親水性O(shè)belisc R液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉樣品中氨基糖苷類藥物殘留

趙鳳娟，方恩華，韓瑞陽，彭毅候，羅 耀，熊貝貝，蔡伊娜，李麗蘇

(1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 深圳市食品安全檢測技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518045；2.廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，福建 廈門 361026)

氨基糖苷類抗生素是由氨基糖與氨基環(huán)醇通過氧橋連接而形成的一種苷類抗生素藥物[1]，臨床上主要用于治療敏感需氧革蘭陰性桿菌所致的全身感染。由于氨基糖苷類藥物存在確切的耳毒性和腎毒性，近年來在人類抗感染臨床上的應(yīng)用已越來越少。隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展和動物源性食品產(chǎn)量的增加，氨基糖苷類抗生素作為廉價的廣譜抗生素，被廣泛應(yīng)用于動物疫病防治。但該類藥物具有良好抗菌作用的同時，也具有嚴(yán)重的不良反應(yīng)。其毒副作用主要表現(xiàn)為腎毒性、耳毒性、神經(jīng)肌肉毒性和過敏反應(yīng)等諸多不良反應(yīng)，其中最為嚴(yán)重的是耳毒性。上世紀(jì)六七十年代，因氨基糖苷類抗生素廣泛使用，導(dǎo)致大批病人失聰。為了保障食品安全，目前，我國農(nóng)業(yè)部、美國FDA、歐盟委員會及日本厚生勞動省對常用的幾種氨基糖苷類抗生素的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)做出了規(guī)定，限定其在豬肉中的最大殘留量在50～600 μg/kg之間。中國作為全球動物源性食品生產(chǎn)和進(jìn)出口大國，建立一套先進(jìn)、高效、準(zhǔn)確的檢測方法勢在必行。

氨基糖苷類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在多個氨基和羥基基團(tuán)，具有強(qiáng)極性和弱堿性，其水溶性較好，能與無機(jī)酸或有機(jī)酸生成鹽，以硫酸鹽或鹽酸鹽的形式存在[2]。目前對于動物源性食品中氨基糖苷類抗生素殘留檢測的主要方法有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、 微生物法、氣相色譜法、液相色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法等。王忠斌等[3]以新霉素的降解產(chǎn)物新霉胺作為半抗原，采用戊二醛法合成新霉胺免疫原，制備出針對多種氨基糖苷類藥物的多克隆抗體；并使用高碘酸鹽法制備新霉胺的酶標(biāo)抗原，建立了氨基糖苷類藥物的直接競爭酶聯(lián)免疫方法。Verheijen等[4]建立了競爭ELISA測定鏈霉素，利用膠體金標(biāo)記純化的鏈霉素單克隆抗體 (mAb)，競爭抗原為牛血清白蛋白和鏈霉素的連接物，鏈霉素的最低檢測限為60 μg/L。這些方法前處理簡單、快捷，適用于動物源性食品中氨基糖苷類抗生素殘留的快速檢測，但不能進(jìn)行準(zhǔn)確定量和確證。Hoebus等[5]建立了氣相色譜法測定壯觀霉素鹽酸鹽的含量，由于前處理衍生化過程復(fù)雜，方法回收率不高，該方法現(xiàn)已很少使用。由于氨基糖苷類抗生素的特殊理化性質(zhì)，在紫外區(qū)段沒有特征，需經(jīng)衍生化后，用反相色譜或離子對色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離檢測。陳曉紅等[6]用NaOH和1,2-蔡醒-4-磺酸鈉溶液雙試劑柱后衍生，以熒光檢測器在激發(fā)波長263 nm和發(fā)射波長447 nm處進(jìn)行測定；蔡玉娥等[7]用離子交換柱分離妥布霉素、新霉素和西索霉素，并用脈沖積分安培電化學(xué)檢測器進(jìn)行檢測；苑麗等[8]建立了高效液相色譜法結(jié)合電化學(xué)檢測器測定動物源食品中大觀霉素的殘留量。由于氨基糖苷類抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有多個伯胺或仲胺基團(tuán)，易在離子源中被電離成正離子，近年來多使用高靈敏度的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測，但氨基糖苷類藥物的極性大，在一般的反相色譜柱上基本無保留，需要添加七氟丁酸等增強(qiáng)其保留[9]。Bogiallid等[10-13]分別建立了牛奶、肉、內(nèi)臟等食品中氨基糖苷類藥物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，均采用向流動相中添加七氟丁酸的方式增加氨基糖苷類藥物的保留。離子對試劑的長期使用會嚴(yán)重抑制質(zhì)譜儀的電噴霧離子化效果，大幅降低儀器靈敏度，尤其是對負(fù)離子模式的影響更為明顯。為了解決此問題，近年來有多篇文獻(xiàn)報(bào)道采用親水性色譜柱(如HILIC等)分離氨基糖苷類藥物，例如，Turnipseed等[14]通過將氨基糖苷類藥物經(jīng)異氰酸苯酯衍生化的方式，建立了牛奶中氨基糖苷類藥物的液相色譜-離子阱質(zhì)譜測定方法；Ishii等[15]采用ZIC-HILIC液相色譜柱分離，串聯(lián)質(zhì)譜測定腎臟和肉中6種氨基糖苷類藥物；Kawano[16]采用親水性HILIC色譜柱建立了樣品中鏈霉素和雙氫鏈霉素的液相色譜-電噴霧三重四極桿飛行時間質(zhì)譜分析方法。

本工作擬采用一種新型的親水性O(shè)belisc R色譜柱，選擇乙腈-水溶液作為流動相，通過調(diào)節(jié)乙腈與酸的比例對氨基糖苷類藥物進(jìn)行分離，結(jié)合高專屬性的氨基糖苷分子印跡固相萃取柱前處理凈化，建立豬肉中壯觀霉素(spectinomycin, SPE)、潮霉素B(hygromycin B, HYG)、雙氫鏈霉素(dihydrostrepmycin, DHSTR)、鏈霉素(streptomycin, STR)、阿米卡星(amkacin, AMI)、卡那霉素(kanamycin, KAN)、安普霉素(apramycin, APR)、妥布霉素(tobramycin, TOB)和慶大霉素(gentamicin, GEN)9種氨基糖苷類藥物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Nexera?UHPLC LC-30A 高效液相色譜儀：日本島津公司產(chǎn)品；6500 Qtrap串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國AB Sciex公司產(chǎn)品，配有ESI電噴霧離子源及AnalystTM1.6.2儀器工作站；固相萃取裝置：美國Agilent公司產(chǎn)品；電子天平：瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品；移液器：規(guī)格10～200 μL、100～1 000 μL、1～5 mL，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；Biotage TurboVap?氮吹濃縮儀：美國Caliper公司產(chǎn)品；渦旋振蕩器：美國Barnstead公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)：德國Sigma公司產(chǎn)品；Milli-Q?實(shí)驗(yàn)室超純水制備系統(tǒng)：美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

Obelisc R?高效液相色譜柱(2.1 mm×150 mm×5 μm，100 ?)：美國Sielc公司產(chǎn)品；SupelMIP?SPE固相萃取柱：50 mg/3 mL，美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；0.22 μm有機(jī)微孔濾膜：中國津騰公司產(chǎn)品；乙腈、甲醇、甲酸：均為色譜純，德國Merck公司產(chǎn)品；乙酸銨、三氯乙酸：均為色譜純，德國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉、濃氨水：均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

安普霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度81.5%)，硫酸慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度94.4%)，鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度96%)，硫酸卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)，雙氫鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.0%)，阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)品(純度100%)，壯觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%)，潮霉素B標(biāo)準(zhǔn)品(純度70%)：均為德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司產(chǎn)品；妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度97.2%)：日本TCI公司產(chǎn)品。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備：分別準(zhǔn)確稱取適量的每種氨基糖苷類標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解，配成濃度為100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于4 ℃避光可保存6個月。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的制備：分別準(zhǔn)確量取1 mL各標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻，于4 ℃避光可保存1個月。

樣品提取液的制備：準(zhǔn)確稱取1.36 g磷酸二氫鉀，用980 mL水溶解，并用1.0 mol/L的鹽酸調(diào)pH至4.0，然后分別加入0.15 g Na2EDTA和20 g三氯乙酸，溶解混勻并定容至1 000 mL；Aminoglycosides-SPE樣品洗脫液的制備：準(zhǔn)確量取800 mL乙腈，加入200 mL水并充分混合，加入10 mL甲酸和660 μL七氟丁酸，超聲溶解混勻。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：SiELC Obelisc R?親水性高效液相色譜柱(2.1 mm×150 mm×5 μm，100 ?)；流動相：A為1%甲酸水溶液， B為90%乙腈-水溶液；流速400 μL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量20 μL；梯度洗脫程序：0～0.5 min(5%A)，0.5～5 min(A線性增至45%，保持1 min)，5～8.5 min(A線性增至95%，保持2.5 min)，8.5～8.6 min(A線性降至5%，保持3.4 min)。

1.3.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式；離子源噴霧電壓5 500 eV；離子源溫度450.0 ℃；氣簾氣(N2)壓力206.8 kPa；霧化氣(N2)壓力344.7 kPa；輔助加熱氣(N2)壓力413.7 kPa；錐孔電壓10.0 eV；碰撞室出口電壓9.0 eV；氨基糖苷類藥物定性、定量離子，碰撞能量等其他參數(shù)列于表1。

表1 氨基糖苷類藥物的定性、定量離子及去簇電壓、碰撞能量Table 1 ESI settings for HPLC-MS/MS analysis of the AGs

注：*為定量離子

1.4 樣品前處理方法

1.4.1提取 稱取2 g(精確到0.01 g)試樣置于50 mL聚丙烯離心管中，加入10.0 mL樣品提取液渦旋振蕩2 min，并于平板振蕩器上振蕩提取10 min，以9 000 r/min離心5 min，精確吸取5.0 mL上清液并轉(zhuǎn)移至另一個50 mL聚丙烯離心管中，用稀氨水調(diào)pH至7.5±0.2，渦旋混勻。

1.4.2凈化 SupelMIP?SPE-Aminoglycosides固相萃取柱先后用1 mL甲醇、1 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.8)淋洗活化，將1.4.1節(jié)中調(diào)節(jié)pH值后的提取液加載在固相萃取柱上，控制流速約1滴/秒，先用3 mL水淋洗后真空抽干2～3 min，然后用1 mL乙腈-水溶液(4∶6，V/V)淋洗，棄去淋洗液并抽干10 s，最后用1 mL二氯甲烷-甲醇溶液(1∶1，V/V)淋洗并抽干10 s。用2 mL Aminoglycosides-SPE樣品洗脫液洗脫，收集洗脫液于精密刻度離心管中，于45 ℃水浴下氮?dú)獯蹈刹糠秩軇?，用乙腈定容?.0 mL，渦旋混勻后，過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，待測。

1.4.3基質(zhì)匹配工作曲線 取空白豬肉樣品，按1.4.1節(jié)的方法進(jìn)行提取，經(jīng)SPE凈化后，用空白基質(zhì)液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制出0、20、50、100、200、500、1 000 μg/L 9種濃度的氨基糖苷混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，各分析物定量子離子的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于氨基糖苷類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有多個伯胺或仲胺基團(tuán)，具有弱堿性，易在質(zhì)譜儀離子源中被電離成正離子，同時，由于該類藥物含有多個羥基基團(tuán)，具有很強(qiáng)的極性，常采用電噴霧(ESI)離子源進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)采用ESI離子源，在正離子掃描模式下，采用流動注射的方式分別對9種氨基糖苷類藥物進(jìn)行母離子掃描(Q1 scan)，結(jié)合各藥物的分子式及掃描質(zhì)譜圖確定各藥物的準(zhǔn)分子離子；然后分別以其準(zhǔn)分子離子為母離子，對其子離子進(jìn)行全掃描(Product Ion Scan)，選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的子離子為定性離子，每種化合物至少選擇兩對離子，以滿足歐盟96/23/EC指令中對殘留檢測確證的要求。在多反應(yīng)監(jiān)測模式下，對各離子對的去簇電壓、碰撞能量以及離子源參數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳質(zhì)譜條件(于1.3.2節(jié)中列出)。

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

氨基糖苷類藥物極性很強(qiáng)，在反相C18色譜柱中的保留行為很弱，需要在流動相中加入三氟乙酸、七氟丁酸等離子對試劑增強(qiáng)保留并改善峰形，但離子對試劑的使用會造成質(zhì)譜端極強(qiáng)的離子抑制(尤其對于負(fù)離子)，對離子源污染十分嚴(yán)重，同時會導(dǎo)致色譜柱柱效及壽命的下降、色譜峰重現(xiàn)性較差等問題。為了防止離子對試劑對質(zhì)譜儀電噴霧離子化的抑制作用，需要尋找其他分離原理的色譜柱。隨著近年來親水性(如HILIC等)色譜柱的發(fā)展和應(yīng)用，分離極性化合物的方法更加多樣化。本實(shí)驗(yàn)采用一種新型親水性O(shè)belisc R色譜柱，在反相模式下分離氨基糖苷類藥物。Obelisc R色譜柱是基于液態(tài)分離池技術(shù)(LiSCTM)的一種新型色譜柱，填料為特殊細(xì)孔結(jié)構(gòu)硅膠，細(xì)孔內(nèi)部有較大表面積，通過人工化學(xué)修飾方法結(jié)合其上帶電基團(tuán)，形成一個帶有正電荷、具有較強(qiáng)離子強(qiáng)度和疏水特性的液態(tài)分離池。類似于活細(xì)胞與外界環(huán)境存在平衡，液態(tài)分離池存在于一個與流動相動態(tài)平衡的環(huán)境中，分析物通過硅膠孔進(jìn)出分離池而達(dá)到保留目的，分離池特性隨著外部(流動相)的化學(xué)環(huán)境改變而改變，包括產(chǎn)生長疏水鏈和親水鏈、離子化程度改變、電荷分布和反離子性質(zhì)的改變等。其豐富的離子交換特性使得分離方法的開發(fā)具有多樣性，僅通過改變乙腈-水的比例或酸濃度即可實(shí)現(xiàn)對分析物保留行為的改變，甚至改變洗脫順序。

在親水性色譜分離模式下，一般釆取富含有機(jī)相的流動相，無論固定相是否被電離，只要流動相中水的比例大于1%就可以在固定相表面出現(xiàn)多層吸附，形成“富水層”，該“富水層”的厚度滿足極性樣品在流動相和固定相中的分配。在有機(jī)溶劑中，乙腈作為流動相，可以獲得較好的樣品保留及尖銳對稱的峰形，是多數(shù)方法的首選。由于流動相中乙腈-水的比例對Obelisc R色譜柱的影響較大，因此重點(diǎn)探究了流動相中不同比例有機(jī)相對分離效果的影響。水相采用1%甲酸溶液?？疾炝鲃酉嘀幸译姹壤謩e為50%、70%、90%時，500 μg/L 氨基糖苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留情況，結(jié)果示于圖1。

圖1 流動相中含50%乙腈(a)、70%乙腈(b)、90%乙腈(c)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(500 μg/L)Fig.1 Chromatograms of 50%ACN (a), 70%ACN (b) and 90%ACN (c) in mobile phase

由圖1可以看出，乙腈比例為90%時各物質(zhì)均有較好的保留，分離效果較好。隨著乙腈比例的降低，各物質(zhì)的保留時間減小，70%乙腈時，壯觀霉素保留較弱；50%乙腈時壯觀霉素、潮霉素B、鏈霉素、雙氫鏈霉素均無保留。慶大霉素隨著乙腈比例的降低，峰形明顯變差，信號變?nèi)?。因此本?shí)驗(yàn)采用乙腈-水溶液(9∶1，V/V)作為流動相。

除乙腈的比例外，水相中酸的濃度對分離也有顯著影響。在流動相中添加不同濃度的甲酸溶液，在優(yōu)化的洗脫條件下，考察Obelisc R對氨基糖苷類抗生素的分離效果，結(jié)果示于圖2。

由圖2可知，甲酸濃度的增大可以增強(qiáng)流動相的洗脫能力；隨著酸濃度的降低，慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星的響應(yīng)明顯減弱，峰形展寬，不利于定量測定。綜合考慮9種物質(zhì)的保留情況、響應(yīng)強(qiáng)度、峰形、色譜柱耐受程度等因素，選擇添加1.0%的甲酸為最佳條件。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的評價

噴霧電離離子源(ESI)容易受樣品基質(zhì)的影響，在分析生物樣品時，未消除基質(zhì)效應(yīng)的影響可能會造成檢測結(jié)果偏高或偏低，所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠?；|(zhì)效應(yīng)存在基質(zhì)增強(qiáng)或基質(zhì)減弱。

本研究采用提取添加法對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價，將氨基糖苷類標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用空白溶劑(A1)與未凈化的空白豬肉樣品提取液(A2)稀釋至200 μg/L，然后進(jìn)行HPLC-MS/MS測定，考察基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果示于圖3。

未經(jīng)凈化的豬肉樣品提取液對氨基糖苷類抗生素質(zhì)譜信號影響非常大，而且由結(jié)果可知， SPE、HYG、DHSTR、STR四種物質(zhì)出現(xiàn)明顯的基質(zhì)信號抑制效應(yīng)，其中抑制效應(yīng)最嚴(yán)重的為STR，抑制比值僅為0.36；而AMI、KAN、APR、TOB、GEN五種物質(zhì)有明顯的基質(zhì)信號增強(qiáng)效應(yīng)，APR增強(qiáng)比值高達(dá)3.75。

2.4 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

為減少基質(zhì)效應(yīng)的影響，對樣品提取液進(jìn)行有效凈化十分必要。目前文獻(xiàn)報(bào)道對氨基糖苷類藥物的凈化多采用C18固相萃取小柱，而分子印跡聚合物固相萃取吸附劑(molecularly imprinted polymer sorbents)是近年來發(fā)展的一種將固相萃取與分子印跡技術(shù)結(jié)合起來的一種材料，對特定的化合物有較強(qiáng)的選擇性。本研究采用SupelMIPTMSPE-Aminoglycosides固相萃取小柱對樣品進(jìn)行凈化，并與C18固相萃取凈化的效果進(jìn)行了比較。分別用溶劑稀釋標(biāo)液(STD)、不經(jīng)固相萃取凈化的豬肉樣品提取液(Without SPE)、經(jīng)C18固相萃取小柱凈化的樣品提取液(C18)以及經(jīng)SupelMIPTMSPE-Aminoglycosides固相萃取小柱凈化提取液(SupelMIPTMSPE)稀釋的200 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。通過比較信號強(qiáng)度考察凈化效果，結(jié)果示于圖4。

圖2 流動相中含0.4%甲酸(a)、0.6%甲酸(b)、0.8%甲酸(c)和1.0%甲酸(d)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 Chromatograms of 0.4%FA (a), 0.6%FA (b), 0.8%FA (c) and 1.0%FA (d) in mobile phase

圖3 豬肉基質(zhì)對藥物響應(yīng)信號的影響Fig.3 Pork matrix effect on response signals

圖4 不同凈化方式對分析物響應(yīng)的影響Fig.4 Purification method effect on response signals

由圖4可知，對于存在基質(zhì)抑制的4種藥物(SPE、HYG、DHSTR和STR)經(jīng)過凈化以后，基質(zhì)抑制情況得到改善，采用分子印跡固相萃取法改善效果最為明顯；而對于存在基質(zhì)增強(qiáng)的5種藥物(AMI、KAN、APR、TOB和GEN)，經(jīng)過凈化后，基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)均減弱，氨基糖苷分子印跡固相萃取凈化法較經(jīng)典C18凈化效果更佳，這是由于其對分析物的高度選擇性，可在淋洗步驟中盡可能多地去除干擾物，凈化效果可提高10%～50%。

2.5 線性范圍與定量限

在使用外標(biāo)法進(jìn)行定量時，為了盡可能使標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品溶液具有相同的離子化效率，消除基質(zhì)效應(yīng)帶來的測定值誤差，本方法采用空白樣品提取液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制溶劑。精密量取一定體積的濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用處理后的空白基質(zhì)提取液稀釋，配制成一系列濃度分別為20、50、100、200、500和1 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液?；靹蚝?，按已優(yōu)化的色譜、質(zhì)譜條件分別進(jìn)樣20 μL進(jìn)行分析，所有分析物的質(zhì)量濃度x(μg/L)，和峰面積y之間均有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2)在0.993 7～0.999 9之間。具體的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)列于表2。

根據(jù)我國法規(guī)要求，豬肉中氨基糖苷類藥物的殘留最高限量在100～2 000 μg/kg之間，在空白豬肉樣品中添加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)前處理后上機(jī)測定，參考各種藥物的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，同時滿足信噪比(S/N)大于10的要求，確定各化合物的定量限為50.0 μg/kg。

2.6 方法回收率與精密度

對豬肉樣品分別進(jìn)行3個濃度水平(50、200、500 μg/kg)的空白加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每個濃度水平進(jìn)行6次平行測試，根據(jù)各組分的峰面積，計(jì)算相應(yīng)濃度的回收率和精密度，測得數(shù)據(jù)列于表3。樣品的平均添加回收率在76.9%～89.4%之間，精密度在3.56%～11.4%之間，可以滿足分析要求。

表2 線性方程和線性范圍Table 2 Regression equations and linear ranges of 9 AGs

3 結(jié)論

采用了一種新型的親水性O(shè)belisc R色譜柱，以乙腈-水體系作為流動相，通過新型液態(tài)分離池模式下形成的富水層，使9種氨基糖苷類藥物得到了很好的保留和分離，并用高靈敏度的串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測，避免了離子對試劑的引入。同時在前處理中引用了分子印跡固相萃取技術(shù)，提高了前處理的凈化效率，降低了基質(zhì)對氨基糖苷類藥物檢測的影響。在20～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，樣品的回收率在76.9%～89.4%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.56%～11.4%之間。該方法簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，可以滿足豬肉中氨基糖苷類藥物殘留的測定需求。

[1] 金有豫. 藥理學(xué)[M]. 第5版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：985-987.

[2] FORGE A, SCHACHT J. Aminoglycoside antibiotics[J]. Audiology and Neurotology, 2000, 5(1): 3-22.

[3] 王忠斌，王向紅，徐蓓，等. 氨基糖苷類藥物多殘留酶聯(lián)免疫分析方法的研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào),2008,8(5):120-125.

WANG Zhongbin, WANG Xianghong, XU Bei, et al. Studies on the ELISA for the simultaneous detection of aminoglycoside antibiotics[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2008, 8(5): 120-125(in Chinese).

[4] VERHEIJEN R, OSSWALD I K, DIETRIE R, et al. Development of a one step strip test for the detection of (dihydro)streptomycin residues in raw milk[J]. Food and Agriculture Immu nology, 2000, 12(1): 31-40.

[5] HOEBUS J, YUN L M, HOOGMARTENS J. An improved gas chromatographic assay for spectinomycin hydrochloride[J]. Chromatographia, 1994, 39(5): 71-73.

[6] 陳曉紅，劉小莉，董明盛，等. 高效液相色譜法測定蜂產(chǎn)品中鏈霉素殘留量[J]. 食品科學(xué)，2004，25(1)：155-158.

CHEN Xiaohong，LIU Xiaoli，DONG Mingsheng，et al. New method on streptomycin residues assay in honey by HPLC[J]. Food Science, 2004, 25(1): 155-158(in Chinese).

[7] 蔡玉娥，蔡亞岐，牟世芬，等. 離子交換-脈沖積分安培法分離檢測氨基糖苷類抗生素[J]. 分析實(shí)驗(yàn)室,2006,25(8):7-9.

CAI Yu’e，CAI Yaqi，MOU Shifen，et al. Separation of several aminoglycoside antibiotics with ion-exchange column following with pulsed integrated amperometric detection[J]. Chinese Journal of Analysis Laboratory, 2006, 25(8): 7-9(in Chinese).

[8] 苑麗，胡功政，肖傳斌，等. 反相高效液相色譜測定動物源食品中大觀霉素殘留[J]. 中國抗生雜志，2007，32(3)：166-168.

YUAN Li, HU Gongzheng, XIAO Chuanbin, et al. Determination of spectinomycin residues in animal food by RP-HPLC[J]. Chinese Journal of Antibiotics, 2007, 32(3): 166-168 in Chinese.

[9] GB/T 21323—2007 動物組織中氨基糖苷類藥物殘留量的測定高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

[10] HOLTHOON F L V, ESSERS M L, MULDER P J, et al. A generic method for the quantitative analysis of aminoglyeosides (and spectinomycin) in animal tissue using methylated intemal standards and liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2009, 637: 135-143.

[11] BOGIALLI S, CURINI R, DI C A, et al. Simple confirmatory assay for analyzing residues of aminoglycoside antibiotics in bovine milk: hot water extraction followed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2005, 1 067(1/2): 93-100.

[12] KAUFMANN A, MADEN K. Determination of 11 aminoglycosides in meat and liver by liquid chromatography with tandem mass spectrometry[J]. Journal of Aoac International, 2005, 88(4): 1 118-1 125.

[13] KAUFMANN A, BUTCHER P, MADEN K. Determination of aminoglycoside residues by liquid chromatography and tandem mass spectrometry in a variety of matrices[J]. Analytica Chimica Acta, 2012, 711(711): 46-53.

[14] TURNIPSEED S B, CLARK S B, KARBIWNYK C M, et al. Analysis of aminoglycoside residues in bovine milk by liquid chromatography electrospray ion trap mass spectrometry after derivatization with phenyl socyanate[J]. Journal of Chromatography B Analytical Technology, 2009, 877(14/15): 1 487-1 493.

[15] ISHII R, HORIE M, CHAN W, et al. Multi-residue quantitation of aminoglycoside antibiotics in kidney and meat by liquid chromatography with tandem mass spectrometry[J]. Food Additives and Contaminants, 2008, 25(12): 1 509-1 519.

[16] KAWANO S. Analysis of impurities in streptomycin and dihydrostreptomycin by hydrophilic interaction chromatography/electrospray ionization quadrupole ion trap/time-of-flight mass spectrometry[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2009, 23(6): 907-914.