半仿生-酶法提取虎杖中大黃素的工藝研究

仙 靚，郭增軍，覃源芮，張 卉

(西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061)

虎杖為蓼科(Polygonaceae)虎杖屬(Reynoutria)植物虎杖(ReynoutriajaponicaHoutt.)的干燥根莖和根，又名陰陽蓮、苦杖和大葉蛇總管等，是我國傳統(tǒng)中藥[1-5]，有活血定痛、清熱利濕、解毒、化痰止咳等功效[6-8]，臨床主治濕熱黃疸、肺熱咳嗽、瘡癰腫毒、關(guān)節(jié)痹痛、經(jīng)閉經(jīng)痛、水火燙傷和跌打損傷等癥[9-11]。虎杖中主要含有蒽醌類、芪類、黃酮類及酚類等成分[12]，蒽醌類主要為大黃素、大黃酚、大黃酸和蒽苷等；芪類主要為白藜蘆醇和白藜蘆醇苷[13]。這些成分具有抗血栓、降糖[14]、降脂、抗菌、保肝、瀉下和抗癌[15-16]等重要生理活性。目前，對(duì)虎杖的藥理學(xué)研究越來越深入，其在臨床上的用途越來越廣泛，其中很多單體成分已在醫(yī)藥、化工及食品等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用[17]。因此，研究虎杖活性成分的提取和分離具有重要的意義。

半仿生-酶法提取是在半仿生提取法的基礎(chǔ)上，加入中藥提取中常用的生物酶[18]，先對(duì)植物細(xì)胞壁進(jìn)行酶解，使植物細(xì)胞中的有效成分溶出，再按照半仿生提取法的原理，模擬藥物在胃腸道中轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的環(huán)境，對(duì)中藥的有效成分進(jìn)行提取[19]。

本文采用半仿生-酶法對(duì)虎杖藥材中的大黃素進(jìn)行提取，并通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化以期得到最佳工藝，從而為從其他植物中提取此成分提供新方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 AE240電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(河南鞏義英峪予華儀器廠)；KQ3200B型超聲儀器(昆山超聲儀器有限公司)；UV-1800紫外可見分光光度儀(日本島津公司)；Thermo Spectra System P2000高效液相色譜儀(美國Thermo公司)；HWS-26友聯(lián)電熱恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所)；RE-5210A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2試藥 干燥的虎杖藥材購自西安華中藥材批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)郭增軍教授鑒定為蓼科虎杖屬多年生草本植物虎杖(ReynoutriajaponicaHoutt.)的干燥根莖和根。大黃素對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110756-200110)。甲醇，乙醇，果膠酶，纖維素酶，β-葡聚糖酶，磷酸，一水合檸檬酸和十二水合磷酸氫二鈉等試劑均為分析純。高效液相用甲醇為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1繪制大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取干燥至恒質(zhì)量的大黃素對(duì)照品1 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶液定容至刻度，得儲(chǔ)備液，備用。依次精密量取上述儲(chǔ)備液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL，分別置于10 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為0.002，0.004，0.006，0.008，0.010和0.012 mg·mL-1的溶液，用0.25 μm濾膜過濾。采用HPLC法測(cè)定，流動(dòng)相為甲醇-0.5 mL·L-1磷酸水溶液(80∶20)，檢測(cè)波長為284 nm，色譜柱為Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣20 μL，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣3次。以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、大黃素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，得回歸方程y=25 415 514.28x-5 174.27，r=0.999 8，線性范圍為0.002～0.012 mg·mL-1。

2.2優(yōu)化半仿生-酶法提取工藝

2.2.1活性酶的優(yōu)選 精密稱量3份虎杖藥材各10 g，分別置于100 mL圓底燒瓶中，用50 mL蒸餾水處理24 h，用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液將pH值調(diào)至4.5后，分別在上述溶液體系中加入β-葡聚糖酶、果膠酶和纖維素酶各0.05 g，并在50 ℃水浴條件下酶解處理2 h。酶解過濾后的藥渣用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇100 mL回流提取2次，每次2 h。合并濾液，真空減壓濃縮得浸膏。取干燥浸膏40 mg，分別置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解定容至刻度。經(jīng)0.25 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣體積為20 μL，采用2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定浸膏中大黃素的含量。結(jié)果表明，3種酶從質(zhì)量分別為4.72，4.71和5.13 g的浸膏中提取的大黃素含量分別為1.45，3.19和4.13 mg。根據(jù)干浸膏質(zhì)量和大黃素含量，選擇纖維素酶作為半仿生-酶法提取中的提取酶。

2.2.2半仿生-酶法正交設(shè)計(jì) 確定纖維素酶作為提取酶后，選定時(shí)間、溫度和料液比作為提取優(yōu)化的3個(gè)因素，每個(gè)因素下設(shè)置3個(gè)不同水平，即提取溫度(60，70和80 ℃)，提取時(shí)間(1.5，2.0和2.5 h)，料液比(1∶14，1∶18和1∶22 mg·mL-1)。按照L9(34)正交表優(yōu)選大黃素提取的最佳工藝。

2.2.3半仿生-酶法提取大黃素 精密稱量10 g虎杖藥材并加入檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH值為2.0)，在50 ℃水浴條件下處理2 h后調(diào)節(jié)pH值為4.5。加入0.05 g纖維素酶后，在50 ℃水浴條件下酶解40 min。在過濾后的濾渣中先后加入pH值為7.5和8.3的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，在不同的水浴溫度和時(shí)間組合條件下進(jìn)行提取，見表1，將3次提取液合并、蒸干。

2.2.4HPLC法測(cè)定大黃素的含量 取半仿生-酶法得到的浸膏10 mg，置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解定容。按照2.1項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定浸膏中的大黃素含量。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知，溫度是從虎杖中提取大黃素的最主要影響因素，其次是時(shí)間，最后是料液比，最佳的提取工藝條件為A2B2C2，即提取溫度70 ℃，料液比1∶18，提取時(shí)間2 h。

表1半仿生-酶法正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

Tab.1 The orthogonal design and analytical results of semi-bionic enzyme extraction

2.3方法學(xué)考察

2.3.1精密度實(shí)驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為0.010 mg·mL-1的大黃素對(duì)照品溶液，用0.25 μm濾膜過濾，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄數(shù)據(jù)。RSD值為1.27%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.3.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取按照最佳提取工藝條件提取的浸膏100 mg，置于25 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解，搖勻。精密量取上述溶液2 mL，置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解，定容至刻度。按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣5次，計(jì)算得RSD值為1.73%，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)方法和儀器重復(fù)性較好。

2.3.3加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取100 mg最佳提取工藝條件提取所得浸膏，分別加入含量為80%，100%和120%的大黃素對(duì)照品溶液5 mL，置于25 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解，搖勻。精密量取上述溶液5 mL，置于50 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解，定容至刻度。按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定浸膏中的大黃素含量，計(jì)算加樣回收率(對(duì)照品理論值-對(duì)照品實(shí)測(cè)值/對(duì)照品加入量×100%)。平均加樣回收率為78.92%，RSD值為2.90%。

2.3.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 稱取3份虎杖藥材各10 g，分別置于3個(gè)圓底燒瓶中，加入80 mL pH值為2.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，50 ℃恒溫振搖2 h，調(diào)節(jié)pH值為4.5后，分別加入0.05 g纖維素酶，在50 ℃水浴條件下酶解40 min。過濾后的濾渣順次加入50 mL pH值為7.5和8.3的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液。在80 ℃水浴溫度下提取2 h，減壓濃縮后得浸膏。精密稱取上述浸膏10 mg，置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解定容至刻度。按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定浸膏中大黃素的含量。3個(gè)批次中相同質(zhì)量浸膏中用此方法提取的大黃素含量幾乎相等，結(jié)果表明，半仿生-纖維素酶法提取工藝穩(wěn)定、重復(fù)性較好。

2.4其他提取工藝

2.4.1超聲提取法 取虎杖藥材10 g，加入蒸餾水，料液比為1∶40。50 ℃預(yù)熱20 min后，超聲30 min，占空比為2∶1。過濾，濾液減壓濃縮后得浸膏。稱取上述浸膏10 mg，置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解，定容。用0.25 μm濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL，測(cè)定大黃素的含量。

2.4.2微波提取法 取虎杖藥材10 g，加入蒸餾水，料液比為1∶40。放入微波爐中進(jìn)行提取，功率為480 W，提取溫度為70 ℃，累積微波時(shí)間為20 min，每微波2 min停止3 min。過濾，濾液減壓濃縮后得浸膏。稱取上述浸膏10 mg，置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解定容。用0.25 μm濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL，測(cè)定其中大黃素的含量。

2.4.3醇提法 取虎杖藥材10 g，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，料液比為1∶20。90 ℃回流提取2次，每次2 h。提取液減壓濃縮后得浸膏。稱取10 mg浸膏，置于10 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解，用0.25 μm濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL，測(cè)定大黃素含量。

與超聲、微波和醇提法相比，半仿生-酶法提取的干浸膏質(zhì)量和大黃素含量均明顯高于其他3種提取方法。因此，半仿生-酶法相較其他方法，能更有效地提取虎杖中的大黃素。

3 結(jié)論

虎杖中含有大量的大黃素和大黃酚等蒽醌類化合物，具有重要的藥理活性。本文從提取虎杖中大黃素的角度出發(fā)，應(yīng)用了一種新型的提取技術(shù)，即半仿生-酶法。通過實(shí)驗(yàn)確定其最佳提取酶為纖維素酶。通過正交實(shí)驗(yàn)，確定其最佳提取條件為：溫度70 ℃，料液比1∶18，提取時(shí)間2 h。通過與超聲提取法、微波提取法和醇提法3種傳統(tǒng)方法比較，明確了半仿生-酶法提取虎杖中大黃素具有較高的提取效率。該法既節(jié)約了藥材的使用量，又使大黃素能夠充分的富集。為后續(xù)研究虎杖中蒽醌類化學(xué)成分提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為將半仿生-酶法用于提取其他植物的有效成分奠定理論基礎(chǔ)。

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