芍藥愈傷組織中體細(xì)胞胚發(fā)育過程的組織細(xì)胞學(xué)觀察

魏冬霞 張 滕 鄭嚴(yán)儀 于曉南

(北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院/國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心，北京 100083)

芍藥愈傷組織中體細(xì)胞胚發(fā)育過程的組織細(xì)胞學(xué)觀察

魏冬霞 張 滕 鄭嚴(yán)儀 于曉南*

(北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院/國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心，北京 100083)

以芍藥(PaeonialactifloraPall.)3個(gè)芍藥品種的莖段、葉片、葉柄為外植體，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生,并采用石蠟切片法對(duì)該發(fā)育過程進(jìn)行組織細(xì)胞學(xué)觀察。結(jié)果表明：‘Going Bananas’的莖段愈傷誘導(dǎo)率達(dá)100%，增殖率在4.0以上，表現(xiàn)最佳；非胚性愈傷組織最佳誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)基為WPM+IAA 1.0 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+TDZ 0.5 mg·L-1+CH 0.625 g·L-1；愈傷組織轉(zhuǎn)入到1/2 MS(Ca2+加倍)+2,4-D 2.0 mg·L-1+ABA 0.5 mg·L-1或ZT 1.0 mg·L-1的培養(yǎng)基中，連續(xù)暗培養(yǎng)90后得到胚性愈傷；之后轉(zhuǎn)入到成熟培養(yǎng)基1/2MS(Ca2+加倍)+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1中，見光培養(yǎng)60 d，逐漸發(fā)育至球形胚和心形胚。在石蠟切片觀察中，芍藥的體細(xì)胞胚起源方式包括外起源和內(nèi)起源兩個(gè)途徑。在外起源方式中包括單個(gè)表層細(xì)胞的外起源和多個(gè)表層下細(xì)胞的共同起源。3種方式的區(qū)別主要在于起始的位置和起始細(xì)胞數(shù)量，后期均形成原胚結(jié)構(gòu)。胚性細(xì)胞的分裂方式為對(duì)稱分裂，未發(fā)現(xiàn)不對(duì)稱分裂細(xì)胞的存在。

芍藥；體細(xì)胞胚；起源方式；組織細(xì)胞學(xué)

芍藥(PaeonialactifloraPall.)為芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)多年生宿根草本植物，是中國(guó)傳統(tǒng)名花，已有4 000多年的栽培歷史[1]。其傳統(tǒng)繁殖方法主要集中在分株和播種上，但繁殖方法效率低下，難以滿足市場(chǎng)需求。隨著細(xì)胞生物學(xué)的興起，很多植物利用細(xì)胞全能性，通過組織培養(yǎng)技術(shù)建立起了再生體系，并進(jìn)一步開展了分子生物學(xué)研究[2]。在芍藥的組織培養(yǎng)工作中，目前較成熟的體系是地下芽的相關(guān)組培工作，但仍然存在著生根困難[3]，難以移栽成活以及取材不足的問題[4]。在愈傷組織誘導(dǎo)和再分化研究中，更是困難重重，主要問題在于不定芽的分化困難[5]以及嚴(yán)重的愈傷組織褐化和玻璃化等問題[6]。因此目前成熟的芍藥再生體系的還沒有建立，這也制約了本學(xué)科的深入發(fā)展[7]。

體細(xì)胞胚的發(fā)生途徑為芍藥的組織培養(yǎng)提供了更多成功的可能性，因?yàn)槠渫瑫r(shí)具有芽端和根端，較易發(fā)育為完整植株，且該方法繁殖效率高，一塊常規(guī)大小的愈傷組織可以產(chǎn)生幾十個(gè)成熟的體細(xì)胞胚[8～9]。體細(xì)胞胚發(fā)生方式存在兩種途徑，一是直接發(fā)生途徑，多是通過培養(yǎng)合子胚，誘導(dǎo)胚軸上的胚性細(xì)胞進(jìn)行繼續(xù)分裂，直接萌發(fā)出體細(xì)胞胚[10]；二是間接發(fā)生途徑，即通過愈傷組織直接誘導(dǎo)產(chǎn)生體細(xì)胞胚，進(jìn)行植株再生[11]。兩種方法相比較，間接發(fā)生途徑取材范圍更廣泛，且出胚率較高，對(duì)于那些不結(jié)實(shí)的植物種類顯得更加彌足珍貴[12]。芍藥在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)方面的研究鮮有報(bào)道，該過程的形態(tài)學(xué)和組織細(xì)胞學(xué)觀察前人更是未有涉及。本試驗(yàn)中的3個(gè)品種皆為國(guó)外引進(jìn)，具有較高觀賞價(jià)值，因?yàn)楦叨入s合，具有天然的不結(jié)實(shí)特性。因此本試驗(yàn)通過間接發(fā)生途徑誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的發(fā)生，探討胚性愈傷組織誘導(dǎo)和發(fā)育的培養(yǎng)條件要求，結(jié)合石蠟切片揭示芍藥體細(xì)胞胚起源方式與發(fā)育過程的組織細(xì)胞形態(tài)變化，為進(jìn)一步優(yōu)化芍藥體細(xì)胞胚發(fā)生體系提供參考依據(jù)，同時(shí)為下一步開展芍藥遺傳轉(zhuǎn)化體系建立良好的技術(shù)平臺(tái)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

3個(gè)芍藥品種均取自北京市昌平區(qū)小湯山實(shí)驗(yàn)苗圃，分別為1個(gè)伊藤雜種‘Going Bananas’芍藥，2個(gè)3倍體品種‘Roselette’芍藥和‘Red Charm’芍藥，3個(gè)品種均是2009年從荷蘭引至北京馴化培養(yǎng)后表現(xiàn)良好的健康植株。在3月中旬芍藥的抽莖期或展葉期階段，采集各品種的葉片、莖段和葉柄為外植體。

1.2 愈傷組織誘導(dǎo)和增殖

首先采用“兩步消毒法”進(jìn)行外植體的消毒處理[13]，接種時(shí)將葉片切成0.5 cm×0.5 cm見方的小塊，每個(gè)小方塊帶有一段主脈；莖段、葉柄橫切成0.1～0.3 cm的薄片?；九囵B(yǎng)基配方為IAA 1.0 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+TDZ mg·L-10.5+CH 0.625 g·L-1，基本培養(yǎng)基類型包括以下4種：WPM、MS、1/2MS、1/2MS(Ca2+加倍)。每種外植體每個(gè)處理接種10個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿接種5～7個(gè)外植體，重復(fù)3次，30 d后觀察記錄各處理的愈傷組織誘導(dǎo)情況。之后選擇各品種誘導(dǎo)率最高的處理，在原培養(yǎng)基中繼代1次(30 d)。該過程均為暗培養(yǎng)。

1.3 體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)和發(fā)育

選取增殖表現(xiàn)最佳的愈傷組織，以WPM為基本培養(yǎng)基，添加TDZ 0.05 mg·L-1+L-P 0.5 g·L-1，采用L9(34)三水平四因素正交設(shè)計(jì)(表1)，進(jìn)行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。每種處理接種10瓶，重復(fù)3次。連續(xù)暗培養(yǎng)90 d，每30 d繼代一次。

挑取淡黃色水潤(rùn)愈傷組織轉(zhuǎn)入以下3種培養(yǎng)基，進(jìn)行體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)和成熟：①1/2MS(Ca2+加倍)+6-BA 1.0 mg·L-1+2,4-D 0.2 mg·L-1；②1/2MS(Ca2+加倍)+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1；③1/2MS(Ca2+加倍)。各處理見光培養(yǎng)60 d，每30 d繼代1次，溫度23～25℃，光照周期16 h·d-1，光照強(qiáng)度1 800 lx，培養(yǎng)室空氣相對(duì)濕度65%左右。

表1 3種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的正交設(shè)計(jì)

1.4 體細(xì)胞胚發(fā)生過程的組織形態(tài)學(xué)觀察

將上述胚性愈傷組織發(fā)育過程中的樣品用德國(guó)產(chǎn)Leica體視顯微鏡DM2500進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。照相后，再將樣品用FAA固定，真空抽氣，直至樣品沉入瓶底。24 h后，依次進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(厚度10 μm)、粘片、展片、脫蠟、復(fù)水、番紅固綠染色、封片等程序后制作成石蠟切片。將切片置于德國(guó)產(chǎn)Leicas光學(xué)顯微鏡DM 2500下觀察胚性細(xì)胞形成與分裂、體細(xì)胞胚發(fā)生與發(fā)育等過程。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動(dòng)培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)的最佳處理組合

從誘導(dǎo)率上看，‘Going Bananas’、‘Roselette’、‘Red Charm’3個(gè)品種的最佳外植體類型均為嫩莖，最高誘導(dǎo)率分別為100%、83.33%、45.71%，其對(duì)應(yīng)的最佳基本培養(yǎng)基類型為WPM培養(yǎng)基、1/2MS(Ca2+加倍)培養(yǎng)基、1/2MS(Ca2+加倍)培養(yǎng)基(表2)。各品種在原最佳培養(yǎng)基中繼代1次后，增殖倍數(shù)均在3.00以上，尤其是品種‘Going Bananas’，增殖率為4.05，表現(xiàn)出旺盛的分裂能力。此時(shí)愈傷組織的類型均為淡黃色團(tuán)塊狀(表3)。

表2 3個(gè)品種愈傷組織誘導(dǎo)情況

表3 3個(gè)品種的愈傷組織增殖率

2.2 體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)和發(fā)育

選取增殖最佳的品種‘Going Bananas’的愈傷組織進(jìn)行胚性愈傷組織誘導(dǎo)，在9種培養(yǎng)基中得到4種愈傷組織類型，分別為淡黃色致密型、白色透明型、淡黃色松散型、淡黃色水潤(rùn)型。7號(hào)培養(yǎng)基中愈傷組織增殖倍數(shù)最大，達(dá)到4.63，8號(hào)培養(yǎng)基次之，增殖率為4.52，且兩種愈傷組織表面凸起明顯，整體濕潤(rùn)有韌性。結(jié)合石蠟切片觀察，確定為胚性愈傷組織。通過方差分析可知，2,4-D濃度為誘導(dǎo)其出現(xiàn)的最重要因素(表4)。

7號(hào)、8號(hào)培養(yǎng)基中的胚性愈傷組織見光培養(yǎng)后均緩慢轉(zhuǎn)為綠色。轉(zhuǎn)入到①號(hào)成熟培養(yǎng)基后，愈傷組織一直保持在淡黃色水潤(rùn)狀態(tài)，未見進(jìn)一步發(fā)育；轉(zhuǎn)入到②號(hào)培養(yǎng)基后，愈傷組織表面的顆粒狀凸起愈加明顯，后期可以剝離出單個(gè)球形小顆粒；③號(hào)培養(yǎng)基中的愈傷組織前期凸起加強(qiáng)，后期生長(zhǎng)遲緩。上述愈傷組織連續(xù)見光培養(yǎng)60 d后，表面變紅、硬化，生長(zhǎng)緩慢，沒有進(jìn)一步成熟發(fā)育。

2.3 胚性愈傷組織的形態(tài)學(xué)觀察

品種‘Going Bananas’的愈傷組織在7號(hào)和8號(hào)培養(yǎng)基中表現(xiàn)為淡黃色水潤(rùn)狀，其顆?；黠@，質(zhì)地堅(jiān)韌(圖1:B)；見光培養(yǎng)后，胚性愈傷組織慢慢變綠，表面顆?；黄鹩用黠@，肉眼可見(圖1:C)；另一些為非胚性愈傷組織，呈現(xiàn)大型團(tuán)塊狀，外表淺黃色偏白，無明顯凸起，質(zhì)地疏松較脆(圖1:A)。體式顯微鏡下，胚性愈傷組織表面可見明顯凸起顆粒(圖1:D)，內(nèi)部呈現(xiàn)淡黃色光澤(圖1:E)。從組織細(xì)胞學(xué)角度觀察兩種細(xì)胞形態(tài)，胚性細(xì)胞體積較小，排列規(guī)整緊密，邊界明顯，細(xì)胞質(zhì)濃，細(xì)胞核大且易被染色，液泡較少或無液泡，具有旺盛的細(xì)胞分裂能力(圖1:F中黑色箭頭所指)；非胚性細(xì)胞體積大，排列不規(guī)則，細(xì)胞核較小，不易被染色(圖1:F中白色箭頭所指)。兩種細(xì)胞形態(tài)差別較大，邊界明顯，很容易區(qū)分。

圖1 ‘Going Bananas’芍藥兩種愈傷組織形態(tài)比較 A.非胚性愈傷組織外觀；B.胚性愈傷組織外觀；C.胚形愈傷組織的顆粒狀凸起；D.體式顯微鏡下胚性愈傷組織外部觀察；E.體式顯微鏡下胚形愈傷組織內(nèi)部觀察；F.兩種細(xì)胞形態(tài)比較Fig.1 Morphology comparison of two kinds callus of ‘Going bananas’ A. Appearance of non-embryonic callus；B. Appearance of embryonic callus；C. Granular protrusions of embryonic callus；D. Appearance of embryonic callus under stereo microscope；E. Internal observation of embryonic callus under stereo microscope；F. Comparison of cell morphology of two callus types

表4 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)‘Going Bananas’胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.4 芍藥愈傷組織中體細(xì)胞胚起源過程的組織細(xì)胞學(xué)觀察

經(jīng)大量切片觀察發(fā)現(xiàn)，芍藥體細(xì)胞胚既可起源于胚性愈傷組織表層單個(gè)細(xì)胞或是多個(gè)表層下細(xì)胞，又可起源于愈傷組織內(nèi)部細(xì)胞，且以外起源為主，其具體起源過程如下。

單個(gè)表層細(xì)胞起始的外起源過程：在胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，愈傷組織表層個(gè)別細(xì)胞在外源激素的作用下向外分裂形成單個(gè)突出于外表的胚性細(xì)胞，其體積大而圓，細(xì)胞質(zhì)濃，細(xì)胞核大而染色深。在該細(xì)胞下還有一個(gè)長(zhǎng)條形細(xì)胞(圖2:A)。頭部圓細(xì)胞經(jīng)過多次分裂在愈傷組織表面形成一個(gè)致密的胚性細(xì)胞團(tuán)凸起(圖2:B)，其中的胚性細(xì)胞體積小、排列緊密、邊界規(guī)則；下方長(zhǎng)條形細(xì)胞通過多次分裂產(chǎn)生更多的長(zhǎng)條形細(xì)胞，兩種細(xì)胞共同構(gòu)成原胚(圖2:C)。該類型的起源方式形成的原胚與母體聯(lián)系較少，大部分結(jié)構(gòu)裸露在外部空間，在位置效應(yīng)作用下，孤立的細(xì)胞團(tuán)能有效地減少與周圍細(xì)胞的信息交流，盡早形成生理和形態(tài)上的隔離，從而啟動(dòng)新的細(xì)胞分化，進(jìn)行獨(dú)立的體細(xì)胞胚后熟發(fā)育。

多個(gè)表皮下細(xì)胞共同起源過程：位于表層愈傷組織下方的細(xì)胞層的某些細(xì)胞細(xì)胞核變大，細(xì)胞質(zhì)變得稠密，隨后經(jīng)過對(duì)稱分裂(圖2:D)，在表層細(xì)胞下形成更大的胚性細(xì)胞分布范圍(圖2:E)，后期出現(xiàn)具有多個(gè)分裂中心的、相對(duì)孤立的胚性細(xì)胞團(tuán)(圖2:F)。隨后胚性細(xì)胞團(tuán)開始分化出現(xiàn)極性，包括細(xì)胞質(zhì)濃厚的頭部圓球狀區(qū)域和液泡化伸長(zhǎng)的基部(圖2:G)。隨著發(fā)育的進(jìn)行，頭部的細(xì)胞通過垂周分裂(圖2:H黑色箭頭所示)形成類表皮層，最終形成具有完整類表皮(圖2:I黑色箭頭所示)的原胚。胚性細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生多個(gè)胚性細(xì)胞團(tuán)，并由此發(fā)育形成原胚。

胚性愈傷組織內(nèi)起源過程：位于愈傷組織內(nèi)部的單個(gè)胚性細(xì)胞啟動(dòng)分裂形成由幾個(gè)細(xì)胞組成的胚性細(xì)胞團(tuán)(圖3:A)，這些胚性細(xì)胞呈小而規(guī)則的正方形，排列緊密，與四周大而松散的普通細(xì)胞區(qū)別明顯。胚性細(xì)胞繼續(xù)分裂，并且逐漸出現(xiàn)兩極化趨勢(shì)，分生出頭部和柄部(圖3:B)。頭部細(xì)胞仍然由小而規(guī)則的正方形細(xì)胞組成，柄部細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的長(zhǎng)條形，兩部分共同構(gòu)成了原胚。通過胚性細(xì)胞的進(jìn)一步分裂，原胚繼續(xù)增大、成熟，可見明顯的‘胚頭’和‘胚柄’結(jié)構(gòu)(圖3:C)。新的原胚的產(chǎn)生有兩種途徑，一是通過上述方式，由內(nèi)部胚性細(xì)胞分裂和兩極化而來(圖3:D)；二是成熟原胚頭部細(xì)胞繼續(xù)縱向分裂，在‘胚頭’的中間部位形成類表皮層(圖3:E)使‘胚頭’一分為二，產(chǎn)生新的‘胚頭’結(jié)構(gòu)。該新生的‘胚頭’結(jié)構(gòu)后期再產(chǎn)生極性，形成新的成熟原胚。原胚細(xì)胞繼續(xù)分裂并向愈傷組織表層方向生長(zhǎng)，其周圍的薄壁細(xì)胞逐漸解體消失，最后突破愈傷組織表層，突出于母體組織，此時(shí)它仍通過‘胚柄’與母體組織連接(圖3:F)。但由內(nèi)起源產(chǎn)生的原胚表面不像外起源產(chǎn)生的原胚光滑，表面還附著部分殘留的細(xì)胞碎片。

圖2 體細(xì)胞胚在愈傷組織表層的外起源過程 A.愈傷組織表面形成的單個(gè)圓球狀胚性細(xì)胞和長(zhǎng)條形胚性細(xì)胞(箭頭所指)；B.胚性細(xì)胞團(tuán)；C.原胚(右側(cè))和原胚團(tuán)(左)；D.表皮下少量同時(shí)分裂的胚性細(xì)胞；E.大范圍的胚性細(xì)胞團(tuán)；F.多個(gè)胚性細(xì)胞團(tuán)中心；G.類表皮結(jié)構(gòu)出現(xiàn)；H.垂周分裂出的類表皮(黑色箭頭)；I.完整的類表皮(黑色箭頭)和發(fā)育不一的原胚團(tuán)Fig.2 Exogenous origin process of somatic embryos on callus surface A. Single embryonic cell formed on the surface of callus(marked by arrow)；B. The embryogenic cell mass in the surface layer；C. Proembryo(the right side) and proembryo mass(the left side)；D. Simultaneous division of embryogenic cells under the surface layer； E. Larger range of embryogenic cell mass；F. Multiple embryogenic cell mass centers；G. Appearance of protoderm-like layer；H. Anticlinal division(black arrow)；I. Complete protoderm-like layer(black arrow) and proembryo mass with different development degree

圖3 體細(xì)胞胚在愈傷組織中的內(nèi)起源過程 A.位于愈傷組織內(nèi)部的少數(shù)胚性細(xì)胞；B.胚性細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)兩極化；C.發(fā)育成熟的原胚結(jié)構(gòu)；D.原胚的產(chǎn)生方式(一)；E.原胚的產(chǎn)生方式(二)；F.突出表層細(xì)胞的原胚Fig.3 Endogenous origin process of somatic embryos inside callus A. A few embryonic cells in the internal of callus；B. Polarized embryonic cell mass；C. Mature proembryo；D. The first generating mode of proembryo；E. The second generating mode of proembryo；F. Proembryo which just came out of the callus

圖4 芍藥早期胚的組織細(xì)胞學(xué)觀察 A.原胚；B.脫離母體的原胚團(tuán)；C.早期球形胚；D.球形胚形成類表皮；E.球形胚內(nèi)部的兩個(gè)分裂中心；F.心形胚Fig.4 Morphological and histological observation of the origin of early somatic embryos of herbaceous peony A. Proembryo；B. The proembryo totally broke through the callus；C. Early globular embryo；D. Globular embryo with class epidermis；E. Two split centers inside globular embryo；F. Heart embryo

2.5 芍藥早期體細(xì)胞胚發(fā)育的組織細(xì)胞學(xué)觀察

突破表層的原胚(圖4:A)，頭部細(xì)胞生長(zhǎng)加速，細(xì)胞分裂旺盛，表面更加光滑，頂部圓而突出；而基部長(zhǎng)條形細(xì)胞則慢慢空泡化，逐漸解體，原胚與母體分離(圖4:B)或者僅通過少量的解體細(xì)胞，附著在母體表面(圖4:C)。隨后，每個(gè)圓球形的細(xì)胞團(tuán)表層逐漸形成完整的類表皮(圖4:D)，此時(shí)發(fā)育到球形胚時(shí)期。球形胚的內(nèi)部細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行分裂，同時(shí)形成兩個(gè)分裂中心(圖4:E)，分裂中心通過旺盛的分裂活動(dòng)，產(chǎn)生大量細(xì)胞，使得球形胚體積增大，并且向兩側(cè)前方突出，最終形成似心臟形狀的結(jié)構(gòu)，稱為心形胚(圖4:F)。心形胚之后并沒有繼續(xù)發(fā)育，而是停留在了該階段。

3 討論

體細(xì)胞胚發(fā)生的具體條件因植物種類、基因型、外植體類型等的不同而相差很大[14]。本試驗(yàn)中，品種‘Going Bananas’的莖段外植體表現(xiàn)最佳，高濃度的2,4-D和長(zhǎng)時(shí)間的暗培養(yǎng)是胚性細(xì)胞出現(xiàn)的決定因素，這與其他物種的研究結(jié)果一致[15～16]。在胚性愈傷組織成熟后期去除2,4-D，并輔以6-BA和NAA，成功誘導(dǎo)原胚發(fā)育為球形胚和心形胚。有很多植物的體細(xì)胞胚均是在去除2,4-D的培養(yǎng)基上輔以少量激素或不加任何激素得來的[17～18]。

通過石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，芍藥體細(xì)胞胚起源的方式十分多樣，同時(shí)存在著內(nèi)起源與外起源兩種方式，而外起源發(fā)生方式又可以分為單細(xì)胞表層外起源和多細(xì)胞表層下外起源。在其他植物種類中，也普遍存在同時(shí)具有多種起源途徑的情況[19～20]。比較3種具體外起源方式的效果，發(fā)現(xiàn)主要區(qū)別在于原胚的發(fā)生量上。在多細(xì)胞外起源方式中，胚性細(xì)胞團(tuán)往往形成多個(gè)細(xì)胞分裂中心，極大地保證了體細(xì)胞胚的發(fā)生數(shù)量和發(fā)生速度。另外，通過觀察細(xì)胞分裂方式發(fā)現(xiàn)，胚性細(xì)胞均是對(duì)稱分裂的，當(dāng)然由于不同的品種和培養(yǎng)基以及觀察方式的局限性都會(huì)導(dǎo)致很難確定原始的不對(duì)稱分裂的存在[21]，因此就從本次切片觀察來看，胚性細(xì)胞采用對(duì)稱分裂方式。而且，在胚性細(xì)胞團(tuán)中，除大量的胚性細(xì)胞外，還存在少量體積較大的薄壁細(xì)胞。這些少量的薄壁細(xì)胞在胚性細(xì)胞團(tuán)中主要分布在分裂中心的邊緣地帶，在原胚結(jié)構(gòu)中主要分布在‘胚頭’的中心區(qū)域，但是其數(shù)量一直占細(xì)胞總量的極小部分。這些薄壁細(xì)胞的存在也說明各個(gè)細(xì)胞在同一激素水平的誘導(dǎo)下，接受激素(2,4-D等)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變成胚性細(xì)胞的能力存在差異，這一現(xiàn)象在其他植物種類中也曾出現(xiàn)[14]。

但是，本次實(shí)驗(yàn)體細(xì)胞胚只發(fā)育到心形胚階段，并沒有進(jìn)一步向下發(fā)育。通過參考其他物種的體胚誘導(dǎo)研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)盡管不同物種的體胚起源有差異，但后期體胚發(fā)育非常相似，體胚進(jìn)入球形胚階段后，轉(zhuǎn)移到低濃度水平或不含激素的培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行見光培養(yǎng)，即可自動(dòng)進(jìn)行體胚的成熟和發(fā)育，最終得到子葉胚[22～24]。但這一相通的培養(yǎng)方式顯然對(duì)芍藥不適用，推測(cè)這和物種的特性有關(guān)，可能芍藥的體胚后成熟過程相較于其他物種要求更加嚴(yán)格的培養(yǎng)條件。相似情況在其他物種的實(shí)驗(yàn)中也曾遇到[25～27]，適宜的成熟培養(yǎng)方式還需要后期進(jìn)行深入探討。

綜上所述，芍藥的體細(xì)胞胚發(fā)生過程相當(dāng)復(fù)雜，從多方式的起源發(fā)育到嚴(yán)格的體胚后熟階段，其生理生化和形態(tài)學(xué)變化涉及到多種基因的調(diào)控[28～29]。因此，要深入探討造成體細(xì)胞胚發(fā)生初期的這種差異性的機(jī)理以及后期的嚴(yán)格成熟條件要求，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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Graduate Training and Development Program of Beijing Municipal Commission of Education(BLCXY201629)；National Natural Science Foundation of China(31400591)

introduction：WEI Dong-Xia(1991—)，female，postgraduate，research direction：plant tissue culture.

date:2017-05-17

HistocytologyObservationontheSomaticEmbryogenesisinHerbaceousPeonyCallus

WEI Dong-Xia ZHANG Teng ZHENG Yan-Yi YU Xiao-Nan*

(College of Landscape Architecture,Beijing Forestry University,Beijing 100083)

The stem segments, leaves and petioles of three herbaceous peony was used as explants for somatic embryogenesis. Paraffin method was used for morphological and histological observation of somatic embryogeneris. The main conclusions were as follows: callus induction rate from stems of ‘Going Bananas’ was 100%. Proliferation rate of the callus was over 4.0. The best induction and proliferation medium of inducting callus was WPM+IAA 1.0 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+TDZ 0.5 mg·L-1+CH 0.625 g·L-1. Embryogenic callus generated after transferred the callus to 1/2 MS(Ca2+doubled)+2,4-D 2.0 mg·L-1+ABA 0.5 mg·L-1or ZT 1.0 mg·L-1medium of a constantly dark cultivation of 90 d. Globular embryos and heart embryos were generated after transferred the embryogenic callus to 1/2MS(Ca2+doubled)+6-BA1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1medium for a constantly illumination cultivation of 60 d. There are exogenous and endogenous origins of somatic system. Exogenous includes origins from individual surface cells and origins from multiple subcritical cells. The difference of three ways lies mainly in starting position and starting cells number, they will all generated proembryo later. The splitting of embryogenic cells was symmetrical and the presence of asymmetric splitting cells was not found.

herbaceous peony;somatic embryo;origin;histocytology

北京市教育委員會(huì)科學(xué)研究與研究生培養(yǎng)共建項(xiàng)目資助(BLCXY201629)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31400591)

魏冬霞(1991—)，女，碩士研究生，主要從事芍藥組織培養(yǎng)方面的研究。

* 通信作者：E-mail:yuxiaonan626@126.com

2017-05-17

* Corresponding author：E-mail:yuxiaonan626@126.com

S682.1+2

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2018.01.007