青果氯仿萃取部位的化學(xué)成分研究Δ

楊洛萍，孟涵，譚穗懿，陳金香，段文軍#（.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州5055；.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣州 5055）

青果為蕓香目橄欖科橄欖屬植物橄欖（Canarium albumRaeusch.）的成熟果實(shí)，主要有清肺、利咽、生津、解毒的功效[1]。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）記載青果可治療咽喉腫痛、煩渴、咳嗽吐血、菌痢、癲癇，可解河豚毒及酒毒[2-3]，為我國(guó)常用的清熱、利咽的傳統(tǒng)中藥。其主要成分有多酚類、黃酮類、香豆素類、三萜類等[4-5]。本課題組前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)青果氯仿萃取部位具有體外抗人類免疫缺陷病毒（HIV）活性[6-7]，為進(jìn)一步探究其抗HIV活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究對(duì)青果氯仿萃取部位的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)分離鑒定，為明確青果抗HIV活性成分及探索抗艾滋病藥物的先導(dǎo)化合物提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Bruker AVANCEⅢ400型核磁共振儀（瑞士Bruker公司）；LC-16型液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；ZQ4000型液相色譜-質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；1290型超高效液相色譜-6230型飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）。

1.2 試劑

聚酰胺填料（300～400目，上海江萊生物科技有限公司）；柱層析硅膠（200～300目，青島海洋化工海洋公司）；小孔吸附樹脂（MCI，75～150 μm，日本Mitubishi Chemical公司）；FUJI反相C18硅膠填料[40～75 μm，賽譜銳思（北京）科技有限公司]；Sephadex LH-20凝膠樹脂（美國(guó)GE Healthcare公司）；Toyopearl HW-40F凝膠樹脂（日本Tosoh公司）；薄層色譜硅膠板（青島海洋化工廠）。

1.3 藥材

青果購(gòu)于廣東省潮州市潮安縣文祠鎮(zhèn)下赤村果園，由南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院劉強(qiáng)教授鑒定為橄欖的成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離

取青果50 kg，洗凈后于65℃烘箱中干燥8 h，剝離果核后繼續(xù)在55℃烘箱中干燥，得干燥的青果果肉4 kg。干燥果肉粉碎后用75%乙醇溶液回流提取3次，每次1.5 h，合并濾液后減壓濃縮，得浸膏。浸膏用水分散，依次以氯仿、乙酸乙酯各萃取3～4次，水相與有機(jī)相體積比均為1∶1?；厥沼袡C(jī)溶劑，得氯仿萃取部位108 g，乙酸乙酯萃取部位86 g。將氯仿萃取部位加乙醇溶解，經(jīng)聚酰胺層析柱，以乙醇-水（0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，V/V）梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜鑒別，富集濃縮，得4個(gè)流分（Fr.1～Fr.4）。

流分Fr.1（19 g）經(jīng)MCI柱，以甲醇-水（0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2，V/V）梯度洗脫，得流分Fr.1-1～Fr.1-9。其中，F(xiàn)r.1-4經(jīng)Toyopearl HW-40F凝膠樹脂柱與反相C18柱，以甲醇-水（0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶8、5∶5，V/V）梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜鑒別，富集濃縮，得化合物1（16 mg）和化合物2（3 mg）。

流分Fr.2（3.6 g）經(jīng)MCI柱，以甲醇-水（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0，V/V）梯度洗脫，得流分Fr.2-1～Fr.2-10。將Fr.2-1、Fr.2-2經(jīng)薄層色譜富集、濃縮、合并，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠樹脂柱與Toyopearl HW-40F凝膠樹脂柱，以甲醇-水（1∶9、2∶8、3∶7，V/V）梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜鑒別，富集濃縮，得化合物3（399 mg）。

流分Fr.3（4.4 g）經(jīng)MCI柱，以甲醇-水（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2，V/V）梯度洗脫，得流分Fr.3-1～Fr.3-10。將Fr.3-1～Fr.3-3經(jīng)薄層色譜富集、濃縮、合并，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠樹脂柱，以甲醇-水（7∶3，V/V）等度洗脫，得化合物4（98 mg）；Fr.3-6經(jīng)反相C18柱與Sephadex LH-20凝膠樹脂柱，以甲醇-水（2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2，V/V）梯度洗脫，得化合物5（12 mg）和化合物6（8 mg）。

流分Fr.4（5.2 g）經(jīng)MCI柱，以甲醇-水（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0，V/V）梯度洗脫，得流分Fr.4-1～Fr.4-10。將Fr.4-3～Fr.4-5經(jīng)薄層色譜富集、濃縮、合并，經(jīng)反相C18柱，以甲醇-水（5∶5，V/V）等度洗脫，得化合物7（13 mg）；Fr.4-7經(jīng)Sephadex LH-20凝膠樹脂柱與反相C18柱，以甲醇-水（2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2，V/V）梯度洗脫，得化合物8（305 mg）。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：棕色粉末，易溶于水；紫外-可見光譜最大吸收波長(zhǎng)（UVλmax）：266 nm；電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）：質(zhì)荷比（m/z）443[M-H]-；分子式：C21H32O10，分子量：444。1H-NMR（400 MHz，D2O）δ：7.66（1H，d，J＝16.0 Hz，H-4），6.44（1H，d，J＝16.0 Hz，H-5），5.77（1H，s，H-2），4.47（1H，d，J＝8 Hz，Glc H-1），4.22（1H，m，H-3′），3.85、3.66（2H，m，Glc H-6），3.80（1H，m，Glc H-2），3.38（1H，m，H-7′），3.38（1H，m，Glc H-3），3.29（1H，m，Glc H-4），3.13（1H，m，Glc H-5），2.16、1.96（2H，m，H-4′），2.01（3H，s，CH3-6），1.77（2H，m，H-2′），1.11（3H，s，CH3-9′），0.87（3H，s，CH3-10′）。13C-NMR（100 MHz，D2O）δ：170.28（C-1），151.27（C-3），133.12（C-5），130.54（C-4），117.72（C-2），101.07（Glc C-1），86.67（C-5′），82.47（C-8′），75.83（Glc C-3），75.71（C-7′），75.39（Glc C-2），73.48（C-3′），73.04（Glc C-5），69.54（Glc C-4），60.63（Glc C-6），47.79（C-1′），40.74（C-4′），40.57（C-2′），20.15（C-6），18.32（C-9′），14.98（C-10′）。與文獻(xiàn)[8]的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故可確定該化合物為二氫紅花菜豆酸3′-O-β-D-葡萄糖苷（Dihydrophaseic acid-3′-O-β-D-glucopyranoside）。

化合物2：淡黃色粉末，易溶于水；FeCl3反應(yīng)顯藍(lán)紫色；UVλmax：212、258、293 nm；ESI-MS：m/z153[M-H]-；分子式：C7H6O4，分子量：154。1H-NMR（400 MHz，D2O）δ：7.34（1H，d，J＝8.2 Hz，H-6），7.32（1H，s，H-2），6.80（1H，d，J＝8.2 Hz，H-5）。13C-NMR（100 MHz，D2O）δ：170.14（COOH），149.35（C-4），143.49（C-3），123.57（C-1），121.53（C-6），116.98（C-2），115.38（C-5）。與文獻(xiàn)[9]的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故可確定該化合物為3，4-二羥基苯甲酸（3，4-dihydroxybenzoic acid）。

化合物3：白色粉末，易溶于甲醇；FeCl3反應(yīng)顯藍(lán)紫色；UVλmax：215、273 nm；高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜（HR-TOFMS）：m/z345.082 8[M+H]+，343.047 6[M-H]-；分子式：C14H16O10，分子量：344。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.08（2H，s，Galloyl H），5.40（1H，m，H-3），4.21（1H，m，H-5），3.80（1H，dd，J＝7.9，2.9 Hz，H-4），2.24（2H，m，H-2），2.17（1H，m，H-6a），2.06（1H，dd，J＝13.8，6.0 Hz，H-6b）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：177.01（COOH），167.79（COO），146.39（C-3′，C-5′），139.80（C-4′），121.62（C-1′），110.24（C-2′，C-6′），75.88（C-1），73.10（C-3），72.26（C-4），70.94（C-5），38.34（C-2），38.10（C-6）。與文獻(xiàn)[10]的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故可確定該化合物為3-O-沒食子?？崴幔?-O-galloyl quinic acid）。

化合物4：白色粉末，易溶于甲醇；UVλmax：212、268 nm；ESI-MS：m/z169[M-H]-；分子式：C7H6O5，分子量：170。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.08（2H，s，H-2，H-6）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：168.98（COOH），144.93（C-3，C-5），138.12（C-4），120.57（C-1），108.88（C-2，C-6）。與文獻(xiàn)[11]的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故可確定該化合物為沒食子酸（Gallic acid）。

化合物5：黃色粉末，易溶于甲醇；FeCl3反應(yīng)顯藍(lán)紫色；UVλmax：214、272 nm；ESI-MS：m/z197[M-H]-；分子式：C9H10O5，分子量：198。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.05（2H，s，H-2，H-6），4.29（2H，q，J＝7.1 Hz，OCH2），1.36（3H，t，J＝7.1 Hz，CH3）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：167.08（C＝O），145.01（C-3，5），138.21（C-4），120.31（C-1），108.53（C-2，6），60.19（OCH2），13.17（CH3）。與文獻(xiàn)[12]的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故可確定該化合物為沒食子酸乙酯（Ethyl gallate）。

化合物6：黃色晶體，易溶于甲醇；紫外燈下顯藍(lán)色熒光；ESI-MSm/z：215[M+Na]+；分子式：C10H8O4，分子量：192。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.86（1H，d，J＝9.4 Hz，H-4），7.12（1H，s，H-8），6.78（1H，s，H-5），6.22（1H，d，J＝9.4 Hz，H-3），3.92（3H，s，OCH3）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：162.58（C-2），151.45（C-7），149.95（C-9），145.61（C-6），144.64（C-4），111.14（C-3），111.08（C-10），108.47（C-5），102.49（C-8），55.34（OCH3）。與文獻(xiàn)[13]的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故可確定該化合物為東莨菪內(nèi)酯（Scopoletin）。

化合物7：黃色結(jié)晶粉末，難溶于水、甲醇、氯仿；Fe-Cl3反應(yīng)顯藍(lán)紫色；UVλmax：251、360 nm；HR-TOF-MSm/z：449.071 3[M+H]+，447.056 1[M-H]-；分子式：C20H16O12，分子量：448。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：7.74（1H，s，H-5），7.45（1H，s，H-5′），5.46（1H，s，Rha H-1），4.01（1H，m，Rha H-2），3.85（1H，dd，J＝9.4，3.4 Hz，Rha H-3），3.55（1H，m，Rha H-5），3.33（1H，t，J＝ 9.4 Hz，Rha H-4），1.14（3H，d，J＝6.2 Hz，Rha H-6）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：159.51（C-7），159.36（C-7′），149.14（C-4′），146.78（C-4），141.71（C-3），140.27（C-3′），137.09（C-2′），136.81（C-2），114.91（C-6），112.09（C-6′），111.98（C-5），110.68（C-5′），108.34（C-1），107.77（C-1′），100.58（Rha C-1），72.19（Rha C-4），70.49（Rha C-3），70.34（Rha C-5），70.29（Rha C-2），18.28（Rha C-6）。與文獻(xiàn)[14]的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故可確定該化合物為鞣花酸-4-O-α-L-吡喃鼠李糖苷（Ellagic acid-4-O-α-L-rhamnopyranoside）。

化合物8：淡黃色粉末，易溶于甲醇、丙酮；UVλmax：198、218、268 nm；HR-TOF-MSm/z：657.067 7[M+Na]+，633.038 7[M-H]-；分子式：C27H22O18，分子量：634。1HNMR（400 MHz，Acetone-d6）δ：7.14（1H，s，Gal H-2，6），6.85（1H，s，HHDP H-2），6.71（1H，s，HHDP H-2′），6.39（1H，d，J＝ 2.0 Hz，Glc H-1），4.97（1H，t，J＝10.9 Hz，Glc H-6a），4.84（1H，m，Glc H-3），4.53（1H，m，Glc H-5），4.47（1H，m，Glc H-4），4.12（1H，dd，J＝11，8.1 Hz，Glc H-6b），4.08（1H，d，J＝1.3 Hz，Glc H-2）。13C-NMR（100 MHz，Acetone-d6）δ：167.71（HHDP C′＝O），166.29（HHDP C＝O），164.25（Gal C＝O），144.96（Gal C-3，5），144.47（HHDP C-3，5），143.87（HHPP C3′），143.99（HHDP C5′），138.40（Gal C-4），136.28（HHDP C-4′），135.78（HHDP C-4），124.62（HHPP C-1），124.78（HHDP C-1′），119.85（Gal C-1），115.62（HHDP C-6′），114.96（HHDP C-6），109.87（Gal C-2，6），109.01（HHDP C-2），107.13（HHDP C-2′），93.26（Glc C-1），74.71（Glc C-5），69.74（Glc C-3），68.04（Glc C-2），63.42（Glc C-4），61.31（Glc C-6）。與文獻(xiàn)[15]的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故可確定該化合物為異柯里拉京（Isocorilagin）。

3 討論

本研究首次青果氯仿提取部位的化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒定，共分離得到化合物1～8，分別為二氫紅花菜豆酸3′-O-β-D-葡萄糖苷、3，4-二羥基苯甲酸、3-O-沒食子?？崴?、沒食子酸、沒食子酸乙酯、東莨菪內(nèi)酯、鞣花酸-4-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、異柯里拉京。其中，化合物1、2、7為首次從青果中分離得到，而化合物8已由本課題組研究證實(shí)具有抗HIV的作用（行文待發(fā)）。據(jù)文獻(xiàn)[16]報(bào)道，從苦味葉下珠（Phyllanthus amarus）的葉中分離的柯里拉京可以較強(qiáng)地抑制HIV在MT-4細(xì)胞中的復(fù)制，而從麻瘋樹（Jatropha curcas）和紫斑大戟（Chamaesyce hyssopifolia）中分離得到的柯里拉京可以體外抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶[17]。本課題組分離到的異柯里拉京與柯里拉京結(jié)構(gòu)上的差別只在于葡萄糖端基與沒食子酸形成的苷鍵分別在β位與α位，故其可能具有抗HIV活性，但具體的抗病毒機(jī)制尚需深入研究。

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