核桃JrGRAS2基因響應(yīng)熱脅迫的表達(dá)及功能分析

粟莉圓 李孝哲 陳淑雯 張芳芳 趙婷婷 楊桂燕*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院山陽核桃板栗試驗示范站，楊凌 712100； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院陜西省經(jīng)濟(jì)植物資源開發(fā)利用重點實驗室，楊凌 712100)

核桃JrGRAS2基因響應(yīng)熱脅迫的表達(dá)及功能分析

粟莉圓1,2李孝哲1陳淑雯1,2張芳芳1,2趙婷婷1,2楊桂燕1,2*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院山陽核桃板栗試驗示范站，楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院陜西省經(jīng)濟(jì)植物資源開發(fā)利用重點實驗室，楊凌 712100)

GRAS轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)逆境中起重要作用。為更好的了解核桃(Juglansregia)在逆境脅迫下的適應(yīng)機制，本研究從‘香玲’核桃轉(zhuǎn)錄組中克隆獲得一條GRAS基因(命名為JrGRAS2)，對其在不同高溫脅迫下的表達(dá)進(jìn)行分析，并將該基因插入酵母表達(dá)載體pYES2中構(gòu)建重組載體pYES2-JrGRAS2，將pYES2-JrGRAS2轉(zhuǎn)入釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)INVSCI，同時以轉(zhuǎn)化pYES2的重組酵母作為陰性對照，在酵母表達(dá)系統(tǒng)中研究該基因的抗熱脅迫功能。結(jié)果顯示，該基因開放讀碼框(ORF)全長1 296 bp，擬推導(dǎo)的蛋白分子量為47 405.83 Da，含有氨基酸數(shù)為431，理論等電點為5.66。在熱脅迫下，JrGRAS2基因被顯著誘導(dǎo)，特別是在36℃脅迫0.5 h的莖內(nèi)，其表達(dá)相對于對照被上調(diào)了335.5倍。對兩種酵母進(jìn)行熱脅迫，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)JrGRAS2基因酵母表現(xiàn)出較對照更高的生存活性。表明JrGRAS2基因具有響應(yīng)熱脅迫的能力，且能提高酵母的抗性，JrGRAS2基因可作為核桃逆境應(yīng)答的重要候選基因。

核桃；熱脅迫；GRAS轉(zhuǎn)錄因子；表達(dá)分析；酵母表達(dá)系統(tǒng)

GRAS是近年來發(fā)現(xiàn)的一種高等植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，命名來源于其功能成員GAI(gibberellicacid insensitive)、RGA(repressor of GA1-3 mutant)和SCR(scarecrow)[1]。其特征是含有一個由氨基酸和天門冬氨酸組成的高度保守的VHIID區(qū)域，在VHIID區(qū)域的兩側(cè)還各含有一個富含亮氨酸的重復(fù)序列LZ[2]。目前，已經(jīng)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)基因組中鑒定得到了33個GRAS家族基因，如d8、rNT、PAT1、SCL13和SCL14等基因[1,3]。在其他一些草本植物中也陸續(xù)有GRAS家族基因的報道，如番茄(Solanumlycopersicum)、水稻(Oryzasativa)、葡萄(Vitisvinifera)等[4～6]。

植物中GRAS蛋白的數(shù)量眾多、功能多樣，是生長發(fā)育過程的關(guān)鍵調(diào)控蛋白。如，赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、根的發(fā)育、根瘤和菌根的形成等[1～2,7～8]。GRAS家族基因也參與植物對各種環(huán)境脅迫的應(yīng)答，如在擬南芥、水稻、煙草(Nicotianatabacum)等多種植物中發(fā)現(xiàn)了響應(yīng)低溫、干旱、滲透和激素等脅迫的GRAS家族基因[9～11]。但目前關(guān)于GRAS家族基因的研究主要集中在草本模式植物中，而對木本植物GRAS轉(zhuǎn)錄因子的研究較少。特別是對GRAS家族中大多數(shù)分支的具體作用機制尚不完全清楚。

核桃(Juglansregia)屬多年生落葉喬木，是世界四大堅果之一，也是我國主要經(jīng)濟(jì)樹種之一。但由于近年來全球環(huán)境的變化，環(huán)境因子特別是西北地區(qū)夏秋核桃成熟期嚴(yán)重的高溫干旱等氣候現(xiàn)象，已成為影響核桃發(fā)展的重要限制因素之一。因此研究核桃的抗逆機理將有利于為核桃抗高溫脅迫等抗逆調(diào)控提供一定的指導(dǎo)作用。然而，目前國內(nèi)外對核桃的研究主要集中在核桃品質(zhì)鑒定、品種選育及化學(xué)成分分析等方面，從分子水平探討核桃抗逆調(diào)控方式仍屬相對空白的領(lǐng)域。本研究我們對核桃的一條GRAS基因(JrGRAS2)進(jìn)行表達(dá)分析，并利用酵母表達(dá)系統(tǒng)對JrGRAS2基因在酵母中的抗熱功能進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 JrGRAS2基因的克隆與分析

以“GRAS”為關(guān)鍵詞在‘香玲’核桃轉(zhuǎn)錄組中查找相關(guān)基因，經(jīng)Blast比對選取其中1條GRAS基因(命名為JrGRAS2)進(jìn)行分析。用ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)確定JrGRAS2基因開放讀碼框(ORF)，再根據(jù)ORF兩端序列設(shè)計引物JrGRAS2-F和JrGRAS2-R(表1)，進(jìn)行PCR擴增。產(chǎn)物經(jīng)回收純化后與pMD-18-T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽性克隆擴大培養(yǎng)進(jìn)行菌液PCR驗證，對可獲得目的片段的克隆測序。利用Expasy ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對確認(rèn)的JrGRAS2基因序列特征進(jìn)行分析。利用BLASTP(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)進(jìn)行序列同源性搜索；利用Clustal 3.0軟件對不同物種的GRAS基因進(jìn)行多序列比對和進(jìn)化分析。

1.2 JrGRAS2基因的表達(dá)分析

對培養(yǎng)于相同條件下的2年生‘香玲’核桃嫁接苗分別進(jìn)行28、32、36、40、44℃處理0、0.5、1 h，分別提取根、莖、葉總RNA進(jìn)行表達(dá)分析，脅迫0 h為對照。每個處理設(shè)置3次重復(fù)。RNA提取采用CTAB方法[12]進(jìn)行，RNA經(jīng)DNA消化酶處理后采用PrimeScriptTMRT reagent Kit(CWBIO)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋10倍后用作qRT-PCR的模板。qRT-PCR使用SYBR Green Real time PCR Master mix(CWBIO，康為世紀(jì)，中國)進(jìn)行，內(nèi)參基因為核桃18S rRNA(HE574850)基因[12]。所用引物如表1所示，JrGRAS2定量引物為DL-F和DL-R。定量反應(yīng)所用儀器為Applied Biosystems生產(chǎn)的StepOneTMReal-Time PCR System。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性12 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，45個循環(huán)；81℃讀板1 s，每個樣品重復(fù)3次。采用2-△△Ct法對定量結(jié)果進(jìn)行相對分析[13]。

1.3 酵母表達(dá)載體構(gòu)建及脅迫分析

根據(jù)JrGRAS2基因序列特征及pYES2酶切位點特性設(shè)計酵母表達(dá)載體引物JrGRAS2-JM-F和JrGRAS2-JM-R(表1)。通過PCR反應(yīng)獲得含有酶切位點的JrGRAS2序列，經(jīng)酶切純化后與pYES2連接獲得重組載體pYES2-JrGRAS2。將pYES2-JrGRAS2和空pYES2載體分別轉(zhuǎn)入酵母INVSC1中[12]，分別記為INVSC1(pYES2-JrGRAS2)和INVSC1(pYES2)，后者為對照。本研究所用工具酶均為寶生物(Takara)公司產(chǎn)品。

表1 本研究所用引物

注：正體下劃線序列為KpnⅠ酶切位點；斜體下劃線序列為XbaⅠ酶切位點

Note:The normal underlined sequence is theKpnⅠ restriction site,the italic underlined sequence isXbaⅠ restriction site.

分別挑取INVSC1(pYES2-JrGRAS2)和INVSC1(pYES2)單克隆置于含2%葡萄糖的SC-Ura液體培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)16 h，收集酵母菌體重懸于含2%半乳糖的SC-Ura液體培養(yǎng)基中，且調(diào)整OD600=0.5，30℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)至OD600=1.8，分別收集菌體進(jìn)行脅迫處理。

酵母熱脅迫生長恢復(fù)力比較[12]：將收集的INVSC1(pYES2-JrGRAS2)和INVSC1(pYES2)分別在28℃、30℃(對照)、32、36、40、44、53℃下處理2 h，然后對菌液作10×稀釋，再分別取2 μL點在含2%葡萄糖的SC-Ura固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)分別培養(yǎng)48 h(28～36℃)或52 h(40～53℃)，觀察酵母生長情況。

酵母熱脅迫成活率測定[12]：取5 mL收集的菌體分別在28℃、30℃(對照)、32、36、40、44、53℃水浴處理1 h，在30℃恢復(fù)生長20 h，測定OD600。每個實驗重復(fù)3次。數(shù)據(jù)使用SPSS軟件(SPSS,Chicago,Illinois,USA)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 JrGRAS2基因全長cDNA的獲得及序列分析

通過查找核桃轉(zhuǎn)錄組獲得JrGRAS2基因，根據(jù)獲得的cDNA序列設(shè)計引物JrGRAS2-F/R進(jìn)行PCR驗證，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)JrGRAS2基因ORF長1 269 bp(圖1)，擬推導(dǎo)的蛋白分子量為47 405.83 Da，含有氨基酸數(shù)為431，理論等電點為5.66。BLAST分析發(fā)現(xiàn)該基因具有保守域，表明該蛋白為GRAS蛋白。經(jīng)BLASTP同源搜索及TAIR網(wǎng)查找獲得不同植物的GRAS蛋白，與JrGRAS2基因翻譯的蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)JrGRAS2與龍眼(Dimocarpuslongan)DlGRAS進(jìn)化關(guān)系較近(圖2)。

圖1 JrGRAS2基因序列Fig.1 The JrGRAS2 gene sequence

圖2 JrGRAS2蛋白的進(jìn)化分析 進(jìn)化樹中蛋白名稱后括號內(nèi)為蛋白GeneBank登錄號；標(biāo)尺表示蛋白之間的差異性；分支上數(shù)值表示同一分支上蛋白的相關(guān)性 PpGRAS.碧桃；PmGRAS.梅；TcGRAS.可可；JcGRAS.麻瘋樹；CoGRAS.長種黃麻；MdGRAS.蘋果；CcGRAS.圓果種黃麻；DlGRAS.龍眼；AtGRAS1、AtGRAS2、AtGRAS3. 三個擬南芥GRASFig.2 Phylogenetic analysis of JrGRAS2 protein The symbol behind the protein in the brackets were GeneBank numbers; The scaleplate means the difference of proteins; The numerical value means the correlation of proteins in a same branch PpGRAS. Prunus persica；PmGRAS. Prunus mume; TcGRAS. Theobroma cacao; cGRAS. Jatropha curcas; CoGRAS. Corchorus olitorius; MdGRAS. Malus domestica; CcGRAS. Orchorus capsulari; DlGRAS. Dimocarpus longan; AtGRAS1,AtGRAS2,AtGRAS3. Three GRAS from Arabidopsis thaliana

2.2 JrGRAS2基因在不同溫度處理下的表達(dá)

對核桃進(jìn)行不同溫度處理后，提取根、莖、葉的總RNA分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA后用作qRT-PCR的模板。結(jié)果顯示，JrGRAS2基因在28～44℃脅迫0.5和1.0 h時，在根、莖、葉中均被明顯誘導(dǎo)(圖3)。脅迫0.5 h，JrGRAS2基因在根中的表達(dá)相對莖和葉較低，為對照的1.9～11.9倍，葉中為2.5～39.1倍，其中36℃脅迫0.5 h，JrGRAS2基因在莖中的表達(dá)被上調(diào)最大，為對照的335.5倍(圖3A)。脅迫1 h，JrGRAS2基因在根、莖、葉中的變化趨勢相似，即，隨著脅迫溫度升高，其表達(dá)也逐漸上升，至40℃達(dá)到最大值，在44℃時又有所下降。40℃處理下，JrGRAS2基因在根、莖、葉中的表達(dá)分別為對照的53.4、81.0、146.0倍。在根中的最低表達(dá)出現(xiàn)在28℃，為對照的1.5倍；莖和葉中最低值均出現(xiàn)在44℃，分別為對照的1.5和2.1倍(圖3B)。

2.3 高溫脅迫下INVSC1(pYES2-JrGRAS2)和INVSC1(pYES2)的抗熱能力

挑取INVSC1(pYES2-JrGRAS2)和INVSC1(pYES2)單克隆在相同條件下培養(yǎng)至相同的OD600，對其進(jìn)行不同溫度處理后經(jīng)不同稀釋點點于培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察酵母的生長情況。結(jié)果顯示，在非脅迫條件下，INVSC1(pYES2-JrGRAS2)和INVSC1(pYES2)的生長沒有明顯區(qū)別，但在熱脅迫處理后(36～53℃)，INVSC1(pYES2-JrGRAS2)在稀釋10 000倍后仍能較好的生長，而INVSC1(pYES2)沒有觀察到酵母生長(圖4)，說明熱脅迫處理影響了酵母的生長活性。對兩種酵母進(jìn)行不同溫度處理后進(jìn)行培養(yǎng)，通過比較其OD600分析其抗熱性。結(jié)果顯示隨著脅迫溫度增加，OD600逐漸變小，但I(xiàn)NVSC1(pYES2-JrGRAS2)一直高于INVSC1(pYES2)，且當(dāng)溫度大于36℃時差異顯著(圖5)，表明JrGRAS2基因的表達(dá)顯著改善了酵母的抗熱性。

圖3 JrGRAS2基因在不同溫度脅迫下的表達(dá)水平 A. 0.5 h脅迫下的表達(dá)；B. 1.0 h脅迫下的表達(dá)Fig.3 The expression level of JrGRAS2 gene under different high temperature stresses A. The expression under 0.5 h treatment; B. The expression under 1.0 h treatment

圖4 轉(zhuǎn)JrGRAS2基因酵母在熱脅迫下的抗性Fig.4 The heat stress tolerance of JrGRAS2 gene transgenic yeasts

圖5 轉(zhuǎn)JrGRAS2基因酵母在熱脅迫下的OD600Fig.5 The heat tolerance showed by OD600 of JrGRAS2 transgenic yeasts under different temperature treatments

3 討論

核桃是重要木本油料植物，是我國扶貧攻堅項目的重要樹種，核桃產(chǎn)業(yè)在推動區(qū)域經(jīng)濟(jì)上具有重要作用。而核桃產(chǎn)業(yè)的健康快速發(fā)展與核桃的產(chǎn)量和質(zhì)量息息相關(guān)。但由于全球氣候變化嚴(yán)重制約了我國西北地區(qū)核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，選育抗逆優(yōu)良核桃品種、掌握核桃抗逆適應(yīng)機制，特別是異常溫度下的調(diào)控機制對深入了解核桃的適應(yīng)性具有重要指導(dǎo)作用[14]。GRAS是植物中新發(fā)現(xiàn)的一類重要轉(zhuǎn)錄因子，具有多重功能。研究表明，擬南芥GRAS轉(zhuǎn)錄因子與滲透脅迫調(diào)控相關(guān)[9]，水稻OsGRAS23基因與干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)[10]，煙草NtGRAS1基因也屬于脅迫誘導(dǎo)型蛋白[11]。本研究我們從核桃獲得JrGRAS2基因，該基因與擬南芥AT1G63100、AT1G66350、AT2G04890等的進(jìn)化關(guān)系較近，其中AT1G63100與赤霉素(GA)代謝途徑相關(guān)[15]，AT1G66350與根系發(fā)生相關(guān)[16]，AT2G04890與光敏色素A信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)[17]，而這些功能又與逆境響應(yīng)具有聯(lián)系，因此，推測JrGRAS2基因可能參與逆境響應(yīng)，且在行使功能時也可能涉及赤霉素信號通路。

對核桃進(jìn)行不同的溫度處理，分析JrGRAS2基因在熱脅迫下的表達(dá)，結(jié)果顯示，JrGRAS2基因在不同溫度不同時間處理下，在根、莖、葉中均能被明顯誘導(dǎo)，表明該基因可能參與核桃的熱脅迫響應(yīng)調(diào)控。這與其他一些報道相似，如，周蓮潔等人分析鹽穗木(Halostachyscaspica)GRAS基因在鹽脅迫下的表達(dá)推測該基因可能與鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)[18]；石瑞等人表明佛手(Citrusmedicavar.sarcodactylis)GRAS轉(zhuǎn)錄因子在低溫脅迫下被誘導(dǎo)，推測該基因與耐寒調(diào)控相關(guān)[19]；龍眼DlGRAS4和DlGRAS54主要在發(fā)育的中晚期起作用，其表達(dá)在外源赤霉素處理后明顯上調(diào)，說明DlGRAS4和DlGRAS54可能與赤霉素信號響應(yīng)相關(guān)[20]。

酵母表達(dá)系統(tǒng)是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究不可缺少的重要手段，有不少基因的功能通過酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了快速驗證，為后續(xù)開展深入研究打下了良好的基礎(chǔ)。如，擬南芥AtHKT1基因[21]、檉柳TheIF1A基因[22]、核桃JrWRKY2基因[12]等。因此，本研究采用酵母表達(dá)系統(tǒng)對JrGRAS2基因在熱脅迫下的功能進(jìn)行分析。即，將該基因構(gòu)建酵母表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入酵母中，通過與對照酵母在熱脅迫下的生長比較分析其抗熱能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低于32℃情況下(28～32℃，酵母最適生長溫度為30℃)JrGRAS2轉(zhuǎn)基因酵母與對照酵母稀釋點點后的生長及OD600均無明顯區(qū)別；但當(dāng)溫度不低于36℃情況下，JrGRAS2轉(zhuǎn)基因酵母在稀釋10 000后能有較好的生長，對照酵母生長克隆較少，特別是在52℃脅迫下，差異更為明顯，且JrGRAS2轉(zhuǎn)基因酵母與對照酵母的OD600值差異顯著(圖4～5)，表明JrGRAS2基因在酵母中的表達(dá)能改善酵母應(yīng)對熱脅迫的能力。這與TheIF1A、JrWRKY2、AtHKT1等基因在酵母表達(dá)系統(tǒng)中改善抗逆能力[13,21～22]的表現(xiàn)一致，說明JrGRAS2基因確實與熱脅迫調(diào)控有關(guān)。這為進(jìn)一步研究JrGRAS2的抗逆機理奠定了基礎(chǔ)。在后續(xù)研究中，將對JrGRAS2基因在植物表達(dá)系統(tǒng)中的抗逆能力進(jìn)行分析，以期全面理解JrGRAS2基因的抗逆功能。

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Fundamental Research Funds for the Central Universities(2452016057/2452015171);China Postdoctoral Science Foundation Project(2016M590979);The Program of Innovative Entrepreneurship Training Programs for Northwest Agriculture & Forestry University Students(1201610712031)

introduction：SU Li-Yuan(1996—),female,the main research area is forest genetic breeding.

date:2017-05-24

ExpressionandFunctionAnalysisofWalnutJrGRAS2GeneunderHeatStress

SU Li-Yuan1,2LI Xiao-Zhe1CHEN Shu-Wen1,2ZHANG Fang-Fang1,2ZHAO Ting-Ting1,2YANG Gui-Yan1,2*

(1.Walnut and Chestnut Experiment Station of Shanyang,College of Forestry,Northwest A&F University,Yangling 712100；2.Key Laboratory of Economic Plant Resources Development and Utilization in Shaanxi Province,College of Forestry,Northwest A&F University,Yangling 712100)

TheGRAStranscription factor is important for plant response to abiotic stress. To well understand the adaptive mechanism to adverse environment of walnut tree, aGRASgene was cloned from the transcriptome ofJuglansregia(Named asJrGRAS2). The expression ofJrGRAS2 was analyzed under heat stress, andJrGRAS2 was inserted into the yeast expression vector pYES2 for constructing recombinant plasmidpYES2-JrGRAS2, which was transformed into aSaccharomycescerevisiaestrain(INVSCI). The yeast transformed with empty pYES2 was used as a negative control. The yeast expression system was used for analysis the heat stress tolerance. The full length open reading frame(ORF) ofJrGRAS2 was 1 296 bp, the deduced protein was 47 405.83 Da with 431 amino acids, and the theoretical isoelectric point(pI) was 5.66. Under heat stress,JrGRAS2 was highly induced, especially exposed to 36℃ for 0.5 h in the stems, it was induced to 335.5-fold of control. When both recombinant yeasts were treated with 53℃, theJrGRAS2 expressed yeast displayed higher vitality and survival rate than the control yeast. Therefore,JrGRAS2 gene could effectively response to heat stress and improve heat tolerance of transgenic yeasts,JrGRAS2 may be an important candidate gene for walnut response to adverse stimulus.

Juglansregia;heat stress;GRAS transcription factor;expression analysis;yeast expression system

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(2452016057/2452015171)；中國博士后科學(xué)基金面上資助項目(2016M590979)；西北農(nóng)林科技大學(xué)校重點大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(1201610712031)

粟莉圓(1996—)，女，本科生，主要從事林木遺傳育種研究。

* 通信作者：E-mail：yangguiyan@yahoo.com

2017-05-24

* Corresponding author：E-mail：yangguiyan@yahoo.com

Q943.2

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2018.01.015