超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定菠菜、蘋果及大豆中二硝基苯胺類除草劑殘留量

張建瑩，靳保輝，吳衛(wèi)東，鄧慧芬，林 珊，梁淑雯

(深圳出入境檢驗檢疫局食品檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳 518045)

二硝基苯胺類除草劑主要包括氟樂靈、二甲戊樂靈、仲丁靈、異樂靈、磺樂靈、氨基乙氟靈、氨磺樂靈和氨基丙氟靈等。此類除草劑作為一種選擇性芽前土壤處理劑，具有殺草譜廣、除草效果穩(wěn)定、高效低毒等特點，在化學除草劑的應用中占有較高比例。土壤對二硝基苯胺類除草劑有較強的吸附作用，其殘留會對后茬作物產生藥害，同時也會對人體產生直接或間接的不良影響。我國、歐盟和日本等國家均對食品中二硝基苯胺類除草劑制訂了最高殘留限量，食品基質包括大多數(shù)蔬菜、水果和糧谷。因此，建立植物源性食品中二硝基苯胺類除草劑的定量分析方法具有重要的現(xiàn)實意義。

目前，檢測蔬菜、水果和糧谷樣品中二硝基苯胺類除草劑殘留的方法有氣相色譜-電子捕獲檢測(GC-ECD)法、氣相色譜-質譜(GC/MS)法、氣相色譜-串聯(lián)質譜(GC-MS/MS)法等[1-15]，國家標準檢測方法包括GB/T 19426—2006，GB/T 19648—2006，GB/T 20769—2008，GB/T 20770—2008，GB/T 20771—2008，SN/T 0712—2010，SN/T 0600—1996。但采用上述方法測定二硝基苯胺類除草劑殘留存在不能覆蓋大部分二硝基苯胺類除草劑；需要大量樣品、消耗大量有機試劑；不適用于蔬菜、水果和糧谷等食品中該類藥物的多殘留同時檢測等問題。

液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)技術具有靈敏度高、選擇性強和檢測時間短等優(yōu)點，適用于復雜基質中多種農藥殘留的分析。本工作擬選取乙腈提取目標化合物，經C18固相萃取柱和Envi-carb固相萃取柱凈化，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定菠菜、蘋果及大豆中的二硝基苯胺類除草劑的殘留量，希望建立一種能夠滿足國內外法規(guī)要求的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀、Xevo-TQS四極桿串聯(lián)質譜儀：美國Waters公司產品；超純水儀：美國Millipore公司產品；均質器：德國Heidolph公司產品；旋渦振蕩儀：德國Heidolph公司產品；離心機：德國Sigma公司產品；C18固相萃取柱(500 mg, 6 mL)、Envi-Carb固相萃取柱(0.25 g, 3 mL)：美國Supelco公司產品。

甲醇、乙腈、正己烷、甲酸、乙酸銨：均為色譜純，德國Merck公司產品；氟樂靈、二甲戊樂靈、氨磺樂靈、仲丁靈、氨基丙氟靈、氨基乙氟靈、磺樂靈和異樂靈標準品：德國Dr.Ehrenstorfer 公司產品；其他試劑均為分析純；實驗用水為Milli-Q超純水。二硝基苯胺類除草劑標準溶液：用丙酮配制1 000 mg/L標準儲備液，于-18 ℃避光保存。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品提取 稱取5 g(精確至0.01 g)樣品，加入7 mL水，混勻后靜置1 h。加入3 g 氯化鈉，以25 mL正己烷飽和乙腈溶液分2次高速均質提取，以9 500 r/min 離心5 min。合并2次提取液，混勻。吸取10.0 mL提取液，于40 ℃水浴中氮氣吹至約2.0 mL。

1.2.2樣品凈化 將濃縮液轉入活化好的C18固相萃取柱中，用5 mL乙腈洗脫，收集全部流出液，氮氣吹至近干。用2.0 mL丙酮-正己烷溶液(8∶2,V/V)溶解，轉入Envi-carb 固相萃取柱中，再用5.0 mL 丙酮-正己烷溶液洗脫并抽干，收集全部流出液，氮氣吹至近干。用50%乙腈-水溶液定容至1.0 mL，旋渦混勻后過0.22 μm有機濾膜，待測定。

1.2.3色譜條件 色譜柱：Acquity BEH C18柱(50 mm×2.1 mm×1.7 μm)；流動相：A為0.05 mol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～5 min(50%～80%B)；5～8 min(80%～100%B)，8.1～9.5 min(50%B)；流速0.3 mL/min；進樣量2 μL。

1.2.4質譜條件 電噴霧離子源，正離子掃描，多反應監(jiān)測(MRM)模式，單位分辨率；電噴霧電壓3 000 V；輔助氣流速900 L/h；氣簾氣流速50 L/h；離子源溫度110 ℃；輔助氣溫度450 ℃；其他質譜參數(shù)列于表1。

表1 8種二硝基苯胺類除草劑的質譜參數(shù)Table 1 Mass parameters of 8 dinitroaniline herbicides

注：*為定量離子；對于不同質譜儀器，參數(shù)可能存在差異，測定前應將質譜參數(shù)優(yōu)化到最佳

2 結果與討論

2.1 提取條件的選擇與優(yōu)化

二硝基苯胺類除草劑易揮發(fā)、易光解，難溶于水、易溶于有機溶劑，在植物中易與脂質結合，因此提取溶劑需滲入組織內部才能得到良好的提取效果。常用的提取溶劑有乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等單一或混合溶劑。正己烷飽和的乙腈溶液、丙酮和乙酸乙酯能對此類農藥充分提取，但丙酮和乙酸乙酯提取的共萃取物中油脂含量較高，不利于凈化；而正己烷飽和的乙腈溶液既能沉淀蛋白質，而且提出脂肪較少，有利于后續(xù)的鹽析和凈化。因此，本實驗采用正己烷飽和的乙腈溶液作為提取溶劑。

2.2 凈化條件的選擇和優(yōu)化

蔬菜、水果及糧谷等植物源性食品中含有大量的色素及脂溶性雜質，采用乙腈進行提取有可能將這些化合物同時提取出來，因此在測定前需對提取液進行除酯、脫色凈化。由于二硝基苯胺類化合物能溶于正己烷，無法用正己烷液液萃取法進行凈化，而石墨化炭黑固相萃取柱對天然產物中的色素(如葉綠素和類胡羅卜素)及固醇類等化合物具有較強的吸附能力，因此，本實驗采用C18反相固相萃取柱和石墨化炭黑固相萃取柱相結合對樣品進行凈化。

對于Envi-Carb柱的洗脫溶劑，實驗比較了不同體積比的丙酮-正己烷混合淋洗溶液(丙酮含量分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%)對化合物回收率的影響，結果示于圖1。可見，回收率隨丙酮含量增加而逐漸提高，當丙酮含量為80%時達到最大，而當丙酮含量大于80%，部分化合物的回收率逐漸降低。為保證洗脫完全，且避免雜質干擾過大，本實驗選擇丙酮-正己烷溶液(8∶2，V/V)作為洗脫劑。實驗比較了不同淋洗體積(1、2、3、4、5、6 mL)對化合物回收率的影響，結果示于圖2。可見，隨著洗脫劑體積逐漸增大，各化合物的回收率逐漸提高，但洗脫劑大于3 mL時，化合物的回收率升高并不明顯?？紤]到洗脫體積過大會使下一步的濃縮時間延長，導致易揮發(fā)性化合物損失較大，因此選擇洗脫劑體積為5 mL。

圖1 不同體積比的丙酮-正己烷洗脫溶液對化合物回收率的影響Fig.1 Effects of acetone-hexane solutions with different volume ratios on recoveries

圖2 洗脫劑體積對化合物回收率的影響Fig.2 Effects of eluent volume on recoveries

2.3 流動相的優(yōu)化

實驗對比了甲醇(含0.05%甲酸)-5 mmol/L乙酸銨水溶液(pH 3.0)、甲醇(含5 mmol/L乙酸銨)-水溶液(pH 4.5)、甲醇(含0.1%乙酸)-水溶液、甲醇-水溶液、乙腈(含0.05%甲酸)-水溶液作為流動相的色譜效果。結果表明，選擇甲醇(含0.05%甲酸)-5 mmol/L乙酸銨水溶液(pH 3.0)作為流動相，并采用梯度洗脫時，8種二硝基苯胺類除草劑的分離度和靈敏度較高，其中10 μg/L二硝基苯胺類除草劑標準溶液的總離子流圖示于圖3。

圖3 10 μg/L二硝基苯胺類除草劑標準溶液的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of 10 μg/L dinitroaniline herbicides standard solution

2.4 質譜條件的優(yōu)化

分別取5.0 mg/L 8種二硝基苯胺類除草劑標準溶液，采用流動注射進樣的方式，以30 μL/min分別將其注入離子源。在正離子檢測方式下分別對其進行母離子掃描得到分子離子峰[M+H]+，再對其進行子離子掃描得到碎片離子信息。優(yōu)化各項質譜參數(shù)，使母離子與選取的子離子強度達到最大。氨磺樂靈、氨基丙氟靈、氨基乙氟靈和二甲戊樂靈的二級質譜圖及分子結構式示于圖4。

2.5 線性關系、回收率、精密度、檢出限和定量限

用空白樣品提取液配制0、10、20、50、100和200 μg/L二硝基苯胺類除草劑的基質混合標準工作溶液。用峰面積對標準溶液中各被測組分的濃度繪制工作曲線。結果表明，當二硝基苯胺類除草劑的濃度在10.0～200 μg/L范圍內時，線性關系良好，其相關系數(shù)和回歸方程列于表2。

圖4 氨磺樂靈(a)、氨基丙氟靈(b)、氨基乙氟靈(c)和二甲戊樂靈(d)的二級質譜圖和結構式Fig.4 MS/MS spectra and chemical structure of oryzalin (a), pendimethalin (b), prodiamine (c) and pendimethalin (d)

化合物Compounds回歸方程Regressionequations相關系數(shù)rCorrelationcoefficients線性范圍Linearranges/(μg/L)回收率Recoveries/%相對標準偏差RSDs/%菠菜氟樂靈y=02667x+012050994410～200867，995，94690，102，680二甲戊樂靈y=004909x+0037160993010～200967，968，931164，116，796仲丁靈y=03283x+0048200999610～200102，995，922730，490，932異樂靈y=05774x-020830971310～200101，958，856640，790，544氨基乙氟靈y=03196x+024310994110～200107，104，891770，105，468磺樂靈y=2260x+10660997410～200110，109，880640，750，842氨磺樂靈y=2404x+056910999210～200112，106，871650，680，753氨基丙氟靈y=06033x-00027680996210～200103，101，895141，390，649蘋果氟樂靈y=0440118x-51220994410～200860，827，942192，119，551二甲戊樂靈y=857535x-185330994110～200109，997，832856，103，730仲丁靈y=490052x-111450995110～200109，958，962301，451，906異樂靈y=681405x-1675290993310～200104，940，914532，683，122氨基乙氟靈y=166072x-339460991910～200110，986，958527，671，105磺樂靈y=330702x-6472060995210～200105，995，933699，447，905氨磺樂靈y=123471x-302200996910～200106，105，908521，634，704氨基丙氟靈y=305416x-748450991110～200104，908，955767，772，822

續(xù)表2

注：回收率和RSD均為在3個添加水平(10、50、100 μg/kg)下得到的數(shù)據(jù)

注：a.氨基丙氟靈；b.氨磺樂靈；c.氨基乙氟靈；d.二甲戊樂靈；e.氟樂靈；f.磺樂靈；g.異樂靈；h.仲丁靈圖5 加標濃度為10 μg/kg的蘋果MRM色譜圖Fig.5 MRM chromatograms of standard addition concentration (10 μg/kg) of apple samples

當樣品中的二硝基苯胺類殘留濃度超過此線性范圍時，可適當加大樣品的稀釋倍數(shù)。

基于回收率和RSD滿足歐盟SANTE/11945/2015要求的最低實驗添加水平[17]，加標樣品的定量離子對色譜信號10倍信噪比(S/N)要求，結合國內外殘留限量要求，確定8 種目標化合物的定量限均為10 μg/kg。在菠菜、蘋果及大豆空白樣品中添加3種水平的二硝基苯胺類除草劑標準溶液，按1.2節(jié)方法進行回收率實驗，每個添加濃度重復6次，計算添加回收率和相對標準偏差，結果列于表2。在添加水平10～100 μg/kg范圍內，加標回收率為70.0%～120%，相對標準偏差為0.56%～23.0%。添加水平10 μg/kg的蘋果加標樣品的MRM色譜圖示于圖5。可見，各化合物出峰位置沒有雜質峰干擾，方法的特異性可以滿足檢測要求。

3 結論

以正己烷飽和的乙腈為提取溶劑，經固相萃取小柱凈化，UPLC-ESI-MS/MS法測定菠菜、蘋果和大豆中氟樂靈、二甲戊樂靈、仲丁靈、異樂靈、磺樂靈、氨磺樂靈、氨基丙氟靈及異丙樂靈8種二硝基苯胺類除草劑的殘留量。該方法前處理簡便快速、凈化效率高，靈敏度、回收率和精密度都能較好地滿足二硝基苯胺類除草劑殘留的測定要求，可為蔬菜、水果和糧谷等植物源性食品中二硝基苯胺類除草劑多殘留的測定提供方法參考。

[1] GB/T 19426—2008. 蜂蜜、果汁和果酒中497種農藥及相關化學品殘留量的測定 氣相色譜-質譜法[S]. 北京：中國標準出版社，2008.

[2] GB/T 19648—2008. 水果和蔬菜中500種農藥及相關化學品殘留的測定 氣相色譜-質譜法[S]. 北京：中國標準出版社，2008.

[3] GB/T 19649—2008. 糧谷中475種農藥及相關化學品殘留量的測定 氣相色譜-質譜法[S]. 北京：中國標準出版社，2008.

[4] GB/T 20769—2008. 水果和蔬菜中405種農藥及相關化學品殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法[S]. 北京：中國標準出版社，2008.

[5] GB/T 20770—2008. 糧谷中372種農藥及相關化學品殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法[S]. 北京：中國標準出版社，2008.

[6] GB/T 20771—2008. 蜂蜜、果汁和果酒中420種農藥及相關化學品殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法[S]. 北京：中國標準出版社，2008.

[7] SN 0712—2010. 出口糧谷中戊草丹、二甲戊靈、丙草胺、氟酰胺、滅銹胺、苯噻酰草胺殘留量檢驗方法[S]. 北京：中國標準出版社，2010.

[8] SN 0600—1996. 出口糧谷中氟樂靈殘留量檢驗方法[S]. 北京：中國標準出版社，1996.

[9] 霍江蓮, 于靜, 儲曉剛, 等. 大豆中二硝基苯胺類除草劑多殘留GC-MS檢測技術研究[J]. 食品科學，2009，20(30)：299-302.

HUO Jianglian, YU Jing, CHU Xiaogang, et al. GC-MS determination of dinitroaniline herbicide residues multi-residues in soybean[J]. Journal of Food Science, 2009, 20(30): 299-302(in Chinese).

[10] 霍江蓮,李軍,葛毅強,等. 二硝基苯胺類除草劑殘留檢測技術的研究進展[J]. 農藥，2006，4(45):222-226.

HUO Jianglian, LI Jun, GE Yiqiang, et al. Determination progress on determination methodology for dinitroaniline herbicide residuces[J]. Journal of Agrochemicals, 2006, 4(45): 222-226(in Chinese).

[11] CHU X G, HU X Z, YAO H Y. Determination of 266 pesticide residues in apple juice by matrix solid-phase dispersion and gas chromatography-mass selective detection[J]. Journal of Chromatography A, 2005, 1 063: 201-210.

[12] 陳其勇,葛寶坤,韓紅芳,等. 糧谷中11種二硝基苯胺類除草劑殘留量的氣相色譜-串聯(lián)質譜法測定[J]. 分析測試學報,2011,5(30)：573-576.

CHEN Qiyong, GE Baokun, HAN Hongfang, et al. Determination of 11 dinitroaniline herbicide residues in grains by gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Instrumental Analysis, 2011, 5(30): 573-576(in Chinese).

[13] CABRAS P, MELIS M, SPANEDDA L, et al. High-performance liquid chromatographic determination of dinitroaniline herbicides in soil and water[J]. Journal of Chromatography A, 1991, 585(1): 164-167.

[15] 邊照陽,唐綱嶺,張洪非,等. 煙草中6種二硝基苯胺類農藥殘留量的測定[J]. 煙草科技,2010,48(8):66-73.

BIAN Zhaoyang, TANG Gangling, ZHANG Hongfei, et al. Determination of residues of six 2, 6-dinitroaniline pesticides in tobacco[J]. Tobacco Science & Technology, 2010, 48(8): 66-73(in Chinese).

[16] SANTE/11945/2015. Guidance document on analytical quality control and method validation procedures for pesticides residues analysis in food and feed.