細(xì)胞膜色譜技術(shù)應(yīng)用于中藥活性成分篩選的研究進(jìn)展

徐 碩，姜文清，鄺詠梅，徐文峰，金鵬飛

(北京醫(yī)院藥學(xué)部，國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心，藥物臨床風(fēng)險(xiǎn)與個(gè)體化應(yīng)用評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

生物膜上存在多種活性蛋白，細(xì)胞通過(guò)膜上的受體和離子通道等信息靶點(diǎn)與其他細(xì)胞、組織進(jìn)行信息傳遞、交流、分析、綜合，維持機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的平衡，實(shí)現(xiàn)生命活動(dòng)[1]。細(xì)胞膜上的受體、通道能選擇性地識(shí)別藥物中的化學(xué)成分并與之特異性結(jié)合，通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)第2或第3信使分子導(dǎo)致一定的生物效應(yīng)，最終產(chǎn)生藥理作用[2]。

細(xì)胞膜色譜法(cell membrane chromatography，CMC)是將活性組織細(xì)胞膜固定在特定載體表面，制備成細(xì)胞膜固定相，以緩沖溶液為流動(dòng)相，將藥物添加在流動(dòng)相中，利用色譜學(xué)技術(shù)研究藥物與固定相之間作用規(guī)律的受體動(dòng)力學(xué)新方法[3-4]。

CMC技術(shù)在中藥活性成分的研究中具有優(yōu)勢(shì)，本文綜述了CMC技術(shù)在中藥活性成分篩選應(yīng)用中的研究進(jìn)展，以期為進(jìn)一步發(fā)展該技術(shù)提供參考。

1 CMC的基本原理和特點(diǎn)

CMC與高效液相色譜(HPLC)、細(xì)胞生物學(xué)和受體藥理學(xué)等內(nèi)容相結(jié)合，運(yùn)用藥物與膜受體之間的特異性親和力，將藥物在體內(nèi)的作用過(guò)程在色譜柱內(nèi)進(jìn)行動(dòng)態(tài)模擬。研究藥物與固定相上細(xì)胞膜和受體的相互作用，獲得如容量因子k′和不對(duì)稱因子As等色譜參數(shù)，可為闡明藥物的作用機(jī)制、藥物與受體親和作用以及新藥開(kāi)發(fā)等方面提供參考[5-6]。

2 在中藥活性成分篩選中的應(yīng)用

近年來(lái)，CMC在中藥活性成分篩選研究中的應(yīng)用涉及到多個(gè)方面，見(jiàn)表1。

2.1抗炎鎮(zhèn)痛活性成分的篩選 王建寰等[7]從老瓜頭二氯甲烷和乙酸乙酯萃取部位分得4個(gè)化合物，正丁醇部位分得2個(gè)化合物，總生物堿中分得1個(gè)化合物。采用 SD 大鼠大腦皮層細(xì)胞制備細(xì)胞膜固定相，初篩了老瓜頭的鎮(zhèn)痛抗炎活性部位和活性成分，結(jié)果表明，華北白前醇、老瓜頭總生物堿和7-脫甲氧基娃兒藤堿可較強(qiáng)結(jié)合SD大鼠大腦細(xì)胞膜上的受體或靶點(diǎn)，但其作用靶點(diǎn)和機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

5-羥色胺(5-HT)受體在偏頭痛發(fā)病中起重要作用。杜暉等[8]通過(guò)大鼠紋狀體組織獲得色譜固定相，運(yùn)用細(xì)胞膜色譜結(jié)合液相色譜技術(shù)，特異性地識(shí)別川芎-白芷藥對(duì)中可與固定相上受體相互作用的配體，發(fā)現(xiàn)歐前胡素是其潛在的活性成分。以不同濃度5-HT1D受體激動(dòng)劑舒馬普坦為模型藥物，采用硝酸甘油致大鼠偏頭痛模型對(duì)生物活性進(jìn)行驗(yàn)證。

表1CMC技術(shù)應(yīng)用于中藥活性成分篩選的不同細(xì)胞膜類型

Tab.1 Application of CMC technique in different cell membrane types for screening bioactive components from traditional Chinese medicine

活性成分類型細(xì)胞膜類型中藥抗炎鎮(zhèn)痛大腦皮層細(xì)胞膜老瓜頭[7]紋狀體組織細(xì)胞膜川芎-白芷藥對(duì)[8]抗心血管疾病CD40高表達(dá)細(xì)胞膜丹參[9]β1腎上腺素受體(β1-AR)細(xì)胞膜羌活[10]、夏天無(wú)[11]血管平滑肌細(xì)胞膜白芷、羌活、北沙參、蛇床子[12-13];五味子、南五味子[14];佛手[15];當(dāng)歸[16]心肌細(xì)胞膜川芎[17]、附子[18-19]抗糖尿病胰島β細(xì)胞膜黃連[20]抗腫瘤人肝癌HepG2細(xì)胞膜苦參[21]人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞膜厚樸[22]成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體4(FGFR4)細(xì)胞膜白芥子[23]紅細(xì)胞膜金刷把[24]血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR-2)高表達(dá)細(xì)胞膜烏頭[25]表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)高表達(dá)細(xì)胞膜馬錢子[26]SMMC-7721細(xì)胞、HepG2細(xì)胞鴉膽子[27]成骨牙周韌帶細(xì)胞膜黃連[28]抗過(guò)敏嗜堿性粒細(xì)胞性白血病RBL-2H3細(xì)胞膜胡椒[29]、紅花[30]

2.2抗心血管疾病活性成分的篩選 林蓉等[9]對(duì)丹參中抗動(dòng)脈粥樣硬化的活性成分進(jìn)行了篩選。通過(guò)建立CD40高表達(dá)的內(nèi)皮細(xì)胞(ECV-304)，得到細(xì)胞膜固定相，即利用CD40高表達(dá)的內(nèi)皮細(xì)胞膜色譜模型進(jìn)行研究。結(jié)果表明，丹參脂溶性和水提取部位均與CD40高表達(dá)細(xì)胞膜具有親和作用，從這2個(gè)部位中分得的丹參酮ⅡA、丹參酮ⅠA和丹參素為其活性成分。

心肌組織中主要分布β1-AR。在臨床中,β1-AR受體阻滯劑是治療心肌缺血、心肌梗死和慢性心臟衰竭等疾病的常用藥物。Yue Y等[10]采用高表達(dá)β1-AR的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 CHO-S，構(gòu)建了CMC體系，篩選羌活中作用于β1-AR的活性成分，結(jié)果表明，異歐前胡素為其有效成分。王新等[11]建立了以β1腎上腺素受體(β1-AR)細(xì)胞膜色譜與UPLC-MS聯(lián)用技術(shù)，篩選鑒別夏天無(wú)中的活性成分。采用美托洛爾和藥根堿處理β1-AR/CHO-S 細(xì)胞24 h，換異丙腎上腺素?fù)p傷細(xì)胞10 h后，ELISA法測(cè)定活性成分對(duì)β1-AR下游因子cAMP和PKA水平的影響，評(píng)價(jià)其對(duì)β1-AR的抑制作用。結(jié)果表明，藥根堿是夏天無(wú)中具有β1-AR抑制作用的活性成分，β1-AR/CMC-offline-HPLC/MS分析方法能夠快速且有效篩選出作用靶點(diǎn)明確的活性成分，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和生物效應(yīng)具有一致性。

Hou X F等[12]將建立的大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞CMC系統(tǒng)與離線GC-MS技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，研究了作用于L-型鈣通道的活性成分。結(jié)果從白芷、羌活和北沙參中篩選得到歐前胡素，從蛇床子中篩得蛇床子素，蛇床子素是蛇床子中含量最高的一種羥基香豆素類有效成分[13]。

Yang X等[14]建立了來(lái)源于大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞膜色譜，結(jié)合HPLC-MS技術(shù)，對(duì)五味子和南五味子中具有血管擴(kuò)張作用的成分進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，去氧五味子素和五味子酯甲是其活性成分。去氧五味子素能夠競(jìng)爭(zhēng)性拮抗硝苯地平與細(xì)胞膜受體的結(jié)合，去氧五味子素與五味子酯甲部分重疊VSM細(xì)胞膜的結(jié)合位點(diǎn)。體外實(shí)驗(yàn)表明，去氧五味子素和五味子酯甲對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈(先用氯化鉀進(jìn)行處理)具有擴(kuò)張作用，且呈劑量依賴性。

王艷微等[15]采用大鼠血管平滑肌細(xì)胞膜色譜模型(VSM/CMC)篩選，LC-MS離線分析，結(jié)合離體藥理實(shí)驗(yàn)確定佛手舒張血管的有效成分。結(jié)果顯示，佛手柑內(nèi)酯具有舒張血管作用。化合物在VSM/CMC的保留特性與其藥理活性的相關(guān)性十分顯著，說(shuō)明化合物與細(xì)胞膜和膜蛋白之間的相互作用可通過(guò)VSM/CMC模型反映出來(lái)。

趙惠茹等[16]對(duì)當(dāng)歸中具有舒張主動(dòng)脈血管作用的成分進(jìn)行篩選。采用CMC篩選，TLC法分離，結(jié)合體外藥理實(shí)驗(yàn)對(duì)活性成分進(jìn)行確認(rèn)。結(jié)果表明，化合物與細(xì)胞膜和膜蛋白之間的相互作用可通過(guò)血管CMC模型體現(xiàn)出來(lái)，化合物在CMC系統(tǒng)里的保留特性與其藥理活性的相關(guān)性十分明顯，當(dāng)歸具有血管舒張作用的有效部位是其乙醚提取物。

岳宣峰等[17]將家兔心肌細(xì)胞膜與硅膠載體進(jìn)行固定，通過(guò)比對(duì)川芎水提液、醇提液與心肌細(xì)胞膜上已知受體的部分激動(dòng)劑和拮抗劑在心肌細(xì)胞膜色譜柱中的保留特性，對(duì)川芎提取液和心肌細(xì)胞膜受體的相互作用進(jìn)行探討。結(jié)果表明，水提液和醇提液均能在心肌細(xì)胞膜色譜柱上得到保留，β1受體激動(dòng)劑不影響水提液的保留特性，而這種特性受到α受體阻斷劑競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的影響。結(jié)果表明，與α受體作用的有效成分存在于川芎水提液中，而水提液中沒(méi)有與β1受體作用的有效成分，與心肌細(xì)胞膜受體作用的成分也存在于醇提液中。

中醫(yī)將附子用于“回陽(yáng)救逆”，研究表明，去甲烏藥堿是附子的強(qiáng)心成分[18]。曹巖等[19]通過(guò)CMC和HPLC-TOF/MS技術(shù)相結(jié)合，對(duì)附子中的活性成分進(jìn)行初步篩選和鑒定。采用大鼠心肌細(xì)胞膜色譜柱，以10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，色譜分離采用C18柱，以1 mL·L-1甲酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相，利用質(zhì)譜對(duì)化合物進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，苯甲酰烏頭胺和苯甲酰新烏頭胺和苯甲酰次烏頭胺等8種成分可能是附子中的活性成分。

2.3抗糖尿病活性成分的篩選 磺酰脲受體(SUR)分布于胰島β細(xì)胞膜上，當(dāng)SUR與磺酰脲藥物相結(jié)合之后，可對(duì)胰島素的釋放產(chǎn)生促進(jìn)作用。Tang C等[20]研究了黃連中作用于SUR的活性成分，通過(guò)CMC技術(shù)，將小鼠胰島細(xì)胞和毛細(xì)管相結(jié)合，得到細(xì)胞膜毛細(xì)管色譜固定相，結(jié)果表明，篩選出的有效成分為小檗堿。

2.4抗腫瘤活性成分的篩選 Chen X等[21]對(duì)黃柏和苦參中的抗腫瘤活性成分進(jìn)行研究，建立了HepG2細(xì)胞膜色譜模型，并與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用，結(jié)果黃連素和延胡索乙素、苦參堿和氧化苦參堿分別從黃柏和苦參中被篩選出來(lái)。這4種成分類似于吉非替尼，能夠作用于HepG2細(xì)胞膜上的表皮生長(zhǎng)因子受體；通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)：黃連素和延胡索乙素能夠抑制HepG2 細(xì)胞的增殖，且這種作用呈濃度依賴性。

Hou X等[22]對(duì)厚樸中的抗乳腺癌活性成分進(jìn)行篩選，MDA-MB-231細(xì)胞膜固定相的制備是以硅膠作為載體，與2D LC-MS技術(shù)聯(lián)用，結(jié)果表明，和厚樸酚和木蘭醇是其抗乳腺癌的有效成分。

腫瘤細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體4(FGFR 4)以及FGFR 4信號(hào)通路的激活密切相關(guān)，可以根據(jù)這個(gè)特性篩選活性成分。Zhang T等[23]對(duì)白芥子中可作用于FGFR 4的化合物進(jìn)行篩選。通過(guò)建立能夠用于識(shí)別-篩選-鑒定與FGFR 4相結(jié)合成分的二維在線聯(lián)用系統(tǒng)，考察FGFR 4/CMC-HPLC/MS體系的專屬性、可靠性和重復(fù)性，最終篩選出芥子堿為白芥子中的有效成分。

張博等[24]運(yùn)用柱色譜技術(shù)分離金刷把中的化學(xué)成分，通過(guò)兔紅細(xì)胞膜色譜模型進(jìn)行篩選，結(jié)合MTT比色法，篩選出具有抑制HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)作用的化合物。結(jié)果顯示，乙醚萃取部位為具有細(xì)胞毒活性的有效部位，從中分得的化合物為活性成分。結(jié)果表明，該模型能使細(xì)胞毒性成分與細(xì)胞膜、膜受體之間的相互作用在分子水平上得以體現(xiàn)，顯著的保留特性可通過(guò)色譜過(guò)程表現(xiàn)出來(lái)。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR-2)在卵巢癌和甲狀腺癌等腫瘤中過(guò)度表達(dá)。Li M等[25]通過(guò)VEGFR高表達(dá)CMC結(jié)合HPLC-MS技術(shù)，對(duì)烏頭中作用于VEGFR-2的有效成分進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，次烏頭堿、烏頭堿和海帕烏頭堿為其中的活性成分。

表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)在多種人惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。Sun M等[26]對(duì)馬錢子中具有抗EGFR的活性成分進(jìn)行篩選。EGFR高表達(dá)的HEK293細(xì)胞膜固定相是通過(guò)以硅膠為載體進(jìn)行制備，與HPLC-MS技術(shù)聯(lián)用，篩選出的主要有效成分為馬錢子堿和士的寧。體外實(shí)驗(yàn)表明，馬錢子堿和士的寧能使HEK293/EGFR細(xì)胞的增殖以及胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Erk)的磷酸化得到明顯抑制，對(duì)下游傳導(dǎo)信號(hào)分子的表達(dá)也具有抑制作用。

紀(jì)松崗等[27]建立了SMMC-7721細(xì)胞-鴉膽子和HepG2細(xì)胞-鴉膽子的全二維細(xì)胞膜色譜-整體柱色譜的高通量活性成分篩選模型，用于篩選鴉膽子油的抗腫瘤活性成分。結(jié)果顯示，腺苷和鴉膽子苦素B可能是其活性成分。

2.5成骨活性成分的篩選 Liu J等[28]通過(guò)牙周韌帶細(xì)胞膜色譜，結(jié)合實(shí)時(shí)在線質(zhì)譜技術(shù)，篩選出其潛在的成骨活性成分為黃連素。黃連素可作用于人牙周韌帶細(xì)胞，對(duì)人牙周韌帶細(xì)胞的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，并能使細(xì)胞培養(yǎng)基中ALP 的分泌增加，促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成。

2.6抗過(guò)敏活性成分的篩選 Ⅰ型超敏反應(yīng)的發(fā)生需要免疫球蛋白E(IgE)的參與，與IgE高親和力受體FcεRI 結(jié)合能導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒并使炎性介質(zhì)釋放。Huang J等[29]研究了胡椒中作用于FcεRI受體的成分，CMC系統(tǒng)的構(gòu)建是通過(guò)大鼠嗜堿性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞RBL-2H3完成的，并聯(lián)用HPLC-MS技術(shù)對(duì)篩選出的成分進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，胡椒堿為其中作用于FcεRI受體的活性成分。Han S 等[30]利用相同的系統(tǒng)，篩選出紅花中的抗過(guò)敏活性成分，結(jié)果顯示，羥基紅花黃色素A為其有效成分。

3 結(jié)語(yǔ)

中藥具有非常復(fù)雜的化學(xué)成分，對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究是目前科研工作者研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。中藥活性成分的篩選是闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及開(kāi)發(fā)新藥的重要工作。實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化研究迫切需要適合于中藥復(fù)雜體系的新研究策略。應(yīng)用CMC技術(shù)可較快地篩選出活性成分，結(jié)合制備型HPLC，對(duì)成分進(jìn)行富集，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)加入陽(yáng)性對(duì)照藥物或工具藥進(jìn)行驗(yàn)證，使得實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果更加可靠。

CMC技術(shù)是一種從中藥復(fù)雜體系中篩選活性成分的方法，具有多方面的優(yōu)點(diǎn)，但也存在一定局限性。①CMC技術(shù)作為一種離體的活性成分篩選方法，不能使復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境和體內(nèi)其他影響中藥藥效發(fā)揮的因素被完全模擬出來(lái)。因此，采用CMC篩選活性成分時(shí)，需根據(jù)藥物的體內(nèi)代謝過(guò)程不斷完善藥理模型。②不同的中藥活性成分在體內(nèi)的作用靶點(diǎn)不同，制備生物材料的固定相細(xì)胞膜具有一定難度，不能完全保證實(shí)驗(yàn)的精密度和重復(fù)性，且存在保存時(shí)間短、難以實(shí)現(xiàn)商品化的問(wèn)題。③多種活性蛋白存在于自然生物膜上，但標(biāo)本量太少或收集困難，不能將此類生物膜用于大規(guī)模篩選和受體亞型的研究。解決該問(wèn)題的方法是將重組受體和藥物篩選相結(jié)合，將受體的配基、亞基和靶酶的活性中心等在細(xì)胞株或微生物中大量表達(dá)[31]。④CMC體系中，如果細(xì)胞膜對(duì)硅膠(固定相載體)包裹不全，可能由于硅膠的吸附性，使藥物與細(xì)胞膜、膜受體之間的相互作用受到干擾。⑤被CMC柱特異性保留的有效成分的量通常很少，難以進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和藥理活性確證。為解決該問(wèn)題，可通過(guò)受體高表達(dá)細(xì)胞株的膜色譜制備，構(gòu)建各種單一受體高表達(dá)的CMC體系，聯(lián)用HPLC法、LC-MS法、光譜法、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，建立細(xì)胞膜篩選平臺(tái)以用于藥物高通量篩選。

因此，對(duì)于CMC技術(shù)還需進(jìn)行深入探索，充分利用其優(yōu)勢(shì)，使該技術(shù)在中藥活性成分的篩選以及發(fā)現(xiàn)更多高效低毒的先導(dǎo)化合物方面發(fā)揮越來(lái)越大的作用。

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