濃醬兼香型酒醅中產(chǎn)醬香芽孢桿菌的篩選及發(fā)酵風(fēng)味成分分析

王 霜，繆禮鴻*，張明春，劉蒲臨，劉俊超

（1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司，湖北 松滋 434200）

濃醬兼香型酒醅中產(chǎn)醬香芽孢桿菌的篩選及發(fā)酵風(fēng)味成分分析

王 霜1，繆禮鴻1*，張明春2，劉蒲臨1，劉俊超1

（1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司，湖北 松滋 434200）

該研究從兼香型白酒不同輪次酒醅中篩選到兩株堿性蛋白酶活較高并對(duì)乙醇具有較好耐受性的菌株，分別為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）LS9和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）S10，其液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶活性分別可達(dá)（163.82±15.85）U/mL和（241.69±20.07）U/mL，二者均能在含體積分?jǐn)?shù)6%乙醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。菌株LS9和S10均能產(chǎn)生典型的醬香風(fēng)味。氣質(zhì)分析結(jié)果表明，菌株LS9和S10發(fā)酵后代謝產(chǎn)生了5-甲基糠醛、β-苯乙醇、苯乙酸、α-亞麻酸等新的風(fēng)味成分。菌株LS9和S10在小麥固體培養(yǎng)基中均具有一定的發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻能力，在28℃恒溫條件下乙偶姻產(chǎn)量分別為（65.15±6.15）mg/L和（41.33±4.82）mg/L，35℃→45℃→55℃升溫培養(yǎng)條件下的乙偶姻產(chǎn)量分別為（41.21±3.27）mg/L和（26.91±2.97）mg/L。

兼香型酒醅；芽孢桿菌；堿性蛋白酶活；風(fēng)味成分

濃醬兼香型白酒是在我國(guó)傳統(tǒng)醬香型和濃香型白酒的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，其中白云邊酒是濃醬兼香型白酒的典型代表[1]，其采用大曲醬香型白酒和濃香型白酒相結(jié)合的生產(chǎn)工藝，前6輪為醬香型生產(chǎn)工藝，后3輪采用濃香型生產(chǎn)工藝[2-3]。因此醬香型白酒的生產(chǎn)工藝對(duì)兼香酒的出酒率及酒品質(zhì)量具有較大影響。醬香大曲中的微生物代謝產(chǎn)物對(duì)醬香白酒的風(fēng)格具有重要貢獻(xiàn)[4-5]。醬香大曲制作過程中微生物代謝產(chǎn)生的蛋白酶可將原料中的粗蛋白降解成各種氨基酸，淀粉酶可將淀粉降解成糖，氨基酸和糖在特定的環(huán)境中可發(fā)生美拉德反應(yīng)生成具有醬香風(fēng)味的物質(zhì)，此外氨基酸在受熱分解時(shí)也可產(chǎn)生醬香風(fēng)味物質(zhì)[6]。白酒發(fā)酵過程中的高產(chǎn)蛋白酶活菌株一方面可提高氨基酸含量，從而增加白酒中的風(fēng)味物質(zhì)，另一方面還可提高白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量[7]。高產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的分離篩選，有助于醬香大曲中高產(chǎn)蛋白酶微生物的研究，對(duì)生產(chǎn)出優(yōu)良的醬香大曲和醬香白酒具有重要意義[8]。

本研究對(duì)濃醬兼香型白酒酒醅中分離出的細(xì)菌進(jìn)行蛋白酶活、產(chǎn)醬香能力及耐酒精能力測(cè)定，從中篩選出具有產(chǎn)醬香功能的優(yōu)良菌株，為開發(fā)醬香功能強(qiáng)化曲提供優(yōu)良菌株來(lái)源并為揭示濃醬兼香型白酒醬香風(fēng)味來(lái)源提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來(lái)源及原料

菌株由本實(shí)驗(yàn)室從白云邊不同輪次入池酒醅和出池酒醅中分離的25株芽孢桿菌[9]，其中地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）11株，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）11株、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）3株。

小麥：由湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司提供。

1.1.2 試劑

福林試劑：上海荔達(dá)生物科技有限公司；無(wú)水碳酸鈉（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；三氯乙酸（分析純）：上海山浦化工有限公司；磷酸二氫鈉（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）：山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；干酪素、酪氨酸（分析純）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。無(wú)水乙醇（分析純）、二氯甲烷（CH2Cl2）（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙偶姻（分析純）：上海市麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、水1 000 mL，pH 7.0～7.2，固體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂，121℃滅菌20 min。

葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、葡萄糖5 g、K2HPO42 g、水1 000 mL，pH 7.0～7.2，115 ℃滅菌20 min。

產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基[10]：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、蔗糖10g、磷酸氫二鈉4g、硫酸鎂0.2g、水1000mL，pH7.2，121℃滅菌30 min。

小麥固體培養(yǎng)基：將小麥粉碎后的顆粒和面粉的混合物按料水比1∶0.4加水后浸潤(rùn)過夜，在沸水鍋上蒸熟1 h，按照100 g/250 mL分裝到三角瓶中，121℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

FW177高速粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；ZHJH-CH15B超凈工作臺(tái)、ZXSD-A1270恒溫培養(yǎng)箱、ZHWF-2102恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；UV-5900PC分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；RV8V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)艾卡公司；GC7890A-MS5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀、7820A氣相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高產(chǎn)蛋白酶活菌株的篩選

將分離自白云邊酒醅的25株芽孢桿菌經(jīng)牛肉膏平板活化后接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30℃、170 r/min搖床培養(yǎng)12 h，將培養(yǎng)的種子液按照3%的接種量接種至產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、170 r/min培養(yǎng)48 h，按照國(guó)標(biāo)福林-酚試劑法測(cè)定各菌株發(fā)酵液堿性蛋白酶活[11]，單位為U/mL，每個(gè)菌株3瓶重復(fù)。

1.3.2 產(chǎn)醬香芽孢桿菌的篩選及產(chǎn)乙偶姻芽孢桿菌的培養(yǎng)

從不同種類芽孢桿菌中挑選蛋白酶活大小不同的菌株，接種至葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基37℃、170 r/min培養(yǎng)24 h，按照10%的接種比例接種至小麥固體培養(yǎng)基中，并設(shè)置空白組（未接種小麥固體培養(yǎng)基），按照35℃→45℃→55℃升溫培養(yǎng)，每個(gè)溫度段各培養(yǎng)2 d，篩選出具有產(chǎn)醬香功能的芽孢桿菌，每個(gè)菌株3瓶重復(fù)，曲香感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表1[12]。綜合評(píng)分是5個(gè)人重復(fù)3次試驗(yàn)的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果，滿分10分。

表1 曲香感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of Daqu flavor

將篩選到的產(chǎn)醬香芽孢桿菌分別置于28℃恒溫培養(yǎng)6 d和35℃→45℃→55℃升溫培養(yǎng)，每個(gè)溫度段各培養(yǎng)2 d。測(cè)定不同培養(yǎng)溫度對(duì)乙偶姻含量的影響，每個(gè)菌株3瓶重復(fù)。

1.3.3 耐酒精能力的測(cè)定

向LB培養(yǎng)基中分別加入不同體積比的無(wú)水乙醇配制成含不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的培養(yǎng)基，將待測(cè)菌株經(jīng)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液活化后，按0.1%的接種量接入含乙醇的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、170 r/min搖床培養(yǎng)，取發(fā)酵液稀釋后測(cè)定OD600nm值，每12 h檢測(cè)一次。

1.3.4 風(fēng)味成分分析

（1）風(fēng)味成分的提取

取方法1.3.2中產(chǎn)醬香發(fā)酵樣品50 g加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇100mL，30℃超聲波處理40min，結(jié)束后離心收集上清液，按照上清液體積1∶1加入CH2Cl2，充分混勻后收集萃取相，將收集到萃取液通過減壓蒸餾，濃縮至無(wú)水，加CH2Cl2定容至5 mL作為最終萃取樣品。

（2）氣相色譜質(zhì)譜分析

通過DB-Wax毛細(xì)管柱進(jìn)行氣相質(zhì)譜分析，程序升溫條件為：初溫50℃，恒溫2 min，然后以6℃/min的速率升至230℃，保持30min。進(jìn)樣量：1μL，不分流。載氣：氦氣（He）；流速：2 mL/min；分離后的樣品用Agilent 5975MSD鑒定。質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量：70 eV；離子源溫度：230℃；掃描范圍：30～550 amu[13]。

（3）乙偶姻含量測(cè)定

固液萃?。喝?.3.2中發(fā)酵樣品50 g加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇100 mL，30 ℃、170 r/min振蕩1 h，結(jié)束后加入5 mL CH2Cl2充分混勻靜置，收集下層萃取相，8000r/min離心1min取上清液濾膜過濾后即為萃取樣品。氣相色譜分析方法：樣品通過CP-Wax57CB毛細(xì)管柱進(jìn)行分離，程序升溫條件：初溫80℃，恒溫2 min，然后以5℃/min的速率升至200℃，保持30 min。進(jìn)樣量：1 μL，不分流。載氣：氮?dú)猓∟2）；流速：2 mL/min。進(jìn)樣口與檢測(cè)器溫度：200℃。

乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱取0.1g乙偶姻，用無(wú)水乙醇定容至25 mL，使用前，用無(wú)水乙醇分別稀釋至25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L，繪制乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)定結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算乙偶姻含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌蛋白酶活測(cè)定結(jié)果

對(duì)25株芽孢桿菌的堿性蛋白酶活檢測(cè)，結(jié)果見表2。

表2 堿性蛋白酶活檢測(cè)結(jié)果Table 2 Determination results of alkaline protease activity

由表2可知，菌株JCB3-1-1（LS9）和JRB7-1-1N（S10）的蛋白酶活分別為（163.82±15.85）U/mL和（241.69±20.07）U/mL，明顯較其他菌株高，其余6株蛋白酶活較高菌株分別為CRB7-1-1N、CRB6-1-2M（LS6）、CCB7-1-1M（S13）、JRB3-1-2、JRB4-1-2和CCB6-1-3M（AS1）。結(jié)合以上8株堿性蛋白酶活較高菌來(lái)源進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，其中有5株菌均分離自不同輪次入池酒醅中。5株產(chǎn)堿性蛋白酶活較低菌株分別為JRB3-1-3（LS23）、JCB4-1-1M（AS3）、CCB7-1-3N、CCB7-1-2N（LS16）和JCB7-1-2N，其中4株均分離自出池酒醅中。以上結(jié)果表明，堿性蛋白酶活較高菌株多分離自高溫堆積后入池酒醅中，而堿性蛋白酶活較低菌株多分離自發(fā)酵結(jié)束后出池酒醅中。

2.2 產(chǎn)醬香功能菌株的篩選結(jié)果

2.2.1 產(chǎn)醬香能力鑒定

從不同種類芽孢桿菌中選擇5株堿性蛋白酶活較高的菌株，編號(hào)分別為L(zhǎng)S9（JCB3-1-1）、S10（JRB7-1-1N）、S13（CCB7-1-1M）、AS1（CCB6-1-3M）和LS6（CRB6-1-2M）和3株堿性蛋白酶活較低菌株，編號(hào)分別為L(zhǎng)S23（JRB3-1-3）、LS16（CCB7-1-2N）和AS3（JCB4-1-1M），進(jìn)行產(chǎn)醬香發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 不同芽孢桿菌產(chǎn)醬香能力分析Table 3 Sauce flavor production of differentBacillusstrains

由表3可知，菌株LS9和S10兩株堿性蛋白酶活較高菌株的產(chǎn)醬香能力明顯較其他菌株強(qiáng)，菌株LS9和S10即為篩選得到的產(chǎn)醬香功能菌株。此外菌株LS23、LS16和AS3三株蛋白酶活較低菌株的產(chǎn)醬香能力也明顯較弱，表明芽孢桿菌的產(chǎn)醬香能力與其產(chǎn)蛋白酶活的高低有一定的相關(guān)性。

2.2.2 芽孢桿菌耐酒精生長(zhǎng)能力測(cè)定結(jié)果

菌株LS9和S10在含不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的LB培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)狀況如圖1所示。由圖1a和1b可知，菌株LS9和S10在乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%的培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)不受影響，但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，兩種菌的生長(zhǎng)開始受一定程度的抑制。菌株LS9和S10在乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%時(shí)仍能生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)到48h，OD600nm值可達(dá)3.0左右；但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到8%時(shí)，兩株芽孢桿菌的生長(zhǎng)均受到明顯抑制；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，菌株LS9和S10基本都不生長(zhǎng)，結(jié)果表明，菌株LS9和S10均可耐受體積分?jǐn)?shù)6%左右的乙醇。

圖1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下的菌株LS9（a）及S10（b）生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of strain LS9(a)and S10(b)under different ethanol concentration

2.3 產(chǎn)醬香風(fēng)味成分的分析

表4 兩株芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)香氣成分檢測(cè)結(jié)果Table 4 Aroma components determination results of twoBacillus strains fermentation

兩株芽孢桿菌在小麥固體培養(yǎng)基中的產(chǎn)醬香發(fā)酵產(chǎn)物的氣質(zhì)分析結(jié)果見表4。由表4可知，與不接種的小麥原料空白組相比，接種菌株LS9和S10的發(fā)酵基質(zhì)中有12種新的代謝產(chǎn)物：乙酸、5-甲基糠醛、異戊酸、苯乙醇、苯酚、2-吡咯烷酮、苯乙酸、肉豆蔻酸、十七烷酸、棕櫚油酸、硬脂酸、α-亞麻酸。其中菌株LS9代謝產(chǎn)生的5-甲基糠醛屬呋喃類物質(zhì)，呋喃類物質(zhì)也是報(bào)道的醬香型白酒的重要呈香物質(zhì)和特征化合物[14]；2-吡咯烷酮、肉豆蔻酸和十七烷酸由菌株S10代謝產(chǎn)生；菌株LS9和S10的產(chǎn)醬香發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中都有檢出乙酸、異戊酸、β-苯乙醇、苯酚、苯乙酸、棕櫚油酸和α-亞麻酸等物質(zhì)；其中含量較高的苯乙酸可作為生產(chǎn)香精的原料，在菌株LS9和S10中相對(duì)含量分別為8.88%和6.65%；α-亞麻酸具有降壓、抗癌、改善心腦血管疾病和預(yù)防過敏等保健功能[15]，這一物質(zhì)可能成為白酒中的健康功能因子，在接種菌株LS9和S10的發(fā)酵基質(zhì)中相對(duì)含量分別為3.00%和3.65%。

2.4 菌株LS9和S10發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻的測(cè)定結(jié)果

將不同質(zhì)量濃度的乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行氣相色譜測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，乙偶姻質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=6 930.5x-99 013（R2＞0.99），結(jié)果表明，乙偶姻在25～400 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

兩株芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻的檢測(cè)結(jié)果見表5。結(jié)果表明，菌株LS9和S10在小麥培養(yǎng)基中均能產(chǎn)生較高含量的乙偶姻，LS9在小麥培養(yǎng)基中經(jīng)28℃恒溫培養(yǎng)和35℃→45℃→55℃升溫培養(yǎng)后乙偶姻含量分別為（65.15±6.15）mg/g和（41.21±3.27）mg/g，菌株S10分別為（41.33±4.82）mg/g和（26.91±2.97）mg/g，兩種條件下菌株LS9的乙偶姻產(chǎn)量都較菌株S10高。此外菌株LS9和S10在35℃→45℃→55℃升溫培養(yǎng)條件下代謝產(chǎn)生的乙偶姻含量都較28℃恒溫培養(yǎng)條件下低，分析可能有以下兩個(gè)方面的原因：一方面是28℃恒溫條件下適合芽孢桿菌大量生長(zhǎng)，乙偶姻在發(fā)酵過程中不斷積累，而55℃高溫對(duì)芽孢桿菌生長(zhǎng)有一定影響，因此發(fā)酵后期乙偶姻產(chǎn)量有所下降；另一方面在55℃高溫環(huán)境中，微生物分解蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的氨和乙偶姻開始發(fā)生反應(yīng)生成了四甲基吡嗪[16]，因此乙偶姻含量有所下降。

表5 兩株芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻含量測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of acetoin contents by twoBacillus strains fermentation

3 結(jié)論

對(duì)分離自濃醬兼香型白酒酒醅中的25株芽孢桿菌進(jìn)行了堿性蛋白酶活測(cè)定，從中篩選出兩株堿性蛋白酶活較高菌株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）LS9和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）S10。結(jié)果表明，菌株LS9在28℃和35℃→45℃→55℃培養(yǎng)條件下乙偶姻產(chǎn)量分別為（65.15±6.15）mg/L和（41.21±3.27）mg/L，菌株S10產(chǎn)量分別為（41.33±4.82）mg/L和（26.91±2.97）mg/L，兩株菌均具有較好的產(chǎn)醬香功能和較高的產(chǎn)乙偶姻能力，并可耐受體積分?jǐn)?shù)為6%左右的乙醇，菌株LS9和S10在28℃恒溫條件下乙偶姻產(chǎn)量分別為（65.15±6.15）mg/L和（41.33±4.82）mg/L，較35℃→45℃→55℃升溫培養(yǎng)條件下的乙偶姻產(chǎn)量高，更有利于代謝產(chǎn)生乙偶姻。

[1]張 紅.濃醬兼香型白云邊酒釀造工藝與微生物分析[D].武漢：武漢工程大學(xué)，2015.

[2]曾祥雯，蘇 玲.新郎酒 創(chuàng)造兼香新歷史[J].新食品，2012（3）：186.

[3]沈 毅，程 偉，楊秀其.濃醬兼香型白酒的生產(chǎn)方法：CN103320294A[P].2013-09-25.

[4]崔 利.大用曲量工藝與醬香型酒產(chǎn)質(zhì)量、風(fēng)格的關(guān)系[J].釀酒，2008，35（3）：34-38.

[5]程 偉，吳麗華，徐亞磊，等.濃香型白酒釀造微生物研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造，2014，33（3）：1-4.

[6]吳建峰.白酒中四甲基吡嗪全程代謝機(jī)理研究[D].無(wú)錫：江南大學(xué)，2013.

[7]王 婧，王曉丹，羅曉葉，等.醬香大曲中高產(chǎn)蛋白酶功能細(xì)菌的篩選及鑒定[J].中國(guó)釀造，2015，34（10）：43-46.

[8]李季鵬.淀粉酶、蛋白酶在芝麻香型白酒中的應(yīng)用[D].濟(jì)南：濟(jì)南大學(xué)，2013.

[9]劉俊超.白云邊不同輪次及操作工藝對(duì)微生物群落及原酒風(fēng)味的影響[D].武漢：武漢輕工大學(xué)，2015.

[10]黃 璠，蔡 俊.枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的發(fā)酵優(yōu)化[J].飼料工業(yè)，2012，33（2）：49-51.

[11]楊國(guó)華，邱樹毅，黃永光.醬香大曲中產(chǎn)香細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的條件優(yōu)化[J].中國(guó)釀造，2011，30（12）：47-50.

[12]余婷婷，賴世強(qiáng)，曹文濤，等.高溫大曲中產(chǎn)醬香耐高溫細(xì)菌的篩選及鑒定[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（11）：109-112.

[13]張 榮，徐 巖，范文來(lái)，等.醬香大曲中地衣芽孢桿菌及其特征風(fēng)味代謝產(chǎn)物的分析研究[J].工業(yè)微生物，2010，40（3）：7-12.

[14]許漢英.白酒中糠醛含量和白酒香型之間的關(guān)系[J].釀酒，2002（9）：37-39.

[15]吳素萍.亞麻籽中α-亞麻酸的保健功能及提取技術(shù)[J].中國(guó)釀造，2010，29（2）：7-11.

[16]徐 巖.基于風(fēng)味導(dǎo)向技術(shù)的中國(guó)白酒微生物及其代謝調(diào)控研究[J].釀酒科技，2015（2）：1-11.

Analysis of the flavor compounds fermented by sauce-flavor-producingBacillusstrain isolated from fermented grains of mixed strong-sauce-flavorBaijiu

WANG Shuang1,MIAO Lihong1*,ZHANG Mingchun2,LIU Pulin1,LIU Junchao1
(1.School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China;2.Hubei Baiyunbian Distillery Co.,Ltd.,Songzi 434200,China)

Bacillus licheniformisLS9 andBacillus subtilisS10,with higher alkaline protease activity and ethanol tolerance were isolated from different batches of fermented grains of mixed-flavorBaijiu(Chinese liquor),the alkaline protease activityof these two strains achieved(163.82±15.85)U/ml and (241.69±20.07)U/ml during liquid-state fermentation,respectively.Both strains grew well in the medium containing ethanol 6%,and strains LS9 and S10 produced typical Moutai flavor.Results of GC-MS analysis showed that strains produced volatile compounds,including 5-methyl furfural,β-phenylethanol,phenylacetic acid,α-linolenic acid,etc.Strains LS9 and S10 had acetion-producing ability in solid wheat medium.The yield of acetoin under the condition of constant temperature of 28 ℃ were(65.15±6.15)mg/L and(41.33±4.82)mg/L,the yield of acetoin under the condition of warming culture of 35℃→45℃→55℃were(41.21±3.27)mg/L and(26.91±2.97)mg/L.

mixed flavor fermented grains;Bacillus;alkaline protease activity;flavor component

Q939.99

0254-5071（2017）10-0061-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.014

2017-04-13

湖北省重大科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目資助（2013ABA008）

王 霜（1987-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)獒劸莆⑸飳W(xué)。

*通訊作者：繆禮鴻（1965-），男，教授，博士，研究方向?yàn)獒劸莆⑸飳W(xué)。