基于SLAF-seq簡化基因組技術(shù)的沙冬青SNP位點(diǎn)開發(fā)及遺傳分析

段義忠 王建武 杜忠毓 亢福仁

(1.榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，榆林 719000； 2.陜西省陜北生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，榆林 719000)

基于SLAF-seq簡化基因組技術(shù)的沙冬青SNP位點(diǎn)開發(fā)及遺傳分析

段義忠1,2王建武1,2杜忠毓1亢福仁1,2

(1.榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，榆林 719000；2.陜西省陜北生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，榆林 719000)

選取分布在內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅10個地點(diǎn)的沙冬青個體，用SLAF-seq簡化基因組技術(shù)進(jìn)行測序。以大豆基因組為參照，通過生物信息學(xué)分析進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案的系統(tǒng)設(shè)計(jì)，篩選特異長度的DNA片斷，構(gòu)建SLAF-seq文庫，并通過高通量測序的方式獲得海量序列，再通過軟件分析比對，獲得多態(tài)性SLAF標(biāo)簽，最后在多態(tài)性SLAF標(biāo)簽上開發(fā)大量特異性SNP位點(diǎn)。結(jié)果共獲得374 265個SLAF標(biāo)簽，其中多態(tài)性SLAF標(biāo)簽56 295個。通過序列分析，共開發(fā)得到127 278個SNP。對所有的SNP根據(jù)完整度>0.5，MAF>0.05過濾，共得到102 025個高一致性的群體SNP?；谶^濾后的SNP，運(yùn)用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對10份沙冬青個體完成系統(tǒng)進(jìn)化樹、群體結(jié)構(gòu)、PCA分析，從基因組水平揭示不同個體之間的遺傳分化關(guān)系。結(jié)果表明，通過群體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)這10個地點(diǎn)的沙冬青都來源于同一祖先，但由于地理位置的影響使得這10個地點(diǎn)的沙冬青在生長發(fā)育過程中發(fā)生了遺傳分化。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)分布在內(nèi)蒙古的沙冬青具有較近的親緣關(guān)系，甘肅和寧夏的沙冬青有較近的親緣關(guān)系。

蒙古沙冬青；SLAF-seq；SNP；遺傳分化

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的基因組被成功的測定出來。簡化基因組測序(Reduced-representation sequencing)是在高通量測序基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種利用酶切技術(shù)、序列捕獲芯片技術(shù)或其他實(shí)驗(yàn)手段降低物種基因組復(fù)雜程度,針對基因組特定區(qū)域進(jìn)行測序,進(jìn)而反映部分基因組序列結(jié)構(gòu)信息的測序技術(shù)。目前發(fā)展起來的簡化基因組測序有：復(fù)雜度降低的多態(tài)序列(Complexity reduction of polymorphic sequences,CRoPS)測序；限制性酶切位點(diǎn)相關(guān)的DNA(Restriction-site associated DNA,RAD)測序；基因分型測序(Genotyping by sequencing,GBS)[1]。特異性位點(diǎn)擴(kuò)增片段測序技術(shù)簡稱SLAF-seq(specific-locus amplified fragment sequencing)，就是基于高通量測序技術(shù)發(fā)展起來的一種簡化基因組深度測序技術(shù)。SLAF-seq技術(shù)利用生物信息學(xué)方法，對目標(biāo)物種的參考基因組進(jìn)行系統(tǒng)分析，設(shè)計(jì)一個合適的酶切方案，構(gòu)建SLAF-seq文庫，篩選出特異性長度片段，再應(yīng)用高通量測序技術(shù)獲得高通量標(biāo)簽序列，然后對數(shù)據(jù)分析，獲取滿足要求的SLAF片段。這些片段可以充分代表全基因組的序列特征信息，依據(jù)這些片段可以開發(fā)出大量的分子標(biāo)記特別是單核苷酸多態(tài)(SNP)。SLAF測序技術(shù)具有很多的優(yōu)點(diǎn)，如高通量、高精度、短周期、多性狀并行研究等[2]。該技術(shù)已被運(yùn)用于遺傳定位、高密度遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及不同個體間的多態(tài)性分析、系統(tǒng)進(jìn)化和種質(zhì)資源鑒定等。

沙冬青屬(AmmopiptanthusCheng F.)為寡種屬，全世界僅有兩種：即沙冬青(Ammpiptanthusmongolicus(Maxim.) Cheng f.)和矮沙冬青(Ammpiptanthusnanus(M.Pop.) Cheng f.)。矮沙冬青在我國僅局限于新疆西南部克孜勒蘇自治州烏恰縣境內(nèi)的康蘇、托云和阿克陶等地[3]。沙冬青又名蒙古沙冬青或大沙冬青，豆科常綠灌木，高1～2 m，多分枝。三出復(fù)葉，稀單葉，花黃色，為鄂爾多斯高原和阿拉善荒漠區(qū)所特有的建群植物，是亞洲中部荒漠地區(qū)特有的常綠闊葉灌木[4]，也是迄今為止我國溫帶荒漠的惟一珍稀常綠闊葉灌木。沙冬青主要分布于內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅，生于海拔1 000～1 200 m低山帶的山前沖積、淤積平原、山間盆地或干谷中。沙冬青的分布區(qū)為大陸性氣候，春季干燥少雨，多大風(fēng)，夏季溫度高而冬季溫度低。沙冬青是古老的第三紀(jì)殘遺種，被列為國家三級瀕危種和內(nèi)蒙古自治區(qū)一級重點(diǎn)保護(hù)植物[5]。沙冬青在形態(tài)學(xué)、抗逆生理、生態(tài)學(xué)及系統(tǒng)發(fā)育等方面做了大量研究工作[6～10]。作為沙生植物的一種，沙冬青是極耐旱的常綠灌木，耐鹽堿、耐貧瘠，對水分虧缺、極端高溫和霜凍低溫、風(fēng)蝕沙埋的生長環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)性和忍耐性[11]，這些優(yōu)良的生理特性使得沙冬青成為我國西北防風(fēng)固沙的優(yōu)良灌木，對改善我國的西北生態(tài)環(huán)境及防止荒漠侵移具有很大的意義[12]。沙冬青在藥用等方面也有很高的利用價值，其枝葉人藥，具有怯風(fēng)濕、舒筋活血散瘀及止痛的作用，還可用于凍傷、慢風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛的治療。但由于自然歷史原因和不節(jié)制的人類活動，例如過度放牧、濫砍濫伐致使沙冬青種群數(shù)量銳減、分布范圍縮小，當(dāng)前沙冬青處于瀕危狀態(tài)。因此對其開展瀕危機(jī)制研究，不僅對探明我國西北干旱地區(qū)物種形成機(jī)制具有重要的科學(xué)意義，而且對維持西北干旱區(qū)脆弱生態(tài)系統(tǒng)具有特殊的生態(tài)意義。

沙冬青屬為中亞荒漠地區(qū)唯一的超旱生常綠灌木樹種，為亞洲荒漠中部荒漠區(qū)喀什—阿拉善間斷分布特有屬，同時也是中亞荒漠區(qū)東部亞區(qū)13個特有或近特有屬典型代表，其常綠闊葉被認(rèn)為是第三紀(jì)孑遺類群的祖先特征，對研究旱生植物的系統(tǒng)發(fā)育、古植物區(qū)系、古地理及第三紀(jì)氣候特征，特別是研究亞洲中部荒漠植被的起源和形成具有重要的科學(xué)價值。本試驗(yàn)利用SLAF-seq技術(shù)，以分布在內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅的10個地點(diǎn)的沙冬青個體為材料，獲取大量多態(tài)性SLAF標(biāo)簽，進(jìn)而開發(fā)一批特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高的群體SNP位點(diǎn)?；陂_發(fā)出的SNP位點(diǎn)，運(yùn)用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對10個不同地點(diǎn)的沙冬青完成系統(tǒng)進(jìn)化樹、群體結(jié)構(gòu)、PCA分析，從基因組水平揭示不同個體之間的遺傳分化關(guān)系。旨在通過分析沙冬青不同個體間的遺傳分化，為進(jìn)一步探討沙冬青瀕危原因提供證據(jù)，為沙冬青資源保護(hù)策略的制定提供合理的科學(xué)支撐。為充分了解該物種的進(jìn)化歷史、群體遺傳結(jié)構(gòu)以及它的系統(tǒng)分類學(xué)地位提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究采用的試驗(yàn)材料來源于分布在內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅的10個地點(diǎn)沙冬青個體，其中來源于內(nèi)蒙古材料5份(敖倫布拉格ALBLG，冬青湖DQH，磴口桃司兔DKTST，千里溝QLG，阿拉善ALS)，來源于寧夏的材料4份(兵溝BG，白芨灘BJT，扁擔(dān)溝BDG，紅衛(wèi)HW)，來源于甘肅的材料1份(紅砂硯HSY)，具體分布地點(diǎn)見表1。

表1 沙冬青采樣地點(diǎn)

1.2 基因組DNA的制備

本試驗(yàn)用3×CTAB法提取分布在10個地點(diǎn)沙冬青的總DNA。用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量，以確保所提基因組DNA質(zhì)量達(dá)到建庫要求，Nanodrop檢測DNA的濃度。

1.3 酶切方案的設(shè)計(jì)

由于目前尚無沙冬青基因組序列信息發(fā)布，根據(jù)沙冬青基因組大小及GC含量等信息，最終選取其近緣種大豆(Glycine max)作為參考基因組進(jìn)行酶切預(yù)測。參考物種信息為大豆基因組，其NCBI注冊號為：PRJNA19861[13]，組裝出的基因組大小為953.34 Mb，GC含量為34.86%。利用自主研發(fā)的酶切預(yù)測軟件對參考基因組進(jìn)行酶切預(yù)測，選擇最適酶切方案，選擇原則首先位于重復(fù)序列的酶切片段比例盡可能低，其次酶切片段盡量均勻分布在基因組上，再次產(chǎn)生的酶切片段長度與具體實(shí)驗(yàn)體系的符合程度，最后試驗(yàn)最終獲得酶切片段(SLAF標(biāo)簽)數(shù)要達(dá)到預(yù)期標(biāo)簽數(shù)的要求[14]。

1.4 Illumina HiSeq測序及產(chǎn)出數(shù)據(jù)的質(zhì)量分析

根據(jù)選定的最適酶切方案，對檢測合格的各個地點(diǎn)的沙冬青個體基因DNA分別進(jìn)行酶切。對得到的酶切片段(SLAF標(biāo)簽)進(jìn)行3′端加A處理、連接Dual-index測序接頭，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化、混樣、切膠選取試驗(yàn)所需的目的片段，文庫質(zhì)檢合格后用Illumina HiSeq進(jìn)行測序。為評估酶切實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，選用水稻日本晴(Oryzasativassp.japonica)作為對照(Control)進(jìn)行測序。對測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行識別、過濾、質(zhì)檢、評估等分析，獲取各個個體的序列(reads)。

1.5 SLAF標(biāo)簽和SNP標(biāo)記的開發(fā)

利用Dual-index對測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行識別，得到各個個體的reads(分離的等位基因)。過濾測序reads的接頭后，進(jìn)行測序質(zhì)量和數(shù)據(jù)量的評估。通過Control數(shù)據(jù)評估RsaI+HaeIII的酶切效率，以此判斷實(shí)驗(yàn)過程的準(zhǔn)確性和有效性。本試驗(yàn)測序產(chǎn)生reads來源于都是不同地點(diǎn)的沙冬青在同一限制性內(nèi)切酶的作用下產(chǎn)生的長度相同或相近的酶切片段，根據(jù)各個序列的相似度將10個個體的reads進(jìn)行聚類，聚類到一起的reads來源于同一個SLAF標(biāo)簽。同一SLAF標(biāo)簽在不同個體間的序列相似度遠(yuǎn)高于不同SLAF標(biāo)簽間的相似度；在同一個SLAF標(biāo)簽中存在不同個體間序列的差異(即有多態(tài)性)，即可定義為多態(tài)性SLAF標(biāo)簽。以每個SLAF標(biāo)簽中深度最高的序列類型作為參考序列開發(fā)全基因組范圍的核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記，對開發(fā)出的SNP根據(jù)完整度>0.5，MAF>0.05的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，最后利用篩選出的具有代表性的高質(zhì)量SNP進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析、遺傳結(jié)構(gòu)分析和主成分分析(PCA)。

圖1 沙冬青測序堿基分布Fig.1 The sequence base distribution of A.mongolicus

2 結(jié)果與分析

2.1 建庫評估

SLAF-seq測序reads為基因組DNA的酶切片段，其堿基分布會受到酶切位點(diǎn)和PCR擴(kuò)增的影響，測序reads的前2個堿基會呈現(xiàn)與酶切位點(diǎn)一致的堿基分離，后續(xù)堿基分布會呈現(xiàn)不同程度的波動，測序堿基分布情況見圖1。

對大豆參考基因組進(jìn)行電子酶切預(yù)測，根據(jù)酶切方案選擇原則，確定限制性內(nèi)切酶切組合為RsaⅠ+HaeⅢ，酶切片段長度在364～414 bp的序列定義為SLAF標(biāo)簽，預(yù)測可得到132 516個SLAF標(biāo)簽。通過對Control(水稻日本晴)測序數(shù)據(jù)的評估監(jiān)控實(shí)驗(yàn)過程是否正常，來確定酶切方案實(shí)施的有效性。本實(shí)驗(yàn)中，對照基因組水稻測序獲得0.32Mreads的數(shù)據(jù)量，將水稻日本晴的測序序列與其參考基因組進(jìn)行對比。對比結(jié)果顯示本次實(shí)驗(yàn)雙端比對效率(一條序列兩端在參考基因組上的比對跨度介于50 bp～1 kB的reads占總reads的比例)在95.25%，比對效率基本正常。酶切效率是評價簡化基因組實(shí)驗(yàn)是否成功的一個關(guān)鍵指標(biāo)。但基因組上的復(fù)雜結(jié)構(gòu)區(qū)域(如環(huán)狀結(jié)構(gòu)域、連續(xù)酶切位點(diǎn)等)、基因組DNA個體純度較低、酶切時間不足等因素都可能影響限制性內(nèi)切酶的活性，導(dǎo)致部分酶切位點(diǎn)未被切開。通過統(tǒng)計(jì)測序reads插入片段中殘留酶切位點(diǎn)的比例，越高的統(tǒng)計(jì)比例結(jié)果代表著越好的酶切效率[15]。本試驗(yàn)中水稻對照組的酶切效率為100.00%，表明酶切反應(yīng)正常。95.25%的雙端比對效率和100%的酶切效率說明SLAF建庫正常。

2.2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與評估

為保證分析質(zhì)量，采用讀長100 bp×2作為后續(xù)的數(shù)據(jù)評估和分析數(shù)據(jù)。通常在高通量測序中用測序質(zhì)量值(Q)來評估單堿基錯誤率，測序質(zhì)量值越高對應(yīng)的堿基測序錯誤率越低。如果某堿基測序出錯的概率為0.001，則該堿基的質(zhì)量值Q應(yīng)該為30。對10個地點(diǎn)個體的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)見表2，包括reads數(shù)量、Q30和GC含量。共獲得31.7個百萬序列(Mreads)數(shù)據(jù)，測序平均Q30為91.19%，平均GC含量為40.40%。由于所測序列的Q30數(shù)據(jù)較高，表明堿基出錯率很低，表明測序結(jié)果可靠。

2.3 SLAF標(biāo)簽與SNP標(biāo)記的鑒定

通過序列分析,從10個地點(diǎn)的沙冬青基因組中共獲得了374 265個SLAF標(biāo)簽(表3)。標(biāo)簽的平均測序深度為74.74X，鑒定到多態(tài)性SLAF標(biāo)簽有56 295個，通過對得到的多態(tài)性SLAF標(biāo)簽進(jìn)行分析，共開發(fā)得到127 278個SNP位點(diǎn)(表4)。對所有的SNP根據(jù)完整度>0.5，次要基因頻率(MAF)>0.05過濾，共得到102 025個高一致性的群體SNP。

表2 沙冬青Q30與GC含量

表3 沙冬青SLAF標(biāo)簽

表4 沙冬青SNP信息

2.4 遺傳進(jìn)化初步分析

基于過濾后的得到的102 025個SNP，運(yùn)用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對10份沙冬青完成系統(tǒng)進(jìn)化樹、群體結(jié)構(gòu)、PCA分析，從基因組水平揭示不同個體沙冬青的遺傳分化關(guān)系。

2.4.1 系統(tǒng)發(fā)育分析

對開發(fā)出的102 025個SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，構(gòu)建分布在10個不同地點(diǎn)沙冬青的進(jìn)化樹(圖2)。從進(jìn)化樹中可以看出，分布在內(nèi)蒙古的五個地點(diǎn)(敖倫布拉格、阿拉善、冬青湖、磴口桃司兔、千里溝)及寧夏兩個地點(diǎn)(兵溝、白芨灘)的沙冬青聚在一起，顯示它們之間有更近的親緣關(guān)系，而分布在寧夏和甘肅三個地點(diǎn)(扁擔(dān)溝、紅砂硯、紅衛(wèi))的沙冬青聚在一起，表明它們之間有較近的親緣關(guān)系，其可能原因是黃河及賀蘭山高大的山體，阻斷了沙冬青個體間的基因交流，使其產(chǎn)生遺傳分化。

圖2 10個沙冬青個體的系統(tǒng)進(jìn)化樹 NMG.內(nèi)蒙古；GS.甘肅?。籒X.寧夏省Fig.2 Phylogenetic tree of 10 A.mongolicus individual NMG.Neimenggu；GS.Gansu；NX.Ningxi

2.4.2 遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于開發(fā)出的102 025個SNP位點(diǎn)，通過admixture軟件，分析它們的群體結(jié)構(gòu)，分別假設(shè)10個沙冬青個體的分群數(shù)(K值)為1～5，進(jìn)行聚類。交叉驗(yàn)證聚類結(jié)果，把擁有最低交叉驗(yàn)證錯誤率的分群數(shù)定義為最優(yōu)分群數(shù)。K值為1～5的聚類情況及各個K值對應(yīng)的交叉驗(yàn)證錯誤率見圖3～4。根據(jù)交叉驗(yàn)證錯誤率的谷值確定最優(yōu)分群數(shù)為1，結(jié)果表明10個地點(diǎn)種間遺傳差異比較小，但并沒有形成明顯的種群分化。

圖3 交叉各個K值對應(yīng)的個體聚類圖Fig.3 Admixture the individual cluster values corresponding to each K value

圖4 不同K值所對應(yīng)的的交叉驗(yàn)證錯誤率Fig.4 The admixture validation error rate corresponding to the different K values

圖5 主成分分析Fig.5 The analysis of principal components

2.4.3 PCA分析

用cluster[16]軟件，對開發(fā)出的102 025個SNP位點(diǎn)進(jìn)行主成分分析(Principal components analysis，PCA)，得到10個從沙冬青個體的主成分聚類分析(圖5)。圖中通過PCA分析將個體聚為三維，pca1代表第一主成分，pca2代表第二主成分，pca3代表第三主成分。結(jié)果表明內(nèi)蒙古(5個樣本)和寧夏(4個樣本)內(nèi)均存在一定的遺傳多樣性，但在不同地點(diǎn)間的個體在PCA圖上的分布分散，沒有明顯的分群現(xiàn)象。

3 討論與結(jié)論

簡化基因組測序是在高通量測序基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，它可以通過尋找合適的限制性內(nèi)切酶來降低基因組的復(fù)雜程度，用來研究物種的遺傳變異。這種測序技術(shù)尤其適用于沒有參考基因組的物種，能有效克服基因組復(fù)雜的問題。由于SLAF-seq技術(shù)可以開發(fā)大量的且準(zhǔn)確率高的分子標(biāo)記，且較于傳統(tǒng)的分子標(biāo)記法，例如ISSR、RAPD等還具有低成本、高準(zhǔn)確性、高通量、特異性高、穩(wěn)定可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，因此已經(jīng)被用于多種植物遺傳多樣性研究上，如陶紅霞[17]基于SLAF標(biāo)記的蘋果遺傳連鎖圖譜構(gòu)建，獲得125 497個多態(tài)性SLAF標(biāo)簽；Li等[18]運(yùn)用SLAF-seq技術(shù)獲得了9948個大豆多態(tài)SLAF標(biāo)記。

目前國內(nèi)外對植物譜系地理學(xué)多采用葉綠體基因組及多核基因位點(diǎn)進(jìn)行研究，但葉綠體基因組突變率較慢，植物單拷貝或低拷貝基因獲取較為困難，而簡化基因組數(shù)據(jù)以其高效、準(zhǔn)確的優(yōu)勢能更全面的模擬出物種經(jīng)歷的種群歷史動態(tài)。地理因素造成的隔離對植物形成現(xiàn)有分布格局有很大的影響，比如經(jīng)緯度、海拔高度及水熱差異，都能導(dǎo)致物種所在的棲息環(huán)境發(fā)生改變，從而對物種的遺傳分化及種群結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生影響[19]。基于SALF-seq簡化基因組數(shù)據(jù)得到的系統(tǒng)進(jìn)化樹中可知，分布在內(nèi)蒙古的沙冬青親緣關(guān)系較近；而甘肅和寧夏的沙冬青親緣關(guān)系較近。其可能原因是賀蘭山主體的山脈走向?yàn)榻媳弊呦?，生長在內(nèi)蒙古的沙冬青主要分布在賀蘭山的西部，而生長在寧夏和甘肅的沙冬青主要分布在賀蘭山東部。賀蘭山海拔約為2 000～3 000 m。賀蘭山不但是是季風(fēng)氣候和非季風(fēng)氣候的分界線，而且是中國200毫米等降水量線，再加上山勢的阻擋，使得東西兩側(cè)的氣候差異頗大。地理位置不同造成的氣候、生長環(huán)境的不同以及高大的山脈阻擋了沙冬青種群間的基因交流以及種子本身結(jié)構(gòu)造成了長距離擴(kuò)散的難度，使得沙冬青在長期的生長發(fā)育過程中發(fā)生了遺傳分化。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指在基因組上單個核苷酸的變異形成的遺傳標(biāo)記，是最普遍的遺傳變異，是構(gòu)建遺傳圖譜、完成分子標(biāo)記輔助育種的一種非常重要的遺傳標(biāo)記。本試驗(yàn)中選用的沙冬青個體來源于不同的地方，個體間差異性較大，獲得了大量的信息豐富的SNP位點(diǎn)，并基于SNP標(biāo)記構(gòu)建該物種系統(tǒng)發(fā)生樹，為研究沙冬青的起源提供了新證據(jù)，也為進(jìn)一步開展沙冬青譜系地理學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。此外，獲得的具有特異性SNP位點(diǎn)也為沙冬青篩選抗逆性相關(guān)研究提供了新的途徑。

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National Natural Science Foundation of China(41601059;Phylogeography of ancient Mediterranean relic and endangered plant genus Ammopiptanthus)

introduction：DUAN Yi-Zhong(1981—),male,associate professor,research mainly focuses on plant phylogeography.

date:2017-07-31

SNPSitesDevelopedbySpecificLengthAmplificationFragmentSequencing(SLAF-seq)andGeneticAnalysisinAmmopitanthusmongolicus

DUAN Yi-Zhong1,2WANG Jian-Wu1,2DU Zhong-Yu1KANG Fu-Ren1,2

(1.College of Life and Science,Yulin University,Yulin 719000；2.Shaanxi Key Laboratory of Ecological Restoration in Northern Shaanxi Mining Area,Yulin 719000)

Ten site ofAmmopiptanthusmongolicusdistributed in Inner Mongolia, Ningxia and Gansu Province were used as experiment materials for sequencing by specific-locus amplified fragment sequencing(SLAF-seq). The scheme of the experiment was designed based on bio-informatics technology. Taking Glycine max as the reference genome, specific size of DNA were chosen to construct the SLAF-seq library. After high-throughput sequencing, a great amount of sequences were obtained and used to obtain the polymorphism SLAF tags by software alignment, then found the distribution of specific SNP sites. In total, we obtained 374 265 SLAF tags, including 56 295 polymorphic SLAF tags. According to these conditions that integrity >0.5 and MAF>0.05 screening from all SNP, obtained 102 025 group SNP which have high consistency. Phylogenetic relationship population structure and PCA analysis of ten individuals ofA.mongolicuswere analyzed using mathematical statistic method based on screening SNP, from the level of the genome to reveal the genetic differentiation between different groups. The results show that theseA.mongolicusin ten different sites all originate from the same ancestor, but due to these factor that geographical location make theA.mongolicusproduced genetic differentiation. Therefore,A.mongolicusgrowing in Inner Mongolia have close relationship, and that distributed in Ningxia and Gansu Province have close relationship.

Thymusmongolicus;SLAF-seq;SNP;genetic differentiation

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41601059，古地中海孑遺瀕危植物沙冬青屬譜系地理學(xué)研究)

段義忠(1981—)，男，副教授，博士，主要從事植物譜系地理學(xué)研究。

2017-07-31

Q941

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2018.01.017