青藏高原東南部山丹nrDNA ITS和cpDNA petB/petD序列的分子進化特點

蔣福娟 唐 楠 唐道城 巨秀婷 孫靜清

(1.青海大學高原花卉研究中心/青海省園林植物與觀賞園藝重點實驗室,西寧 810016； 2.青海省高原作物種質資源創(chuàng)新與利用國家重點實驗室培育基地，西寧 810016； 3.大通縣林業(yè)局,大通 810100； 4.西寧市人民公園,西寧 810008)

青藏高原東南部山丹nrDNAITS和cpDNApetB/petD序列的分子進化特點

蔣福娟1,3唐 楠1,2*唐道城1巨秀婷1孫靜清4

(1.青海大學高原花卉研究中心/青海省園林植物與觀賞園藝重點實驗室,西寧 810016；2.青海省高原作物種質資源創(chuàng)新與利用國家重點實驗室培育基地，西寧 810016；3.大通縣林業(yè)局,大通 810100；4.西寧市人民公園,西寧 810008)

采用改良CTAB法提取青藏高原東南部山丹25個居群所有個體的基因組DNA，選取核基因ITS和葉綠體petB/petD區(qū)域進行PCR擴增、純化和測序。對所有序列對位排列，其中ITS序列總長696 bp，變異位點有4處，共產生7種單倍型，變異位點百分率為0.72%，(G+C)含量60.4%；petB/petD序列總長616 bp，僅1處變異位點和2種單倍型，變異位點百分率為0.16%，(G+C)含量34.6%。表明山丹中，petB/petD區(qū)域較ITS序列保守，變異速率較慢。對ITS序列單倍型進行失配分布和中性檢驗分析發(fā)現，山丹現有分布范圍可能經歷了近期居群小范圍擴張，AMOVA分析發(fā)現山丹居群的遺傳變異主要存在于居群內，NST>GST(P>0.01)，表明山丹的遺傳變異有著不顯著的譜系地理結構。因此，山丹ITS序列適合該種的譜系地理學研究。

青藏高原東南部;山丹;ITS;petB/petD;分子進化

山丹(LiliumpumilumRedouté)隸屬百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)卷瓣組，據Flora of China記載，它廣泛分布于中國(尤為西北和東北)、朝鮮、蒙古、俄羅斯(西伯利亞中部和東部)等地。青藏高原東南部的百合屬植物主要有山丹、卷丹(Liliumlancifolium)和蘭州百合(Liliumdavidii)[1]，其中山丹是該地區(qū)的唯一野生種，多數分布在海拔1 460.0～3 918.0 m的干旱陽坡草地、林緣及林間溝谷[2]?？购?，抗旱，喜涼爽，土壤要求疏松肥沃及排水良好。野生植株高5.0～50.0 cm，在適宜條件下可達80.0 cm以上。鱗莖生長較慢，鱗片具有較高的營養(yǎng)價值。葉條形，花單生或數朵排成總狀花序，鮮紅色，具有較高觀賞性。目前山丹的研究多集中在形態(tài)解剖學[3～4]、生理生化[5]、資源利用與種質創(chuàng)新[6]、組織培養(yǎng)[7]及種間親緣關系和遺傳多樣性[8]等方面，本實驗室研究人員Nan Tang等人[2]已利用多種方法對山丹進行了遺傳多樣性的分析，在前人實驗的基礎上，對其進行ITS序列和cpDNA序列的研究尚屬首次。

隨著分子生物學研究的不斷深入，用于系統進化研究的分子標記已由過去的RFLP、RAPD、ISSR等過渡到nrDNA(核糖體DNA)、cpDNA(葉綠體DNA)和mtDNA(線粒體DNA)的基因片段。其中應用最廣泛的是核基因組nrDNA ITS序列，ITS由18S，5.8S和26S分成兩個區(qū)段，即ITS1和ITS2。ITS基因保守，且相對進化速度較快[9]。ITS區(qū)的可變性為物種鑒定提供了豐富的變異位點，比較適合于研究被子植物種間和種內關系[10]。與nrDNA相比，cpDNA分子量小、多拷貝且結構簡單，有利于構建物理圖譜、分離與鑒定特定基因和測序。常用的cpDNA片段有編碼區(qū)和非編碼區(qū)，兩者進化速率不同，故解決的問題也不盡相同。許多物種的研究表明cpDNA片段能很好地表現種間和種內的變異[11]，可為系統發(fā)育的研究提供具有參考價值的變異位點[12]。

本文以青藏高原東南部山丹25個居群217個個體為研究對象，將ITS和petB/petD兩者的序列進行比對分析，從而研究該物種ITS和cpDNA序列的分子特點和遺傳多樣性，并從這兩個序列初步判定該種在青藏高原東南部形成現有分布格局的成因。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本試驗所用山丹有25個居群217個個體，分布于青海東南部、甘肅西南部、陜西太白山地區(qū)(北緯33°59′30″～37°16′54.8″，東經100°56′24.9″～107°12′53″，海拔1 460～3 918 m)。采樣時各居群間隔大于10.0 km，以自然山溝或山峰、林區(qū)等相對隔離，居群內各單株間距離大于20.0 m，海拔高差5.0 m以上，以盡可能避免居群間采集的樣本屬于相同或相近的生態(tài)區(qū)域。每個居群隨機采集了3～12個個體，采集的葉片先用ddH2O沖洗，再用70%的乙醇棉球擦洗干凈，貼好標簽后放入硅膠中快速干燥后帶回，于-80℃超低溫冰箱中備存，并在青海大學高原花卉研究中心建立山丹居群組培保存體系(表1)。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取

使用CTAB改良法提取基因組DNA[13]，為減少DNA氧化可加入少量PVP干粉，為提高DNA濃度和質量可加2%的β-巰基乙醇，提取完成后加2 μL RNA酶以消除RNA干擾。使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，使用核酸蛋白檢測儀檢測純度和濃度。

1.2.2ITS和cpDNApetB/petD序列的擴增和測序

采用通用引物ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)和ITS5(GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)[14]以及petB(CTGCCGTATTTATGTTAATG)和petD(GTCTAGCCCCTGTTCTTCCT)[15]分別對山丹ITS和petB/petD序列進行擴增。擴增反應在Bio-Rad MyCycler PCR擴增儀上進行。擴增反應體系[16]為：在25 μL的總反應體系中，含Mg2+2.0 mmol·L-1、dNTPs 0.2 mmol·L-1、引物0.2 μmol·L-1、Taq酶0.25 U、50 ng模板DNA 2 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL以及upH2O 15.4 μL。擴增反應程序為：94℃預變性5 min后，進入35個循環(huán)：包括94℃變性45 s，ITS-PCR 55℃退火45 s(cpDNA-PCR 53.1℃退火45 s)，72℃延伸1 min。隨后72℃終延伸10 min，最后-4℃存儲備用。瓊脂糖電泳檢測中條帶單一明亮的PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司，完成純化和測序。對各個樣品進行雙向測序，并將第一次測序所得的有變異位點的樣品進行三次測序，以保證變異位點的準確性。為使試驗結果更加全面，特選用另外8條cpDNA片段進行PCR擴增與測序，以對照petB/petD序列之結果。

表1 山丹居群采集信息

1.2.3 數據處理

測得的序列用BioEdit和ClustalX軟件進行比對[17]，并參照峰圖進行手工校正。使用DnaSP5.0[18]統計出其核苷酸G+C的含量、變異位點、核苷酸多樣性指數和單倍型類型等，失配分析、Tajima’s D和Fu’s Fs分析也在此軟件中完成，以檢驗山丹居群間是否經歷了近期居群范圍擴張[19～20]。用軟件MEGA6.0分析核苷酸組成，并用鄰接(Neighbor-Joining,NJ)法以1 000次自展檢驗構建NJ樹[21]。利用軟件Arlequin3.5.2.2進行AMOVA(Analysis of Molecular Variance)分析，計算居群內、居群間的變異方差分布，并分析總樣本的變異固定于居群間或居群內[22]。使用軟件TCS1.21[23]構建ITS各單倍型之間的單倍型中央連接網絡圖。用程序Permut & CpSSR2.0計算居群間和居群內的平均遺傳多樣性(HS和HT)，并計算居群遺傳分化指數GST[24]和NST[25]。

2 結果與分析

2.1 ITS和cpDNA petB/petD目的片段的擴增

利用優(yōu)化后的擴增體系對ITS和petB/petD片段進行擴增，得出單一、整齊、清晰且穩(wěn)定的條帶，電泳顯示基本無非特異性擴增和引物二聚體(圖1)。

圖1 nrDNA ITS區(qū)域(A)和cpDNA petB/petD區(qū)域(B)PCR擴增電泳結果Fig.1 Results of PCR amplification of ITS(A) and cpDNA petB/petD(B)

表2 山丹ITS 7種單倍型的變異位點

2.2 山丹各居群ITS和petB/petD序列分析

對所有個體的ITS和petB/petD區(qū)域進行雙向測序，并利用軟件BioEdit和ClustalX進行比對。經排序比對后得到ITS堿基恒定長度為696 bp，G+C含量是60.4%，變異位點百分率為0.72%，變異位點有4處，即在41、82和494處發(fā)生C-T轉換，在521處發(fā)生G-T顛換(表2)。經比對ITS序列共擁有7種單倍型，其中H1為廣布單倍型，分布于除SM居群外的其它24個居群中。25個居群中只有YQ、SP、SM 3個居群不存在居群內變異，其余22個居群都存在不同程度居群內個體間變異。

經AMOVA分析，居群內遺傳變異占83.65%，居群間占16.35%(表3)。FST=0.163 50(P<0.001)，假設研究的ITS4-ITS5序列變異處于漂變—遷移平衡(drift-migration equilibrium)，則基于FST值估算的物種水平上居群間的平均基因流Nm=1.279 1，Nm>1，表明群體間的基因流的水平較高，群體間遺傳分化較小[26]。居群內平均遺傳多樣性Hs(se)為0.430(0.048 4)，居群間總平均遺傳多樣性HT(se)為0.518(0.048 8)，總的居群遺傳分化系數GST(se)值為0.170(0.079 5)，NST(se)值為0.218(0.090 9)，使用U-統計方法對ITS序列型的變異進行檢驗后發(fā)現NST>GST(P>0.01)，表明山丹的遺傳變異存在一定的譜系地理結構，但不顯著。

表3 基于ITS4-ITS5序列山丹25個居群的遺傳變異分析

運用軟件MEGA6.0對7種單倍型進行NJ樹構建，并與TCS單倍型網絡圖進行對照分析。如圖2所示，山丹單倍型分布呈典型的輻射狀譜系結構，說明存在居群擴張。分布廣且頻率高的單倍型H1位于中央連接網狀圖的中心，表示H1可能是較為原始的單倍型，其余的稀有單倍型位于外部節(jié)點，表明可能是由原始祖先單倍型衍生而來[23]。

圖2 基于ITS4-ITS5序列的山丹單倍型網絡圖 a.圓圈大小與單倍型頻率正相關；b.NJ樹Fig.2 Haplotype network of L.pumilum based on ITS4-ITS5 sequence a. Circle size is proportional to the relative frequency of the haplotypes; b. Neighbor-Joining tree

用DnaSP5.0軟件對山丹ITS序列進行失配分析(MDA,Mismatch distribution analysis)和中性檢驗(Neutrality test)，失配分析是以可視形式展現群體歷史動態(tài)的一種方式。若種群經歷了擴張，其失配分布曲線為單峰。失配分布圖(圖3)表明觀測值與期望值都為單峰分布曲線，說明青藏高原東南部山丹居群經歷了近期范圍擴張[19]。中性檢驗得出較為保守的Tajima’s D檢驗值為0.468 74(P>0.10)，Fu and Li’s D*檢驗值為0.877 92(P>0.10)，Fu and Li’s F*檢驗值為0.880 31(P>0.10)，Fu’s Fs值為-1.537。其中Fu’s Fs值為負值說明與失配分布結果一致，表明其存在居群擴張[27]；而其它三個檢驗值雖為正值，但都不顯著，并未背離中性平衡。綜合結果表明青藏高原東南部山丹的分布在不背離中性平衡的條件下，可能經歷了近期居群的小范圍擴張。

圖3 山丹ITS序列數據的失配分布Fig.3 Mismatch distribution of ITS sequences of L.pumilum

表4 山丹ITS 和petB/petD序列的比較

經對位排列，得出petB/petD序列的恒定長度為616 bp，G+C含量為34.6%，這與cpDNA基因G+C含量低[9]的特點相吻合，變異位點百分率0.16%，僅在182 bp處有一個堿基置換(C-T)。合并相同序列后得到2個單倍型，其中T1(表1)分布于除JD居群外的其它24個居群中，說明T1是廣布單倍型；T2為JD居群特有，XL居群中兩種類型均有，表明XL存在居群內變異。同時，由表4可以看出山丹ITS序列的G+C含量、變異位點百分率和遺傳多樣性均大于petB/petD序列。后續(xù)研究中，針對其它8條cpDNA片段(psbA/trnH、rbcL 1F/rbcL724R、rpl20/rps12、trnQ(UUG)/rps16×1、ndhA×1/ndhA×2、rpL16F71/rpL16R1516、ndhJ/TabE、ndhG/ndhI)的測序結果，尚未提供有用的信息位點。

3 討論

ITS和cpDNA是被子植物系統進化的主要研究方法。ITS之所以能解決屬間及種間的系統發(fā)育問題，主要是因其長度的保守和序列的變異[28]。cpDNA在種水平上較為保守，進化速率僅為核基因的1/5[29]。cpDNA之所以成為研究植物種間系統發(fā)育的首選方法，是因為其分子量小、多拷貝、結構簡單且單親遺傳的特點[29]。

本研究使用PCR產物直接測序法分析了山丹居群間ITS序列和petB/petD序列的堿基差異，初步確定了兩套植物基因組的變異速率，即山丹ITS序列的變異速率大于petB/petD序列的變異速率，ITS序列的遺傳多樣性也大于petB/petD序列的遺傳多樣性，petB/petD序列較ITS序列保守，這與葉綠體基因較為保守的研究結果一致，但與段義忠等[9]對窄葉鮮卑花、楊路存等[30]對羌活的研究結果不一致，他們認為所研究的物種ITS較cpDNA序列保守，且變異速率較慢。說明不同物種petB/petD和ITS反應的結果不完全一致。

青藏高原東南部山丹ITS序列共產生7種單倍型，其中H1在24個居群中均出現，屬于廣布單倍型，證實了居群間的遺傳保守性，同時25個居群中出現了7種單倍型也說明了青藏高原東南部地區(qū)的山丹居群有著豐富的遺傳多樣性。依據NJ樹及TCS單倍型網絡圖看出H1可能是較為原始的單倍型，也進一步支持了H1所反應的居群間遺傳保守性之觀點。失配分布圖為單峰，證實了青藏高原東南部山丹經歷了擴張。由4個中性檢驗值和失配分布曲線圖得知青藏高原東南部山丹在遺傳保守的前體下存在近期居群小范圍擴張的可能。雖然ITS序列能提供的變異位點較少，但借助其失配分析和中性檢驗大致可以判斷出青藏高原東南部山丹分布的歷史演變，因此ITS序列適用于山丹的居群進化歷史研究。而對petB/petD序列及其它8條cpDNA片段的研究結果得出，cpDNA序列所能提供的信息位點太少，不能為該種群的進化分析提供有力依據，故不適用于該種的譜系地理學研究。

對ITS序列的AMOVA分析表明山丹居群遺傳變異主要在居群內，而居群間具有較小的遺傳變異，這說明青藏高原東南部地區(qū)的山丹居群間的基因交流比較頻繁，這個結果與青藏高原許多植物的遺傳多樣性是一致的，即基因多樣性較高而核苷酸多樣性較低；但也與如西川紅景天[31]、窄葉鮮卑花等[32]的研究結果存在一定的差異，西川紅景天和窄葉鮮卑花表現出居群間變異大于居群內。同時山丹居群間的遺傳分化指數NST>GST(P>0.01)差異不顯著進一步說明該物種具有不顯著的譜系地理結構，這與王昊[33]等人對西藏沙棘的的研究結果類似。一般而言，植物居群間分化程度較高的情況是一年生、異交或風媒傳播的種子，而分化程度較低則是多年生、自交的種子[34]。山丹居群內遺傳變異高于居群間，這與異交或風媒傳播種子和鱗莖多年生繁殖的特性有關，百合的花粉粒徑大經風傳播受限[35]，地理隔離導致居群間遺傳多樣性低而相對穩(wěn)定，居群內無性繁殖受青藏高原氣候環(huán)境復雜性的影響，導致遺傳多樣性較為豐富。要用山丹居群間和居群內的遺傳多樣性和遺傳分化指數更準確描述分子進化特點，尚需繼續(xù)擴大采樣地范圍，在偏離分布中心較遠的區(qū)域尋找遺傳多樣性更豐富的地區(qū)。本研究僅為青藏高原地區(qū)植物區(qū)系及系統發(fā)育研究提供了又一個新的參考點，對豐富青藏高原地區(qū)物種種群歷史動態(tài)和地理分布格局關系的認識提供了寶貴的理論解釋。

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Natural Science Foundation of China 31660582(Genetic mapping of resistance gene for tulip breaking virus)；“Thousand Talents Program”of Qinghai Province；CAS“Light of West China”Program

introduction：JINAG Fu-Juan(1986—),female,master degree students,assistant Engineer,mainly engaged in Landscape Plant Genetic Breeding Research work.

date:2017-05-24

CharacteristicofMolecularEvolutionforLiliumpumilumRedoutéonSoutheastoftheQinghai-TibetanPlateauusingnrDNAITSandcpDNApetB/petDSequenceAnalysis

JIANG Fu-Juan1,3TANG Nan1,2*TANG Dao-Cheng1JU Xiu-Ting1SUN Jing-Qing4

(1.Plateau Flower Research Center of Qinghai University/The key laboratory of landscape plants of Qinghai Province,Xining 810016；2.State Key Laboratory Breeding Base-Key Laboratory of Qinghai Province for Plateau Crop Germplasm Innovation and Utilization,Xining 810016；3.Datong County Forestry Bureau,Datong 810100；4.Xining People’s Park,Xining 810008)

In this study, total DNA was extracted fromLiliumpumilumon southeast of the Qinghai-Tibetan Plateau using modified CTAB method. Using genome DNA as template, nrDNA ITS and cpDNA petB/petD regions were amplified, purified and sequenced. By sequence alignment, it was known that length of nrDNA ITS sequence was 696 bp, of which 4 variable sites with a percentage of 0.72% were found., The G+C content of the ITS sequence was 60.4% and 7 haplotypes were produced. The length of cpDNA petB/petD sequence was 616 bp, of which 1 was variable sites with a percentage of 0.16% was found. The G+C content of the sequence was 34.6% and 2 haplotypes were found. The petB/petD region ofL.pumilumwas more conserved than ITS sequences and evolved more slowly. The present distribution range ofL.pumilumhas probably experienced range expansion by the haplotype analysis of mismatch distribution and neutral test, and AMOVA analysis showed that the genetic variation ofL.pumilummainly existed within populations. TheNST>GST(P>0.01)further showed that there was no significant phylogeographic structure of genetic variation inL.pumilum. Therefore, the nrDNA ITS sequence ofL.pumilumwas more suitable for phylogeographic study of this species.

southeastern of Qinghai-Tibetan Plateau;Liliumpumilum;ITS;petB/petD;molecular evolution

國家自然科學基金項目31660582(Genetic mapping of resistance gene for tulip breaking virus)；青海省“高端創(chuàng)新人才千人計劃”；中國科學院“西部之光”人才培養(yǎng)計劃

蔣福娟(1986—)，女，碩士研究生，助理工程師，主要從事園林植物遺傳育種研究工作。

* 通信作者：E-mail：natasha_tn@hotmail.com

2017-05-24

* Corresponding author：E-mail：natasha_tn@hotmail.com

Q949.71+8.23

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2018.01.014

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4．本刊參考文獻采用順序編碼制。請作者主要引用國內外同行發(fā)表的相關論文。未公開發(fā)表的資料請勿列入，但可以腳標形式標注,請參照本樣刊。

《植物研究》編輯部