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    激光解吸/激光后電離質(zhì)譜法快速檢測黃酒中酪胺

    2018-01-18 03:07:59冷宜昕王彤彤殷志斌
    質(zhì)譜學(xué)報(bào) 2018年1期
    關(guān)鍵詞:酪胺分子離子電離

    冷宜昕,王彤彤,殷志斌,劉 蓉,杭 緯

    (廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,譜學(xué)分析與儀器教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門 361005)

    黃酒是中國特有的酒類,由谷米低度釀造而成。酒曲中的菌種含有蛋白酶,可分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生多種人體必需的氨基酸,故被稱為“液體面包”。在黃酒發(fā)酵過程中,酒曲中的微生物所產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶可使氨基酸發(fā)生脫羧作用產(chǎn)生生物胺(biogenic amine, BA)[1]。生物胺是一類具有生物活性的含氮有機(jī)物,屬于生命機(jī)體的生理物質(zhì),但生物胺含量過高會對人體的神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷[2]。酪胺是黃酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種重要生物胺,其前體多巴胺由酪氨酸脫羧酶和單胺羥化酶的催化作用產(chǎn)生。當(dāng)人體攝入過量的酪胺時,會導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、亢奮、血壓升高以及偏頭痛,即產(chǎn)生所謂的“奶酪效應(yīng)”[3]。中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)委員會制定了包含酒類、肉類等五大類食品中生物胺含量的分析方法[4]。

    由于實(shí)際樣品體系的復(fù)雜性與生物胺在樣品體系中的低含量,對于酪胺、組胺等生物胺的檢測常常需要預(yù)處理,將體系中的組分預(yù)先進(jìn)行分離、提純、富集再檢測。最常見的分析手段是高效液相色譜法,其具有靈敏度高與準(zhǔn)確性好的特點(diǎn),但常常需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理和衍生化[5],而預(yù)處理過程使黃酒中生物胺的監(jiān)控十分不便,因此本課題組提出了一種無需樣品預(yù)處理即可對黃酒樣品直接上樣快速分析的質(zhì)譜法。

    激光解吸/激光后電離質(zhì)譜法(laser desorption/laser postionization mass spectrometry, L2MS)是一種應(yīng)用廣泛的質(zhì)譜分析手段,該方法使用兩束激光對待測物進(jìn)行分析,第一束激光使待測物在分解前迅速從樣品表面解吸出來,第二束激光將氣化的待測物分子電離形成分子離子進(jìn)入質(zhì)譜分析區(qū)。在實(shí)驗(yàn)過程中,使用第二束激光使氣化分子電離服從雙光子共振電離機(jī)理(resonant two-photon ionization, R2PI),其原理示于圖1。待測物分子在吸收一個光子能量后到達(dá)馳豫時間較長的穩(wěn)定激發(fā)態(tài),再通過吸收第二個光子使其發(fā)生電離[6]。激光解吸/激光后電離質(zhì)譜法對酪胺的研究可以追溯到19世紀(jì)80年代,Tembreull和Lubman課題組使用L2MS結(jié)合R2PI技術(shù)對兒茶酚胺類物質(zhì)及其衍生物進(jìn)行分析,在低能量的后電離激光下得到了清晰的酪胺純樣譜圖[7]。對于實(shí)際樣品體系,由于其復(fù)雜性,直接進(jìn)行質(zhì)譜分析十分困難,常常需要使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜、耗時長。

    圖1 雙光子共振電離原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of resonant two-photon ionization

    本研究將著眼于R2PI對芳香體系的選擇性[8],以有效地減少黃酒體系中復(fù)雜基體對酪胺檢測的干擾。使用自行搭建的質(zhì)譜裝置在不進(jìn)行任何樣品預(yù)處理的前提下,對黃酒實(shí)際樣品進(jìn)行直接快速的分析,希望通過使用簡單的標(biāo)準(zhǔn)加入法即可測定實(shí)際樣品中的酪胺含量。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 裝置與儀器

    本課題組自行組裝了一臺激光解吸/激光

    后電離質(zhì)譜儀,裝置圖示于圖2。Nd:YAG納秒激光器(Minilite-Ⅱ):美國Continuum公司產(chǎn)品,激光頻率10 Hz,激光脈寬5 ns,解吸和后電離激光波長分別為532 nm和266 nm;WaveSurfer 44Xs示波器:美國LeCroy公司產(chǎn)品;microTOF-QⅡ四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀:美國Bruker公司產(chǎn)品。

    1.2 主要材料與試劑

    酪胺純樣(純度98%):上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品;黃酒樣品:浙江紹興縣唐宋酒業(yè)有限公司產(chǎn)品;乙腈(分析純):美國Sigma公司產(chǎn)品。

    1.3 質(zhì)譜條件

    1.3.1純樣實(shí)驗(yàn) 解吸激光(532 nm)能量21 μJ,后電離激光(266 nm)能量400 μJ,延遲時間6 800 ns。

    1.3.2激光解吸對比實(shí)驗(yàn) 激光解吸質(zhì)譜(LDI-MS)解吸激光(532 nm)能量 120 μJ,延遲時間6 800 ns。

    1.3.3黃酒樣品實(shí)驗(yàn) 解吸激光(532 nm)能量117 μJ,后電離激光(266 nm)能量1.38 mJ,延遲時間6 800 ns。

    1.3.4ESI-MS對比實(shí)驗(yàn) 電噴霧離子源正離子模式,流速180 μL/h,毛細(xì)管電壓4 kV。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 酪胺純樣分析

    酪胺屬于生物樣品,故選擇乙腈-水溶液(1∶1,V/V)作為溶劑對酪胺純樣進(jìn)行分析。

    圖2 自行搭建的激光解吸/激光后電離質(zhì)譜儀示意圖Fig.2 Schematic diagram of the in-house-built L2MS setup

    將酪胺純樣溶于乙腈-水溶液中,配制成1 mL酪胺混合溶液,其濃度梯度為0.5、1、10、50、100 mg/L,取2 μL混合溶液滴于潔凈的樣品靶上(不銹鋼靶),樣品靶與進(jìn)樣桿上的二維移動平臺直接相連,將樣品置于高真空下。酪胺分子的電離能為(8.41±0.12) eV,本實(shí)驗(yàn)的后電離激光波長為266 nm(hν=4.67 eV),雙光子能量(9.34 eV)大于酪胺分子的電離能,符合R2PI機(jī)理。在不開啟后電離激光時,通過優(yōu)化解吸激光(532 nm)至激光能量為21 μJ時,分子離子峰恰好不在質(zhì)譜圖中顯示;此時再開啟后電離激光(266 nm)并優(yōu)化至激光能量為400 μJ時,可獲得較強(qiáng)的分子離子峰信號,優(yōu)化后的延遲時間為6 800 ns,通過譜圖發(fā)現(xiàn),在酪胺濃度很低時仍可以得到較好的分子離子峰及特征峰。

    如果使用其他質(zhì)譜分析手段對酪胺進(jìn)行分析,所得的譜圖遠(yuǎn)不如使用L2MS法得到的譜圖清晰。如對高濃度(1 000 mg/L)酪胺純樣進(jìn)行激光解吸質(zhì)譜分析(LDI-MS,解吸激光波長為532 nm),酪胺分子幾乎完全被擊碎,得到的質(zhì)譜圖示于圖3b。優(yōu)化后的解吸激光(532 nm)能量為120 μJ,但無法通過調(diào)節(jié)激光能量獲取酪胺分子的分子離子峰及特征碎片峰,且雜質(zhì)峰增加。通過譜圖對比發(fā)現(xiàn),即使將酪胺純樣的濃度升高2個數(shù)量級也無法在直接解吸電離下獲得明顯的分子離子峰。

    實(shí)驗(yàn)通過將不同濃度的酪胺純樣進(jìn)行單點(diǎn)完全解吸,對所得譜圖進(jìn)行疊加,將酪胺分子的分子離子峰峰高與酪胺分子濃度的線性關(guān)系進(jìn)行外推,計(jì)算L2MS法對酪胺純樣的檢出限。將濃度梯度為0.5、1、10、50、100 mg/L的酪胺純樣進(jìn)行L2MS分析,多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后所得的譜圖示于圖4??梢钥闯觯词?jié)舛冉抵?.5 mg/L,譜圖依然清晰簡潔,便于解析。其中,為了更好地進(jìn)行濃度梯度比較,0.5 mg/L和1 mg/L譜圖放大了20倍,將譜圖中分子離子峰(m/z137)峰高與酪胺濃度進(jìn)行線性回歸,得到的線性關(guān)系示于圖5。對譜圖空白處信號進(jìn)行統(tǒng)計(jì),獲得背景噪音的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)合線性關(guān)系斜率,并根據(jù)公式LOD=3σ/k,得到L2MS法檢測酪胺純樣的檢出限為32 μg/L。

    圖3 解吸激光能量為21 μJ,后電離激光能量為400 μJ時,酪胺濃度為10 mg/L的L2MS圖(a);解吸激光能量為120 μJ時,酪胺濃度為1 000 mg/L的LDI-MS圖(b)Fig.3 L2MS of tyramine at the concentration of 10 mg/L obtained as the function of laser energy: Edesorption=21 μJ and Eionization= 400 μJ (a); LDI-MS of tyramine at the concentration of 1 000 mg/L obtained at the desorption laser energy of 120 μJ (b)

    注:為清晰的表示酪胺濃度為1 mg/L與0.5 mg/L時譜圖,將其信號放大了20倍圖4 解吸激光能量為21 μJ,后電離激光能量為400 μJ時,梯度濃度的酪胺純樣L2MS圖Fig.4 L2MS of gradient concentrations of tyramine solutions obtained as the function of Edesorption=21 μJ and Eionization=400 μJ

    公式中σ為譜圖中背景噪音的標(biāo)準(zhǔn)偏差,k為標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合斜率。

    圖5 L2MS法獲得的酪胺純樣中酪胺分子離子峰信號強(qiáng)度與濃度的線性關(guān)系Fig.5 Intensity-concentration curve of pure tyramine sample by L2MS

    2.2 黃酒實(shí)際樣品分析

    取2 μL黃酒實(shí)際樣品滴在潔凈的不銹鋼靶上,進(jìn)行質(zhì)譜分析。當(dāng)解吸激光(532 nm)能量為117 μJ,后電離激光(266 nm)能量為1.38 mJ時,信噪比最高,分子離子峰較強(qiáng)且碎片較少,便于譜圖解析,得到的L2MS圖示于圖6a??梢园l(fā)現(xiàn),酪胺分子的分子離子峰(m/z137)與特征峰(m/z107)信號較強(qiáng)。黃酒的主要成分是乙醇、水及糖類,并含有少量的有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、維生素以及礦物質(zhì)。在實(shí)驗(yàn)過程中,糖類、有機(jī)酸等分子質(zhì)量較大的有機(jī)物無法被R2PI電離。食品中的生物胺包括酪胺、組胺、色胺、尸胺、精胺、亞精胺、腐胺、苯乙胺[10-11]。在譜圖中只有酪胺有較強(qiáng)的信號產(chǎn)生,這是因?yàn)槔野返姆枷阈越Y(jié)構(gòu)使其能夠通過R2PI方法進(jìn)行電離,266 nm激光的后電離可以對其高效電離。由于實(shí)際樣品分析中的激光功率較高,在譜圖上可以發(fā)現(xiàn)較多的有機(jī)物碎片,這是由部分小分子的糖類和有機(jī)酸裂解造成的,同時還有環(huán)境中的鈉鉀污染,以及不銹鋼靶所含有的金屬元素,質(zhì)譜圖示于圖6b。從整張譜圖上看,酪胺分子的信號強(qiáng)度較強(qiáng),說明該方法對酪胺的檢測具有較高的選擇性。

    如果不進(jìn)行預(yù)處理,直接使用電噴霧飛行時間質(zhì)譜(ESI-MS)對黃酒實(shí)際樣品進(jìn)行分析,由于ESI-MS的質(zhì)量歧視問題,在譜圖中無法獲得小分子質(zhì)量的碎片峰,同時,由于黃酒體系的復(fù)雜性,酪胺分子無法在基體中獲得競爭電離,譜圖解析困難。與之相比,L2MS法體現(xiàn)了高選擇性檢測的優(yōu)勢,酪胺可以在復(fù)雜基體中通過R2PI電離機(jī)理被選擇性電離,產(chǎn)生較強(qiáng)的信號,使檢測過程簡單便捷。

    圖6 解吸激光能量為117 μJ,后電離激光能量為1.38 mJ時,黃酒實(shí)際樣品的L2MS圖(a);黃酒實(shí)際樣品L2MS局部放大譜圖(m/z 0~100)(b)Fig.6 L2MS of yellow rice wine obtained at Edesorption=117 μJ and Eionization=1.38 mJ (a); the enlarged mass spectrum of (a) at m/z 0-100 (b)

    2.3 標(biāo)準(zhǔn)加入法測定黃酒中酪胺含量

    黃酒中生物胺的含量與其原料產(chǎn)地、釀造工藝、原材料品種及添加劑有較大關(guān)系。不同的米種本身所含的生物胺差異較大,同時在釀造過程中使用不同的發(fā)酵劑也會使生物胺含量發(fā)生變化[12-13]。除此之外,黃酒中酪胺含量測定也與使用的分析手段有關(guān),從文獻(xiàn)[2,13-16]報(bào)道可知,黃酒中酪胺含量最低處于100 μg/L量級,最高約100 mg/L。

    實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定黃酒樣品中酪胺含量,向100 μL黃酒樣品中分別加入900 μL的10、20、50、80、100 mg/L酪胺的乙腈-水溶液(1∶1,V/V),制備5組平行溶液,混勻后分別取2 μL不同濃度的混合液進(jìn)行L2MS分析。為了保證在樣品中仍能獲得最優(yōu)化的酪胺分子離子峰,實(shí)驗(yàn)延續(xù)使用對于黃酒樣品的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)。在進(jìn)行多組重復(fù)實(shí)驗(yàn)后,通過酪胺分子離子峰信號強(qiáng)度與加入不同酪胺濃度的線性關(guān)系對黃酒中的酪胺含量進(jìn)行估算,示于圖7。得到的黃酒實(shí)際樣品中含有約68 mg/L酪胺,處于文獻(xiàn)值[2]范圍內(nèi),符合實(shí)際情況,可知該黃酒中的酪胺未達(dá)到對人體產(chǎn)生危害的含量(100 mg/L)。

    圖7 黃酒樣品中酪胺分子離子峰信號強(qiáng)度與濃度的線性關(guān)系Fig.7 Intensity-concentration curve of tyramine in yellow rice wine sample

    3 結(jié)論

    建立了一種黃酒中酪胺的快速、高靈敏度的質(zhì)譜檢測方法,采用激光解吸/激光后電離質(zhì)譜法結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)加入法選擇性檢測復(fù)雜黃酒體系中的酪胺成分,該方法對酪胺的檢出限可達(dá)32 μg/L,酪胺的分子離子峰信號強(qiáng)度與濃度具有良好的線性關(guān)系。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)加入法可以估算黃酒樣品中酪胺含量約為68 mg/L,在安全食用范圍內(nèi),不會對人體造成危害。

    L2MS法具有高效、便捷的特點(diǎn),在無需任何樣品前處理的情況下,仍能對復(fù)雜體系中的關(guān)鍵組分進(jìn)行高選擇性檢測,提高了分析效率,同時具備取樣量少的特點(diǎn)。L2MS法也可以快速分析白酒、葡萄酒、醬油等含有生物胺的食品中酪胺含量,還可以用于食品中酪胺形成規(guī)律的探索,在食品安全領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。

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