞冰教授鑒定，為2015版《中國(guó)藥典》蓼科蕎麥屬藥用金蕎麥[Fagopyrum cymosum （Trev.）Meisn]植株;蘆丁對(duì)照品（≥98%，批號(hào)：100080-200707）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究所;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司];UV-2600a型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)[尤尼柯（上海）有限公司];HH-S 型電熱恒溫水浴鍋（鞏義市英峪予華儀器廠）;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪高科儀器廠）;KQ5200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;JP-500B打粉機(jī)（永康市久品工貿(mào)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品與供試品溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液制備? 精密稱取105 ℃烘干至恒重的蘆丁對(duì)照品20 mg，置100 mL 量瓶中，加適量70%乙醇，超聲溶解，放冷，加70 %乙醇至刻度，搖勻，即得（濃度為0. 2 mg/mL）。

2.1.2 供試品溶液制備? 準(zhǔn)確稱取金蕎麥粗粉（藥材粉碎過(guò)60目篩）5.0 g，置250 mL圓底燒瓶中，加20倍量70%乙醇，80℃水浴回流提取2 次，每次1 h，趁熱減壓抽濾2 次，合并濾液至250 mL容量瓶中，加70%乙醇定容到刻度，備用。

2.2 金蕎麥總黃酮的含量測(cè)定

2.2.1 線性關(guān)系考察? 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL，置于25 mL 量瓶中，再加1 mL 5% NaNO2 溶液，搖勻，放置6 min，加入1 mL 10%的Al（NO3）3 溶液，搖勻，放置6 min，再加入10 mL 4% NaOH溶液，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，靜置15 min，隨行試劑做空白，于510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，得吸光度Y與蘆丁濃度X（μg/mL）的回歸方程：Y=11.589X+0.0439，R2=0.9999。結(jié)果表明：蘆丁在8～48 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.2 精密度試驗(yàn)? 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液3.0 mL，按“2.2.1”項(xiàng)在510 nm 波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定6 次，計(jì)算吸光度值的RSD為1.34%，表明儀器的精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)? 精密吸取供試液1.0 mL，按“2.2.1”項(xiàng)在510 nm波長(zhǎng)處，分別在0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min時(shí)間點(diǎn)測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD值為0.30%，表明供試品溶液在30 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)? 取同批次的金蕎麥粗粉，按“2.1.2”項(xiàng)平行制備6 份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)測(cè)定吸光度。計(jì)算RSD為0.13%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收試驗(yàn)? 精密稱取適量已知含量的金蕎麥粗粉9 份，每份2.5 g，分別精密加入已知藥材粗粉總黃酮含量80%、100%、120%的蘆丁對(duì)照品。按“2.1.2”項(xiàng)制備供試品溶液，取供試品溶液1.0 mL 置25 mL 容量瓶中，其余操作同“2.2.1”，測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均回收率為99.17%，RSD=2.23%。見(jiàn)表1。

2.2.6 含量測(cè)定? 按2.1.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，根據(jù)2.2.1項(xiàng)顯色測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算金蕎麥總黃酮含量。

總黃酮含量（mg/g）=■

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 乙醇濃度的選擇? 稱取金蕎麥粗粉5.0 g，加20倍量乙醇，提取2次，每次1 h （提取溫度是80℃，下同），考察不同的乙醇濃度（%）（60%、65%、70%、75%、80%）對(duì)金蕎麥總黃酮含量的影響，測(cè)得總黃酮含量分別為87.81 mg/g、96.02 mg/g、80.04 mg/g、74.63 mg/g、68.79 mg/g，圖1可見(jiàn)，隨著乙醇濃度增大，總黃酮含量先升高，在乙醇濃度為65%時(shí)提取率最高，而后總黃酮含量逐步下降。因此，本研究中正交試驗(yàn)乙醇濃度因素的3個(gè)水平選擇60%、65%和70%。

2.3.2 溶媒倍數(shù)的選擇? 加入濃度為65%的乙醇，提取2 次，每次1 h，考察不同的溶媒倍數(shù)（10 倍、15 倍、20 倍、25 倍、30 倍）對(duì)總黃酮含量的影響，測(cè)得總黃酮含量分別為81.61mg/g、86.42mg/g、96.10 mg/g、93.83 mg/g、89.82 mg/g，圖2可見(jiàn)，隨著乙醇用量的逐漸增大，總黃酮含量先升高后降低。當(dāng)乙醇用量達(dá)20 倍時(shí)，總黃酮含量最高。因此，本研究中正交試驗(yàn)乙醇用量因素的3個(gè)水平選擇15 倍、20 倍和25 倍。

2.3.3 提取時(shí)間的選擇? 加入20 倍量濃度為65%的乙醇，提取2 次，考察不同提取時(shí)間（1.0 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3.0 h）對(duì)總黃酮含量的影響，測(cè)得總黃酮含量分別為79.10 mg/g、98.48 mg/g、97.52 mg/g、93.73 mg/g、87.12 mg/g，圖3可見(jiàn)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮含量先升高后降低，提取時(shí)間為1.5 h 時(shí)提取率最高。因此，本研究正交試驗(yàn)提取時(shí)間因素的3個(gè)水平選擇1 h、1.5 h 和2 h。

2.3.4 提取次數(shù)的選擇? 加入20 倍量濃度為65%的乙醇，提取時(shí)間為1 h/次，考察提取次數(shù)（1 次、2 次、3 次）對(duì)總黃酮含量的影響，測(cè)得總黃酮含量分別為75.24 mg/g、86.20 mg/g、89.31 mg/g，圖4可見(jiàn)，隨著提取次數(shù)的增多，總黃酮含量不斷升高，其中2 次提取總黃酮含量增加較多，3 次提取總黃酮含量增加趨于平緩，因此，本研究正交試驗(yàn)提取次數(shù)因素的3個(gè)水平選擇1 次、2 次和3 次。

2.4 總黃酮提取工藝優(yōu)選

2.4.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)? 根據(jù)單因素考察結(jié)果，分別選取乙醇濃度A（%）、溶媒倍數(shù)B（倍）、提取時(shí)間C（小時(shí)）、提取次數(shù)D（次）的 3 個(gè)水平進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以總黃酮含量Y（mg/g）為評(píng)價(jià)指標(biāo)。正交試驗(yàn)因素水平及正交試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)表2、3。

查方差分析表，F(xiàn)（0.05）（2，4）=6.94 ，F(xiàn)（0.01）（2，4）=18，由表3～4結(jié)果分析得到：A因素：無(wú)顯著性影響，2>3>1;B因素：有顯著性影響，1>2>3;C因素：無(wú)顯著性影響，3>1>2;D因素：有顯著性影響，3>2>1。

方差分析結(jié)果表明：各因素對(duì)總黃酮得率影響大小順序：D>B>A>C，即提取次數(shù)>溶媒倍數(shù)>乙醇濃度>提取時(shí)間。由此得出金蕎麥總黃酮最優(yōu)提取方案為A2B1C3D3，即藥材加15倍量65%的乙醇，回流提取3 次，每次提取2.0 h。

2.4.2 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)? 為進(jìn)一步驗(yàn)證所選條件的正確性與科學(xué)性，對(duì)所選最佳提取工藝進(jìn)行放大驗(yàn)證性試驗(yàn)，以增加可信度，分別取100.0 g金蕎麥粗粉進(jìn)行3次試驗(yàn)，按擬定的最佳工藝進(jìn)行回流提取，結(jié)果提取所得總黃酮含量均值為105.97 mg/g（RSD=0.35，n=3），驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明該提取工藝表現(xiàn)穩(wěn)定，合理可行，重現(xiàn)性好。

2.5 總黃酮含量比較

分別取金蕎麥傳統(tǒng)用藥部位（根）的粗粉100.0 g進(jìn)行3 次試驗(yàn)，按擬定的最佳工藝進(jìn)行回流提取，與上述金蕎麥（全草）提取所得黃酮含量比較結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可看出，金蕎麥傳統(tǒng)用藥部位（根）提取所得黃酮含量低于金蕎麥（全草）提取結(jié)果，存在顯著性差異（P<0.01），該結(jié)果與之前文獻(xiàn)報(bào)道[7，18]的金蕎麥地上部分含有更高黃酮含量的結(jié)論相吻合。

表5? ?金蕎麥提取物中黃酮含量比較

注：與金蕎麥全草提取的黃酮含量相比較，★★P<0.01

3 討論

金蕎麥?zhǔn)且环N具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和重要藥用價(jià)值的國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物，具有抗菌、抗感染、抗血小板聚集、祛痰鎮(zhèn)咳、提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能以及抗腫瘤等多種生物活性，這與金蕎麥中含有黃酮類化合物如蘆丁、槲皮素、山奈酚-3-蕓香糖苷、槲皮素蕓香糖苷-7-半乳糖苷等有關(guān)[19]。它們?cè)谥参矬w內(nèi)大部分以與糖結(jié)合成苷的形式存在，極性較小，在水中的溶解度低于在乙醇中的溶解度，適合采用醇法提取，金蕎麥含有的總黃酮尤以蘆丁含量最高，所以本研究以蘆丁為對(duì)照品，采用乙醇回流法提取金蕎麥中的總黃酮。

總黃酮是廣泛存在于中藥中的一類重要的具有生物活性的物質(zhì)，研究表明，中藥中的黃酮具有巨大的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值[20]。隨著對(duì)藥用植物金蕎麥研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其地上部分較傳統(tǒng)用藥部位含有更高含量的黃酮類活性成分，而有關(guān)金蕎麥地上部分提取工藝的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，所以本研究將金蕎麥地上部分也加以利用，按擬定的最佳工藝進(jìn)行回流提取，結(jié)果黃酮含量高于傳統(tǒng)用藥部位，存在顯著性差異（P<0.01）。此結(jié)果可為進(jìn)一步保護(hù)金蕎麥資源、開(kāi)發(fā)擴(kuò)大用藥部位及提高資源的利用率提供一定的科學(xué)依據(jù)。

本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法來(lái)優(yōu)化金蕎麥的提取工藝，正交設(shè)計(jì)因能夠較全面地考察多因素多水平，方法簡(jiǎn)便，試驗(yàn)次數(shù)較少，實(shí)施較為簡(jiǎn)單，能篩選出影響指標(biāo)的顯著因素并給出最佳因素水平組合[21]，有利于實(shí)驗(yàn)的快速進(jìn)展，在后期的研究中，將對(duì)金蕎麥提取物中黃酮的種類及含量進(jìn)行分析測(cè)定，以便對(duì)各有效成分進(jìn)行有效地提取、純化和分離，并進(jìn)一步研究發(fā)掘金蕎麥黃酮的其他生物功效。

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（收稿日期：2018-06-28）