非酒精性脂肪肝患者血清中exosomes的水平及意義

石柳 湯建華 溫建軍 曹德清 劉雪 林曄 張靜智

【摘要】 目的：探討非酒精性脂肪肝患者血清中exosomes的水平及其對(duì)肝細(xì)胞脂代謝的影響。方法：通過(guò)Western-blotting，透射電鏡、Nanosight鑒定exosomes；并通過(guò)BCA蛋白定量的方法檢測(cè)19例NAFLD患者（NAFLD組），18例健康對(duì)照（健康對(duì)照組）血清中exosomes內(nèi)蛋白含量；將10 μg的exosomes與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)，48 h后，收集細(xì)胞，GPO-PAP法檢測(cè)其中總膽固醇（TC）和總甘油三酯（TG）的表達(dá)；通過(guò)Western-blotting檢測(cè)腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的磷酸化水平。

結(jié)果：exosomes高表達(dá)CD9、CD63、CD81，呈圓形或橢圓形，直徑在40～210（110.00±21.36） nm。NAFLD組中的exosomes蛋白水平明顯高于健康對(duì)照（P<0.05）。exosomes與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)后，其TC、TG的表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：exosomes可影響AMPK通路的活性，在肝細(xì)胞的脂代謝過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，促進(jìn)了非酒精性脂肪肝的發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】 非酒精性脂肪肝； exosomes； AMPK； 脂肪代謝

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種慢性代謝應(yīng)激性肝損傷，與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)，發(fā)病率在全球范圍內(nèi)達(dá)10%～40%[1]。其病理改變與酒精性肝損傷類似，但患者無(wú)酗酒病史。近年來(lái)，NAFLD的發(fā)病率呈快速增長(zhǎng)且趨低齡化，與心血管死亡率增加具有相關(guān)性，已成為影響人類健康的重要障礙之一[2-3]。高血脂、高血糖、肥胖是NAFLD的危險(xiǎn)因素，然而其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前的報(bào)道提出的“二次打擊”學(xué)說(shuō)，四步驟學(xué)說(shuō)等均不能完全解釋清楚其發(fā)病機(jī)制[4]。

外泌體（exosomes）是一種由細(xì)胞分泌的，直徑為40～100 nm的小囊泡參與胞間通訊，介導(dǎo)多種生理及病理過(guò)程[5]。exosomes包含著蛋白質(zhì)、microRNA、LncRNA等生物活性物質(zhì)[6]。exosomes由于具有膜性結(jié)構(gòu)，能穩(wěn)定存在不易被降解，可將有效的生物活性物質(zhì)運(yùn)送至靶組織發(fā)揮作用。本研究通過(guò)檢測(cè)NAFLD患者血清中exosomes的水平及其對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的作用，探索其在NAFLD進(jìn)展中的作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取NAFLD患者19例（NAFLD組，男10例，女9例），同時(shí)選取年齡性別匹配的體檢健康者18例（健康對(duì)照組，男9例，女9例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）2016年6月-2017年6月本院就診的NAFLD患者；（2）本研究所需的檢查資料完整；（3）所有入組對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）病毒性、藥物性、酒精性等原因引起的肝臟疾病；（2）長(zhǎng)期大量飲酒病史；（3）嚴(yán)重的心、腎臟疾病及其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。NAFLD的診斷標(biāo)準(zhǔn)按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組制定的《非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年修訂版）》。本研究通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，抽取外周靜脈血5 mL，3000 r/min離心10 min，分離血清，-80 ℃保存。

1.2 試劑和儀器 人肝癌細(xì)胞株HepG2（武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心），exosomes提取試劑盒（銳博公司），BCA蛋白定量試劑盒（碧云天公司），酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司），兔多克隆抗體AMPK（CST公司），兔多克隆抗體p-AMPK（CST公司），Nanosight（技術(shù)服務(wù)），透射電子顯微鏡（技術(shù)服務(wù)），TC、TG檢測(cè)試劑盒（南京建成生物）。

1.3 血清中exosomes的蛋白含量檢測(cè) 收集研究對(duì)象的外周血血清250 mL，按銳博試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行exosomes的提取。取20 μL樣品用RIPA裂解后，通過(guò)BCA法檢測(cè)其蛋白含量。

1.4 exosomes的鑒定 通過(guò)Western-blotting法檢測(cè)exosomes的表面特異性標(biāo)記CD9、CD63、CD81，Nanosight其直徑分布。投射電鏡觀察其形態(tài)。

1.5 GPO-PAP法測(cè)定TC、TG的表達(dá)水平 將10 μg的exosomes加入HepG2細(xì)胞中共培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞加入裂解液，按TC、TG測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 AMPK磷酸化水平檢測(cè) Western-blotting檢測(cè)細(xì)胞裂解物中AMPK的磷酸化水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)或Manne Whitney U檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 exosomes的鑒定 Western-blotting結(jié)果示，exosomes表達(dá)CD9、CD63、CD81（圖1A），通過(guò)透射電鏡下觀察exosomse的形態(tài)，其呈圓形（圖1B），Nanosight示直徑為（110.00±21.36）nm，帶有完整的膜性結(jié)構(gòu)（圖1C，Bar 200 nm）。

2.2 不同來(lái)源血清e(cuò)xosomes中蛋白含量的比較 NAFLD組和健康對(duì)照組，分離提取exosomes后，BCA結(jié)果示，NAFLD組exosomes中的蛋白含量為（1.31±0.15）mg/mL，明顯高于健康對(duì)照組的（0.72±0.12）mg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 exosomes影響HepG2細(xì)胞TC、TG的表達(dá) 10 μg的exosomes與 HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，檢測(cè)細(xì)胞裂解物中TC、TG的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，NAFLD組患者來(lái)源的exosomes能促進(jìn)HepG2細(xì)胞表達(dá)TC、TG，其中TC為（0.85±0.23）mmol/gprot vs （0.15±0.07）mmol/gprot，TG為（0.97±0.18）mmol/gprot vs （0.28±0.06）mmol/gprot，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖3。

2.4 exosomes對(duì)HepG2細(xì)胞AMPK磷酸化水平 AMPK信號(hào)通路是脂肪代謝最重要的途徑之一，exosom是否通過(guò)該通路調(diào)控HepG2細(xì)胞的脂代謝呢？進(jìn)一步檢測(cè)exosomes對(duì)HepG2細(xì)胞AMPK磷酸化水平的影響，Western-blotting結(jié)果示，與健康對(duì)照組相比，NAFLD組患者來(lái)源的exosomes能抑制AMPK的磷酸化水平，AMPK的活性受到了抑制，見(jiàn)圖4。

3 討論

NAFLD表現(xiàn)為彌漫性的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變形壞死，患者無(wú)過(guò)量飲酒史，肥胖、2型糖尿病、血脂、血壓異常也增加了NAFLD的患病風(fēng)險(xiǎn)，這幾個(gè)因素之間相互影響[7]。近年來(lái)對(duì)NAFLD的診斷及治療得到了很大的提升，然而其發(fā)病率仍居高不下，療效仍欠佳。隨著研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)了exosomes參與了許多疾病的發(fā)生及發(fā)展，在機(jī)體不同系統(tǒng)之間的通訊起了重要的作用。Peinado等[8]研究發(fā)現(xiàn)，惡性黑色素瘤的exosomes可調(diào)節(jié)骨髓祖細(xì)胞的活動(dòng)，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，且exosomes的表達(dá)水平與患者的預(yù)后密切相關(guān)。同時(shí)，不斷有研究指出，exosomes在疾病的不同發(fā)展時(shí)期有著特異性表型，尤其在肝臟疾病中，exosomes可影響肝細(xì)胞的生長(zhǎng)方式[9-10]。因此，有學(xué)者提出exosomes可能作為一個(gè)潛在的疾病生物學(xué)標(biāo)記物，可作為液體活檢應(yīng)用于包括NAFLD在內(nèi)的慢性疾病中[10-12]。

本研究結(jié)果顯示，血清中exosomes水平與NAFLD具有密切的關(guān)系。在NAFLD患病組中的exosomes水平與健康對(duì)照相比明顯升高（P<0.05），這表明，exosomes在一定程度上反映了NAFLD疾病的發(fā)展程度。其可能的原因是：exosomes具有的脂質(zhì)雙分子膜性結(jié)構(gòu)使得其可將核酸、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)隨體液循環(huán)運(yùn)輸至全身各器官組織，調(diào)控靶細(xì)胞的生命活動(dòng)。在NAFLD進(jìn)展過(guò)程中，各系統(tǒng)代謝出現(xiàn)異常，因此出現(xiàn)exosomes的改變。同時(shí)，文獻(xiàn)[12-14]報(bào)道，胃癌患者血清中的exosomes與腫瘤的轉(zhuǎn)移、TNM分期及分化程度密切相關(guān)。許多研究指出，exosomes可作為載體將RNA轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處組織，并在受體細(xì)胞中檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)[15-16]。這表明，exosomes可穩(wěn)定地運(yùn)輸RNA，并借用靶細(xì)胞中的翻譯工具完成蛋白的表達(dá)。有趣的是，最近有研究指出，檢測(cè)血液中exosomes的蛋白磷酸化水平可作為監(jiān)測(cè)乳腺癌進(jìn)展的手段[17]。以往的研究表明，蛋白的磷酸化和去磷酸化可作為許多生命活動(dòng)的開(kāi)關(guān)，直接調(diào)控疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究中，筆者也發(fā)現(xiàn)了在NAFLD來(lái)源的exosomes可抑制HepG2細(xì)胞的AMPK的磷酸化水平，從而影響其脂代謝過(guò)程，導(dǎo)致甘油三酯和總膽固醇的累積。據(jù)報(bào)道，AMPK是脂代謝途徑最重要的蛋白之一，其活性受抑制后，可導(dǎo)致脂肪沉積及胰島素抵抗[18-20]。由此，exosomes可能攜帶了母細(xì)胞的某些活性物質(zhì)至靶細(xì)胞，影響靶細(xì)胞的功能，最終通過(guò)級(jí)聯(lián)效應(yīng)，影響肝臟細(xì)胞分解代謝脂肪。與我們的研究結(jié)果一致，于寧等[21]也提出，膽汁中的exosomes可以下調(diào)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2的磷酸化水平，促進(jìn)miR-15A的表達(dá)，從而導(dǎo)致抑制膽管上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。由此，exosomes在肝臟疾病的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用?？梢酝ㄟ^(guò)檢測(cè)血清中exosomes測(cè)患者的疾病進(jìn)展，替代病理學(xué)對(duì)疾病進(jìn)行診斷，作為無(wú)創(chuàng)診斷的標(biāo)志物。以exosomes為代表的液體活檢的發(fā)展，將大大促進(jìn)對(duì)NAFLD的診治。

本研究創(chuàng)新性地提出了exosomes通過(guò)攜帶生物活性物質(zhì)，影響靶細(xì)胞的AMPK磷酸化水平，從而影響了NAFLD的發(fā)展，為疾病的診治提出了新的靶點(diǎn)。然而，由于缺乏對(duì)exosomes作用機(jī)制的深入研究，本研究仍無(wú)法闡釋exosomes如何通過(guò)AMPK影響NAFLD的進(jìn)展。下一步應(yīng)通過(guò)蛋白組學(xué)研究exosomes的成分，并通過(guò)生物信息學(xué)分析，篩選可能作為exosomes作用“幫手”的目的蛋白，進(jìn)一步揭示exosomse的作用機(jī)制，為其進(jìn)一步應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2018-05-29） （本文編輯：程旭然）