紫外分光光度法與高效液相色譜法測(cè)定板栗花水提液中總黃酮含量的比較研究

王鳳春+曾滟棱

摘要 [目的]建立板栗花水提液中總黃酮含量的快速、準(zhǔn)確測(cè)定方法，為產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支持。[方法]以槲皮苷為對(duì)照品，分別采用紫外分光光度法與高效液相色譜法測(cè)定板栗花水提液中總黃酮的含量。[結(jié)果]紫外分光光度法測(cè)得總黃酮的含量為4.62 mg/mL，高效液相色譜法測(cè)得總黃酮的含量為4.64 mg/mL，2種方法所得結(jié)果基本一致。[結(jié)論]紫外分光光度法與高效液相色譜法均可用于板栗花水提液中總黃酮的準(zhǔn)確定量，但在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中完全可用紫外分光光度法替代高效液相色譜法對(duì)總黃酮的含量進(jìn)行快速測(cè)定。

關(guān)鍵詞 板栗花水提液；總黃酮；紫外分光光度法；高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào) TS201 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2018）02-0255-03

Comparison of Quantitative Determination of Total Flavonoids in Water Extracts of Chestnut Flower by UV Spectrophotometry and HPLC

WANG Feng-chun 1 ZENG Yan-ling 2

（1 Research and Development Center of Chestnut Industry of Qianxi County，Qianxi Hebei 064300； 2 School of Chinese Materia Medica，

Beijing University of Chinese Medicine）

Abstract [Objective]To establish rapid and accurate quantitative determination method of total flavonoids in water extracts of chestnut flower and provide technical support for product development.[Methods]Taking quercitrin as the contool，UV spectrophotometry and HPLC were used to determine the content of total flavonods in water extracts of chestnut flower，respectively.[Results]The content of total flavonoids determined by UV spectrophotometry was 4.62 mg/mL，and by HPLC was 4.64 mg/mL.The content of total flavonoids obtained by the two methods were basically consistent.[Conclusion] Both UV spectrophotometry and HPLC could be used for accurate quantitative determination of total flavonoids in water extracts of chestnut flower，but in actual production，UV spectrophotometry could completely replace HPLC to determine the total flavonoids quickly.

Key words water extracts of chestnut flower；total flavonoids；UV spectrophotometry；HPLC

板栗花為殼斗科（Fagaceae）栗屬植物板栗（Castanea m-ollissima Bl.）的雄性花序，具有澀腸止瀉的功效[1]，民間用其水煎劑治久治不愈的細(xì)菌性痢疾，療效較好。已有研究表明，板栗花主要含黃酮[2]、多酚[3]、揮發(fā)油[4]、木脂素[5]及甾體[6]等多類(lèi)化學(xué)成分，其中黃酮（苷）類(lèi)成分的含量最高。已報(bào)道的黃酮類(lèi)化合物包括栗黃酮苷A、栗黃酮苷B、槲皮素（querc-etin）、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷（quercetin-3-O-β-D-ga-lactopyranoside）、槲皮素-3-O-（6"-O-沒(méi)食子?；?β-D-半乳糖苷[quercetin-3-O-（6"-O-galloyl）-β-D-galactoside]、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯（quercetin-3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester）、異鼠李素（isorhamnetin）等[6]。這些黃酮類(lèi)成分具有多種對(duì)人體有益的保健功能，如抗氧化、抗病毒、抗過(guò)敏、抗菌、抗發(fā)炎及血管舒張作用等[7]，可被用于藥品及保健功能食品的開(kāi)發(fā)。隨著人們生活水平的提高和對(duì)自身健康重視程度的日益增強(qiáng)，消費(fèi)者迫切需要找到一種安全、無(wú)毒并食藥兩用的物質(zhì)。而自然界廣泛分布的黃酮類(lèi)化合物恰好能滿足人們的這一要求，因而研究板栗花的食用價(jià)值對(duì)食品與醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展均具有重要意義。

板栗花水提液富含具有營(yíng)養(yǎng)保健功能的黃酮類(lèi)物質(zhì)[8]，對(duì)其進(jìn)行合理利用，如研制保健型植物提取飲料[9]，既具有可觀的經(jīng)濟(jì)效益，又可解決板栗花疏雄后雄花資源浪費(fèi)的問(wèn)題。有效物質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)的制定是保證功能食品質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)，而目前尚無(wú)對(duì)板栗花水提液中黃酮含量測(cè)定方法的研究報(bào)道。本研究以槲皮苷為對(duì)照品，對(duì)紫外分光光度法與高效液相色譜法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者均可用于板栗花水提液中總黃酮含量的準(zhǔn)確測(cè)定，而采用紫外分光光度法測(cè)定更為簡(jiǎn)便和快捷。該結(jié)果可為板栗花水提液的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供方法指導(dǎo)和數(shù)據(jù)支持。endprint

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器。U-3010型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本Hitachi）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent）；Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱（4.6×250 mm，5 μm，美國(guó)Agilent）。

1.1.2 材料與試劑。板栗花水提液（遷西縣板栗產(chǎn)業(yè)研究發(fā)展中心，批號(hào)201706）。提取方法取新鮮板栗花適量置揮發(fā)油提取器中，加純水（料液比為1∶1）混合浸泡后，在0.1 MPa的蒸汽壓力下加熱，當(dāng)罐內(nèi)溫度達(dá)到110 ℃時(shí)，蒸汽壓力控制在0.1 MPa，持續(xù)循環(huán)蒸餾3 h，罐內(nèi)下層液體即為板栗花水提液樣品。

槲皮苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；色譜級(jí)甲醇（美國(guó)Sigma-Aldrich），色譜級(jí)乙腈（美國(guó)Sigma-Aldrich），色譜級(jí)甲酸（美國(guó)Sigma-Aldrich）；去離子水由Millipore-Q水純化系統(tǒng)（美國(guó)Millipore）制備。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫外分光光度法測(cè)定總黃酮的含量。

（1）對(duì)照品溶液的配制。稱取槲皮苷對(duì)照品12.30 mg，用適量50%甲醇（水溶液，下同）溶解后，完全轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，再加50%甲醇定容至刻度，搖勻，制得1.230 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。準(zhǔn)確量取對(duì)照品儲(chǔ)備液5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加入50%甲醇定容至刻度，搖勻，制成0.246 mg/mL對(duì)照品溶液。

（2）供試品溶液的制備。移取板栗花水提液樣品2.5 mL，過(guò)濾后置于500 mL容量瓶中，先加入純甲醇2.5 mL，再加入50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

（3）檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。取對(duì)照品溶液1.0 mL，加入50%甲醇稀釋9倍后，以50%甲醇為參比溶液，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。再取供試品溶液適量，同法進(jìn)行光譜掃描，以確定檢測(cè)波長(zhǎng)。

（4）線性關(guān)系考察。分別取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL對(duì)照品溶液，置于15 mL容量瓶中，加入50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以50%甲醇為參比溶液，在255 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。以吸光度（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x，μg/mL）進(jìn)行線性回歸，進(jìn)行線性關(guān)系考察。

（5）精密度和穩(wěn)定性考察。取對(duì)照品溶液1.0 mL，加入50%甲醇稀釋9倍后，以50%甲醇為參比溶液，在255 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，重復(fù)6次。計(jì)算得RSD為0.25%，表明儀器精密度良好。取供試品溶液適量，以50%甲醇為參比溶液，在255 nm波長(zhǎng)下分別在0、20、40、60、80、100、120 min時(shí)測(cè)定吸光度，對(duì)精密度和穩(wěn)定性進(jìn)行考察。

（6）重復(fù)性考察。取6份供試品溶液，以50%甲醇為參比溶液，在255 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，進(jìn)行重復(fù)性考察。

（7）加樣回收率考察。取6份1.0 mL 23.12 μg/mL供試品溶液，分別準(zhǔn)確加入1.0、1.0、1.5、1.5、2.0、2.0 mL稀釋14倍的對(duì)照品溶液（16.4 μg/mL），以50%甲醇為參比溶液，在255 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度并計(jì)算總黃酮量，進(jìn)行加樣回收率考察。

（8）樣品測(cè)定。準(zhǔn)確移取適量供試品溶液，以50%甲醇為參比溶液，在255 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，重復(fù)3次。

1.2.2 高效液相色譜法測(cè)定總黃酮的含量。

（1）色譜條件。色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；流動(dòng)相為乙腈-水（水相含0.1%甲酸），梯度洗脫程序?yàn)?～10 min，乙腈20%～80%；流速1.0 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)255 nm。

（2）對(duì)照品溶液的制備。準(zhǔn)確量取1.230 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL，置于25 mL容量瓶中，加入50%甲醇定容至刻度，搖勻，制成0.246 mg/mL對(duì)照品溶液。取對(duì)照品溶液0.5 mL，加入50%甲醇稀釋9倍，過(guò)濾后在上述條件下進(jìn)行HPLC分析。

（3）供試品溶液的制備。移取板栗花水提液樣品2.5 mL，過(guò)濾后置于50 mL容量瓶中，先加入2.5 mL純甲醇，再加入50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。過(guò)濾后在上述條件下進(jìn)行HPLC分析。

（4）線性關(guān)系考察。分別取0.12、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mL對(duì)照品溶液，置于10 mL容量瓶中，加入50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在上述條件進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積，進(jìn)行線性關(guān)系考察。

（5）精密度和穩(wěn)定性考察。取對(duì)照品溶液1.0 mL，加入50%甲醇稀釋9倍后，在上述條件下進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積，重復(fù)6次。取適量供試品溶液，在上述條件下分別在0、20、40、60、80、100、120 min時(shí)進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積，進(jìn)行精密度和穩(wěn)定性考察。

（6）重復(fù)性考察。取6份供試品溶液，在上述條件下進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積，進(jìn)行重復(fù)性考察。

（7）加樣回收率考察。取6份1.0 mL 231.50 μg/mL供試品溶液，分別準(zhǔn)確加入1.0、1.0、1.5、1.5、2.0、2.0 mL稀釋0.5倍的對(duì)照品溶液（164.00 μg/mL），在上述條件下進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積，進(jìn)行加樣回收率考察。

（8）樣品測(cè)定。準(zhǔn)確移取適量供試品溶液，在上述條件下進(jìn)行色譜分析，重復(fù)3次，記錄各色譜峰的峰面積。分別取平均值，代入回歸方程，計(jì)算得供試品溶液中總黃酮的含量。

2 結(jié)果與分析endprint

2.1 紫外分光光度法測(cè)定總黃酮含量的結(jié)果

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。對(duì)照品溶液與供試品溶液在255 nm附近均有最大吸收（圖1），故選擇255 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 線性關(guān)系考察。以吸光度（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x，μg/mL）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為y=0.024 1x-0.013 1，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。結(jié)果表明，在8.20～41.00 μg/mL范圍內(nèi)槲皮苷的吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3 精密度和穩(wěn)定性考察。根據(jù)測(cè)定的對(duì)照品溶液吸光度，計(jì)算得RSD為0.25%，表明儀器精密度良好。根據(jù)測(cè)定的供試品溶液吸光度，計(jì)算得RSD為0.46%，表明樣品的時(shí)間穩(wěn)定性良好，可進(jìn)行紫外測(cè)定。

2.1.4 重復(fù)性考察。根據(jù)測(cè)得的供試品溶液吸光度，計(jì)算得RSD為0.51%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.1.5 加樣回收率考察。在255 nm波長(zhǎng)下測(cè)定的吸光度并計(jì)算總黃酮量的結(jié)果見(jiàn)表1。計(jì)算得平均回收率為100.43%，RSD為3.51%，表明該測(cè)定方法合理。

2.1.6 樣品測(cè)定。3次重復(fù)測(cè)得樣品吸光度分別為0.544、0.542、0.545。取平均值代入回歸方程，計(jì)算得供試品溶液中總黃酮的含量為23.10 μg/mL，則板栗花水提液中總黃酮的含量為4.62 mg/mL。

2.2 高效液相色譜法測(cè)定總黃酮含量的結(jié)果

2.2.1 HPLC分析色譜圖。對(duì)照品溶液進(jìn)行HPLC分析所得色譜圖見(jiàn)圖2，供試品溶液進(jìn)行HPLC分析所得色譜圖見(jiàn)圖3。

2.2.2 線性關(guān)系考察。對(duì)照品溶液以色譜分析峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x，μg/mL）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為y=15.196x-12.037，相關(guān)系數(shù)r=0.999 5。結(jié)果表明，在2.95～98.40 μg/mL范圍內(nèi)槲皮苷的色譜峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度和穩(wěn)定性考察。對(duì)照品溶液峰面積RSD為0.15%，表明儀器精密度良好。供試品溶液峰面積RSD為0.23%，表明樣品的時(shí)間穩(wěn)定性良好，可進(jìn)行色譜測(cè)定。

2.2.4 重復(fù)性考察。計(jì)算得6份供試品溶液峰面積RSD為0.22%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.5 加樣回收率考察。6份已知濃度的供試品溶液加入稀釋的對(duì)照品溶液進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2。計(jì)算得平均回收率為99.95%，RSD為1.05%，表明該測(cè)定方法合理。

2.2.6 樣品測(cè)定。計(jì)算得供試品溶液中總黃酮的含量為231.87 μg/mL（表3），則板栗花水提液中總黃酮的含量為4.64 mg/mL。

3 結(jié)論與討論

測(cè)定植物提取液中總黃酮含量的常用方法有紫外分光光度法和高效液相色譜法[10]，兩者各有所長(zhǎng)[11]。紫外分光光度法是測(cè)定總黃酮最經(jīng)典的方法，有著操作簡(jiǎn)單、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但該方法特征性不強(qiáng)，不同成分的紫外響應(yīng)差異較大，且對(duì)照品的選擇對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有著很大影響，因而普遍認(rèn)為紫外分光光度法不能準(zhǔn)確測(cè)定總黃酮的含量。高效液相色譜法的準(zhǔn)確性、精密度和重復(fù)性通常均高于紫外分光光度法，但因?yàn)橹参锾崛∫撼煞謴?fù)雜，色譜分離條件較難確定，且將該法用于定量分析時(shí)需要較多的對(duì)照品，所以對(duì)高效液相色譜法的接受程度不高。

板栗花黃酮具有其特殊性，前期研究中分析板栗花水提液的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)槲皮素及其苷（酯）類(lèi)成分的含量較高。因此，本研究選擇在水相中溶解性較好的槲皮苷作為對(duì)照品，采用紫外分光光度法和高效液相色譜法對(duì)板栗花水提液中的總黃酮進(jìn)行定量測(cè)定，在方法上具有合理性。紫外分光光度法測(cè)得板栗花水提液中總黃酮的含量以槲皮苷計(jì)為4.62 mg/mL，高效液相色譜法測(cè)得板栗花水提液中總黃酮的含量以槲皮苷計(jì)為4.64 mg/mL，2種方法所得結(jié)果基本一致，重復(fù)性高，均能較客觀地反映板栗花水提液中總黃酮的含量。另外，本研究結(jié)果也說(shuō)明在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中完全可用紫外分光光度法替代高效液相色譜法，對(duì)板栗花水提液中總黃酮的含量進(jìn)行快速測(cè)定。

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