福林-酚比色法測(cè)定葡萄烈酒中總多酚含量的研究

張 婭，石方劍，楊有仙*

（1.紅河州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南 蒙自 661199；2.紅河學(xué)院理學(xué)院，云南 蒙自 661199）

福林-酚比色法測(cè)定葡萄烈酒中總多酚含量的研究

張 婭1，石方劍2，楊有仙1*

（1.紅河州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南 蒙自 661199；2.紅河學(xué)院理學(xué)院，云南 蒙自 661199）

該試驗(yàn)對(duì)福林-酚比色法測(cè)定葡萄烈酒中總多酚含量的最佳條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，最佳檢測(cè)條件確定為反應(yīng)溫度40℃、顯色時(shí)間20 min、檢測(cè)波長736 nm。在此最佳條件下，沒食子酸質(zhì)量濃度在50～400 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度值線性關(guān)系良好（相關(guān)系數(shù)R2=0.997 4），方法重復(fù)性試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.97%和1.17%，回收率為98.61%～103.22%，RSD值為2.34%，表明該方法重復(fù)性好、精密度和準(zhǔn)確度較高，可用于葡萄烈酒中總多酚含量的檢測(cè)。

福林-酚比色法；葡萄烈酒；總多酚；檢測(cè)條件

葡萄烈酒是高濃度烈性酒，酒精度在45%vol～85%vol范圍內(nèi)，主要產(chǎn)于云南省紅河州彌勒市，一般采用水晶葡萄作為原料，以白蘭地釀酒技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合中國傳統(tǒng)的釀酒特點(diǎn)，經(jīng)特殊工藝加工而成。葡萄烈酒與白蘭地、威士忌、朗姆酒、杜松子酒等烈酒相比，有其獨(dú)特的酒體和香氣。新蒸餾的原葡萄烈酒質(zhì)地粗糙、香味不圓熟，不具有葡萄烈酒的口味和香氣，需經(jīng)橡木桶多年貯存陳釀才逐漸完成向陳釀葡萄烈酒的轉(zhuǎn)變[1]。在陳釀的過程中，原葡萄烈酒發(fā)生一定程度的氧化，并從橡木桶中萃取出酚類、單寧、半纖維素等物質(zhì)[2-3]，這些物質(zhì)增加了葡萄烈酒的口感，構(gòu)成了葡萄烈酒的獨(dú)特風(fēng)格，對(duì)葡萄烈酒的等級(jí)具有重要的影響。葡萄烈酒中總多酚含量一定程度上反映了葡萄烈酒陳釀的時(shí)間及后熟程度，所以葡萄烈酒中總多酚含量的測(cè)定有助于衡量葡萄烈酒的質(zhì)量和品質(zhì)。

國內(nèi)對(duì)多酚類化合物的測(cè)定方法主要有：高錳酸鉀滴定法[4-5]、分光光度法（酒石酸亞鐵法[4]、福林-酚（Folin-ciocalteu）法[6-8]和鐵氰化鉀分光光度法[9-10]）、液相色譜法[11-12]等。福林-酚法具有顯色明顯、誤差小、回收率高的特點(diǎn)[13]，因此本研究在前人的基礎(chǔ)上嘗試用福林-酚法對(duì)葡萄烈酒中總多酚物質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。

沒食子酸常用來作為多酚含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[14-16]，研究顯示，沒食子酸標(biāo)液質(zhì)量濃度在200～600 mg/L下，用福林-酚法測(cè)定，線性良好，并發(fā)現(xiàn)反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定（重現(xiàn)性差）、誤差大（回收率低）的兩個(gè)重要原因[13]；有文獻(xiàn)指出[6]，反應(yīng)溫度為70℃，反應(yīng)時(shí)間為30min時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定。李巨秀等[17]采用福林-酚比色法對(duì)桑椹中總多酚含量的研究結(jié)果表明，反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)時(shí)間為50 min時(shí)，結(jié)果重現(xiàn)性好、加標(biāo)回收率高?？梢姺磻?yīng)溫度、時(shí)間對(duì)多酚含量檢測(cè)結(jié)果的影響較大。因此本試驗(yàn)研究了福林-酚法測(cè)定葡萄烈酒中總多酚物質(zhì)含量時(shí)，檢測(cè)波長、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度對(duì)多酚含量的影響，并考察了方法的可靠性和準(zhǔn)確度，以期建立一個(gè)快速準(zhǔn)確地測(cè)定葡萄烈酒中總多酚含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄烈酒（酒精度80%vol）：云南省紅河州彌勒市市售；葡萄烈酒A（酒精度82%vol于不銹鋼罐儲(chǔ)存陳釀）、葡萄烈酒B（酒精度81%vol于橡木桶儲(chǔ)存陳釀）、葡萄烈酒C（酒精度72%vol于土罐儲(chǔ)存陳釀）：云南省紅河州彌勒東風(fēng)寶云酒莊；福林-酚試劑（分析純）：美國Sigma公司；沒食子酸（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Na2CO3（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

MS205DU電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-2550雙光束紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；HH-4數(shù)顯電子恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；Transfer pette移液器：普蘭德（上海）貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 最佳吸收波長的選擇

多酚類化合物在堿性條件下，與福林-酚試劑形成藍(lán)色物質(zhì)。取25 mL具塞比色管一支，加入0.5 mL質(zhì)量濃度為150 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、1 mL福林-酚顯色劑，混勻靜置30 s后加入18 mL 4%的Na2CO3溶液[7]，用去離子水定容，常溫條件下反應(yīng)1.5 h后用雙光束紫外可見分光光度計(jì)對(duì)反應(yīng)后試液進(jìn)行700～780 nm范圍全波長掃描，獲取最大吸收波長。

1.3.2 最佳反應(yīng)時(shí)間的選擇

取8支25 mL具塞比色管，編號(hào)為1～8號(hào)，1～7號(hào)比色管中各加入0.5 mL質(zhì)量濃度為150 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，8號(hào)管中加入0.5 mL去離子水，各管中再加入1 mL福林-酚顯色劑，混勻靜置30s后向各管加入18mL4%的Na2CO3溶液并用去離子水定容至刻度，將1～7號(hào)比色管于40℃水浴鍋中分別反應(yīng)5 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min時(shí)，以8號(hào)管（40℃反應(yīng)20 min）作參比液，在波長736 nm處測(cè)定各比色管中試液的吸光度值。以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制吸光度值-反應(yīng)時(shí)間曲線，確定最適宜的反應(yīng)時(shí)間。

1.3.3 最佳反應(yīng)溫度的選擇

取8支25 mL具塞比色管，編號(hào)為1～8號(hào)，1～7號(hào)比色管中各加入0.5 mL質(zhì)量濃度為150 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，8號(hào)管中加入0.5mL去離子水，分別向各管中加入1mL福林-酚顯色劑（每個(gè)比色管添加時(shí)間間隔1 min），混勻靜置30s后加入18 mL4%的Na2CO3溶液并用去離子水定容至刻度，1～7號(hào)比色管分別于15℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃反應(yīng)20 min后，在波長736 nm處測(cè)定吸光度值，以8號(hào)管（40℃反應(yīng)20min）作為參比以反應(yīng)溫度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制吸光度值-溫度曲線，確定最適宜的反應(yīng)溫度。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取1.000g沒食子酸，用去離子水定容至100mL，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次稀釋成50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400 μg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別取0.5 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作液于25 mL比色管中，加入1 mL福林-酚顯色劑，混勻靜置30 s后加入18 mL 4%的Na2CO3溶液并用去離子水定容至刻度，40℃水浴反應(yīng)20 min后，以8號(hào)管（40℃反應(yīng)20 min）作為參比，于波長736 nm處測(cè)定吸光度值，以沒食子酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳吸收波長的確定

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與福林-酚試劑反應(yīng)后于700～780nm范圍進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果見圖1。由圖1可知，反應(yīng)液在波長736nm處有最高吸收峰，因此選擇736 nm作為福林-酚法測(cè)定葡萄烈酒中總多酚的最佳波長。

圖1 反應(yīng)液在可見光區(qū)的吸收曲線Fig.1 The absorption curve of reaction liquid in the visible region

2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度值的影響

考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)液吸光度值的影響，繪制吸光度值-反應(yīng)時(shí)間變化曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)液吸光度值的影響Fig.2 Effect of reaction time on the absorbance value of the reaction liquid

由圖2可知，隨反應(yīng)時(shí)間的延長，反應(yīng)液吸光度值先迅速增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為20 min時(shí)，吸光度值達(dá)到最大值，說明此時(shí)反應(yīng)液中有色物質(zhì)含量最高；繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間，吸光度值開始下降，表明反應(yīng)液中有色物質(zhì)開始分解，40min后酒樣的吸光度值趨于穩(wěn)定。因此，選擇20 min為最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.3 反應(yīng)溫度對(duì)吸光度值的影響

考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)液吸光度值的影響，繪制吸光度值-反應(yīng)時(shí)間變化曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)液吸光度值的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on the absorbance value of the reaction liquid

由圖3可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，反應(yīng)液吸光度值呈先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)溫度為40℃時(shí)，吸光度值達(dá)到最高；繼續(xù)升高反應(yīng)溫度，吸光度值開始下降，可能是由于隨著反應(yīng)溫度升高有色物質(zhì)逐漸被分解。因此，選擇40℃為最適宜的反應(yīng)溫度。

2.4 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以沒食子酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖4。

圖4 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of gallic acid

由圖4可知，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.0036x+0.096 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 4，表明沒食子酸在質(zhì)量濃度50～400 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度值線性關(guān)系良好。

2.5 重復(fù)性和精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取1 mL葡萄烈酒樣品6份于6支25 mL的具塞比色管中，加入1 mL福林-酚顯色劑，混勻靜置30 s后加入18 mL 4%的Na2CO3溶液并用去離子水定容至刻度，40℃水浴反應(yīng)20min后，以8號(hào)管中試液作為參比，于波長736nm處測(cè)定吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葡萄烈酒樣品中總多酚含量，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standarddeviation，RSD），考察方法重復(fù)性，同一管中的試液連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察方法的精密度。結(jié)果表明，在選定的最佳反應(yīng)條件下，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果的RSD值為1.97%，精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD值為1.17%，表明該方法具有良好的重復(fù)性和精密度。

2.6 回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取1mL的葡萄烈酒樣品9份于9支25 mL具塞比色管中，分成3個(gè)濃度組，每組3個(gè)平行，分別加入50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后加入1mL福林-酚顯色劑，混勻靜置30 s后，加入18 mL 4%的Na2CO3溶液并用去離子水定容至刻度，40℃水浴反應(yīng)20 min后，以8號(hào)管作為參比，于波長737 nm處測(cè)定吸光度值，加標(biāo)回收率計(jì)算結(jié)果見表1。

表1 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of adding standard recovery tests

由表1可知，葡萄烈酒中總多酚平均加標(biāo)回收率在98.61%～103.22%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.34%，表明該方法準(zhǔn)確度較高，可用于葡萄烈酒中總多酚含量的檢測(cè)。

2.7 葡萄烈酒樣品中總多酚含量的測(cè)定

采用上述所建立的方法對(duì)3種不同儲(chǔ)存條件下葡萄烈酒樣品中的總多酚含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 不同儲(chǔ)存條件下葡萄烈酒中總多酚含量測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of total polyphenols content in grape spirits under different storage conditions

由表2可知，A、B、C三種存儲(chǔ)陳釀方式的葡萄烈酒中總多酚含量分別為32.72 μg/mL、111.89 μg/mL、47.35 μg/mL，其中于橡木桶儲(chǔ)存陳釀的葡萄烈酒中總多酚含量明顯高于其他二種。這是由于橡木桶儲(chǔ)存陳釀的葡萄烈酒中總多酚除了來源于葡萄漿果之外，還來源于橡木桶的多酚類物質(zhì)。在葡萄烈酒儲(chǔ)存陳釀過程中，原葡萄烈酒發(fā)生一定程度的氧化，從橡木桶中萃取出單寧等多酚類物質(zhì)，橡木桶中多酚可以增加葡萄烈酒中總酚的含量，并與其他酚類物質(zhì)共同來增加或修飾葡萄烈酒的香氣、口感和色澤[2-3]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)福林-酚法測(cè)定葡萄烈酒中總多酚含量的檢測(cè)條件：波長、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度進(jìn)行了研究，并考察了方法的重復(fù)性、精密度和回收率。結(jié)果顯示，福林-酚法測(cè)定葡萄烈酒中總多酚含量的最佳條件為：反應(yīng)溫度40℃、顯色時(shí)間20 min、檢測(cè)波長736 nm。在該條件下沒食子酸質(zhì)量濃度在50～400 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度值線性關(guān)系良好（R2=0.997 4），方法重復(fù)性試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.97%和1.17%，平均加標(biāo)回收率為98.61%～103.22%，RSD值為2.34%，表明該方法重復(fù)性好、精密度和準(zhǔn)確度較高，可作為福林-酚法測(cè)定葡萄烈酒中總多酚含量的參考條件。

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Determination of the total polyphenols content in grape spirits by Folin-ciocalteu colorimetry method

ZHANG Ya1,SHI Fangjian2，YANG Youxian1*
(1.Honghe Quality and Technical Supervision Comprehensive Testing Center,Mengzi 661199,China;2.College of Science,Honghe University,Mengzi 661199,China)

The optimum determination conditions of total polyphenols content in grape spirits by Folin-ciocalteaut method were researched.The results showed that the optimum determination conditions were be identified as reaction temperature 40℃,developing time 20 min and detection wavelength 736 nm.Under the optimum conditions,the gallic acid in the range of 50-400 μg/ml had a good linear relationship with the absorbance value(R2=0.997 4).The relative standard deviation(RSD)of method repeatability test and the precision tests results were 1.97%and 1.17%,respectively.The recovery rate was 98.61%-103.22%,RSD was 2.34%,which indicated the method had good repeatability,precision and high accuracy,and could be used for the determination of total polyphenols content in grape spirits.

Folin-ciocalteu colorimetry;grape spirits;polyphenols;detection conditions

TS207.3

0254-5071（2017）10-0163-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.034

2017-05-24

張 婭（1962-），女，高級(jí)工程師，本科，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測(cè)。

*通訊作者：楊有仙（1987-），女，助理工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測(cè)。