• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    葡萄酒病害相關酵母的分離與鑒定

    2017-11-17 09:41:49顧沛雯張軍翔
    中國釀造 2017年10期
    關鍵詞:酒樣酵母菌葡萄酒

    張 眾,顧沛雯,張軍翔,*,金 剛

    (1.寧夏大學 農學院,寧夏 銀川 750021;2.寧夏大學 葡萄酒學院,寧夏 銀川 750021)

    葡萄酒病害相關酵母的分離與鑒定

    張 眾1,顧沛雯1,張軍翔1,2*,金 剛2

    (1.寧夏大學 農學院,寧夏 銀川 750021;2.寧夏大學 葡萄酒學院,寧夏 銀川 750021)

    利用3種培養(yǎng)基和3種分離方法,從賀蘭山東麓葡萄酒產區(qū)發(fā)生葡萄酒病害的5款酒樣中分離獲得23株酵母菌株。經形態(tài)學鑒定,初步將所分離的酵母菌歸為4種培養(yǎng)類型;26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析結果表明,4種培養(yǎng)類型的酵母分屬于3個屬3個種,分別為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)和乳酪隱球酵母(Cryptococcus friedmannii)。

    葡萄酒病害;酵母菌;形態(tài)學鑒定;26S rDNA D1/D2

    葡萄酒的釀造離不開微生物的作用,但葡萄酒中有些微生物的活動也可能導致葡萄酒病害的發(fā)生[1]。醋酸菌、乳酸菌、酵母菌和霉菌等都能引發(fā)葡萄酒的微生物病害[2]。其中酵母菌既可以發(fā)酵葡萄(汁),在控制不當的情況下又可能給葡萄酒或發(fā)酵汁帶來一系列問題,從而引發(fā)葡萄酒的酵母病害[3]。如酒香酵母(Brettanomyces)能夠產生大量的揮發(fā)性酚類物質,給葡萄酒帶來類似于馬廄味的異味[3];接合酵母(Zygosaccharomyces)的生長容易使葡萄酒變渾濁或產生沉淀[3];酵母屬(Saccharomyces)或類酵母(Saccharomycodes)都能利用酒中的殘?zhí)且鹧b瓶酒的再發(fā)酵[4],使酒體變渾濁,甚至有瓶塞沖出或酒瓶爆炸的危險。

    寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產區(qū)是中國優(yōu)質的葡萄酒產地,擁有著先進的葡萄栽培技術和葡萄酒釀造技術,但在葡萄酒微生物病害和致病微生物的分離鑒定等方面的研究報道較少,相關研究多集中于釀酒微生物的多樣性分析與菌種選育等領域[5-8]。本研究利用3種培養(yǎng)基和3種分離方法,從取自于賀蘭山東麓產區(qū)的5款發(fā)生葡萄酒病害的酒樣中分離酵母,并利用形態(tài)學和分子生物學相結合的方法進行菌種鑒定,以便為實際生產中葡萄酒酵母病害的診斷和預防提供依據。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 酒樣

    從賀蘭山東麓產區(qū)共收集到5款產生葡萄酒病害的酒樣,其癥狀表述見表1。

    表1 產生葡萄酒病害的酒樣特征Table 1 Symptoms of spoiled wine samples

    1.1.2 培養(yǎng)基

    馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potatodextroseagar,PDA)培養(yǎng)基:北京陸橋技術有限責任公司;酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast peptone dextrose,YPD)瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:青島高科園海博生物技術有限公司。

    1.1.3 試劑

    Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒:杭州博日科技有限公司;2×EcoTaqPCR SuperMix(+dye)、10 000×GelStain核酸染料:北京全式金生物技術有限公司。

    1.2 儀器與設備

    MJX-100B-Z型霉菌培養(yǎng)箱:上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;OLYMPUS顯微鏡:奧林巴斯(中國)有限公司;BIO-RAD聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增儀:時代聯(lián)想生物科技有限公司;DYY-6C型電泳儀:北京市六一儀器廠;c200凝膠成像系統(tǒng)、SIGMA小型臺式離心機:北京元業(yè)伯樂科技發(fā)展有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 接種液的稀釋

    無菌條件下采集酒樣25 mL于滅菌的試管中(標記為樣品100)。吸取2.5 mL樣品100加入裝有22.5 mL的無菌蒸餾水的試管中,混勻,制成10-1稀釋樣。按照此方法制成10-1~10-6共6個濃度梯度的稀釋樣。

    1.3.2 培養(yǎng)基的篩選

    根據各個酒樣適當的稀釋倍數,在制備好的YPD平板、PDA平板以及孟加拉紅平板上分別接種5個酒樣,重復3次,25~26℃培養(yǎng)7~10 d(因酒樣A1中可能存在酒香酵母,故需要培養(yǎng)7 d以上[9]),觀察并計數菌落數。

    1.3.3 接種方法的比較

    采用稀釋涂布法[10]、傾注平板法[10]和劃線法[10]3種方法,對適當稀釋倍數的酒樣進行接種,重復3次,25~26℃培養(yǎng)5~7 d,觀察并計數菌落數。具體如下:

    稀釋涂布法:吸取0.1 mL稀釋液點樣在平板上,用涂布棒涂布均勻,培養(yǎng),計數。

    傾注平板法:吸取1 mL稀釋液于培養(yǎng)皿,待滅菌培養(yǎng)基冷卻至45~50℃時,倒入平板,輕輕晃動,待培養(yǎng)基凝固,培養(yǎng),計數。

    劃線法:將培養(yǎng)基平板分成1/2、1/4、1/4的3個區(qū),用接種環(huán)蘸取1環(huán)接種液,先“S”形劃線在第1區(qū)(1/2),火焰燈滅菌接種環(huán),再從第1區(qū)拉線“S”形劃線在第2區(qū)(1/4),如此,直至劃完第3區(qū)(1/4),培養(yǎng),計數第3區(qū)菌落數。

    1.3.4 菌種純化

    在3種不同的培養(yǎng)基平板上,選取所有不同培養(yǎng)特征的酵母菌菌落,共23個,用接種環(huán)從菌落邊緣挑取少許酵母菌,直接劃線接種在YPD培養(yǎng)基上,25~26℃培養(yǎng)5~7 d后,再用相同方法挑取單菌落邊緣,劃線,培養(yǎng),純化3次后,單菌落用于鑒定。

    1.3.5 形態(tài)學鑒定

    將分離純化的酵母劃線接種于WL培養(yǎng)基上,25~26℃培養(yǎng)5~7 d。通過觀察WL培養(yǎng)基上酵母菌落的顏色及形態(tài)特征,結合顯微鏡下酵母細胞的形態(tài)特征與生殖方式類型,對篩選的酵母菌株進行形態(tài)學的鑒定[8]。根據形態(tài)學的初步鑒定結果,合并菌落特征和細胞特征相同的類型,從每一種類型選取代表性菌株,共11株,進行后續(xù)的分子生物學鑒定。

    1.3.6 分子生物學鑒定

    酵母26SrDNAD1/D2區(qū)擴增正反向引物序列為[11]:NL1(正向引物):(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′);NL4(反向引物):(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)。

    反應體系:10ng/μL~1μg/μL模板DNA2μL;10μmol/L NL1和NL4各1 μL;2×EcoTaqPCR SuperMix(+dye)25 μL;最后添加ddH2O定容至50 μL。PCR擴增反應程序:95℃預變性5 min;94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸1 min 20 s,循環(huán)36次;72℃延伸8 min。取3 μL 上樣液點樣于1%的瓊脂糖凝膠(1×TAE緩沖液,提前加入10 000×GelStain核酸染料),在120 V電壓條件下電泳,電泳結果在C200凝膠成像儀下觀察并拍照。PCR產物送往武漢昆泰銳生物技術有限責任公司進行純化和測序。

    登錄http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進行同源序列搜索,運用Sequin軟件向Genbank提交序列。將11組供試菌株序列和下載的模式菌株序列用ClustalX2.0軟件進行序列比對,以假絲酵母屬的Candida zemplinina的26SrDNA D1/D2區(qū)序列為外群,用MEGA4.1軟件運用鄰接(Neighbor-Joining,N-J)法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,其中Boostrap值的計算根據1 000次隨機抽樣進行。

    2 結果與分析

    2.1 培養(yǎng)基的篩選

    按照各酒樣合適的稀釋倍數,在YPD培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基以及孟加拉紅培養(yǎng)基上接種酒樣,培養(yǎng)結果見表2。

    表2 3種培養(yǎng)基的培養(yǎng)結果Table 2 Culture results of 3 types of culture mediums

    續(xù)表

    由表2可知,平板1#、3#、4#、6#、7#、9#、10#、12#、13#、15#上菌落的出現時間早于平板2#、5#、8#、11#、14#。同一酒樣的相同稀釋倍數的接種液,平板1#、4#、7#、10#、13#上出現的菌落數最多,說明相比于其他兩種培養(yǎng)基,使用YPD培養(yǎng)基可以從病害葡萄酒中分離得到更多的酵母菌。平板11#上發(fā)現霉菌污染,平板3#、6#、9#、12#、15#上的菌落均被染色(對于計數影響不大,但是影響菌落觀察)。綜上,YPD培養(yǎng)基為本實驗培養(yǎng)酵母的最佳培養(yǎng)基。

    2.2 分離方法的比較

    用稀釋涂布法、傾注平板法和劃線法3種方法接種A1、A2和B1 3個酒樣于YPD培養(yǎng)基,培養(yǎng)結果見表3。

    表3 3種分離方法的培養(yǎng)結果Table 3 Culture results of 3 isolation methods

    由表3可知,平板21#、24#、27#上的菌落數均與真實值差距較大,其中,平板21#、27#上都未培養(yǎng)出菌落。這是由于使用劃線法接種時,接種環(huán)蘸取接種液的量較少,而酒樣中酵母含量低,所以酵母的接種量不能夠得到保證。稀釋涂布法相對于傾注平板法,更易形成均勻分布的單菌落,方便計數;平板19#、22#、25#上的菌落數分別多于平板20#、23#、26#,表明稀釋涂布法比傾注平板法的培養(yǎng)結果更接近于真實值。綜上,稀釋涂布法為本實驗最為理想的酒樣中酵母的分離方法。

    2.3 形態(tài)學鑒定結果

    通過WL培養(yǎng)基的培養(yǎng),對照顯微鏡下酵母細胞的形態(tài)特征與生殖類型,合并菌落特征和細胞特征相同的菌株,將23株酵母菌株初步分成4種類型,結果見表4。將表4的描述與張春芝等[8,12]的研究進行對比,可以初步認為,類型Ⅰ是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),類型Ⅱ是葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum),而類型Ⅲ和類型Ⅳ均未確定種。

    表4 WL培養(yǎng)基上酵母菌落特征和顯微鏡下酵母細胞特征的描述Table 4 Characteristic description of yeast colonies on WL culture medium and yeast cells under microscope

    2.4 PCR擴增與測序結果

    從每一種類型選取代表性菌株,共11株,進行分子生物學鑒定。11株代表性菌株PCR產物的電泳檢測見圖1。其中來自于類型Ⅰ的有:菌株A103、A104、A201、A304、B101;來自于類型Ⅱ的有:菌株B103、B201、B205;來自于類型Ⅲ的是菌株A303;來自于類型Ⅳ的有:菌株A202、A301。

    圖1 供試菌株26S rDNA D1/D2區(qū)PCR擴增結果Fig.1 Results of PCR amplification for 26S r DNA D1/D2 domain of tested strains

    由圖1可知,11株酵母菌株的擴增條帶均非常明顯,26S rDNA D1/D2區(qū)基因序列大小均落在570 bp左右,與目標片段大小相符,可以進行測序。

    經BLAST分析及序列相似性比較,Genbank中與供試菌株26S rDNA D1/D2區(qū)基因序列相似性最高的相關模式菌株見表5。由表5可知,供試菌株與模式菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)基因相似性均介于99%~100%,符合同種內不同菌株間該區(qū)間基因差異不超過1%的標準[13-14]。分子生物學鑒定結果表明,類型Ⅰ是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),類型Ⅱ是葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum),類型Ⅲ是乳酪隱球酵母(Cryptococcus friedmannii),類型Ⅳ為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

    表5 11株供試菌株與相應模式菌株的序列比對Table 5 Sequence comparison of 11 tested strains and corresponding type strains

    2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

    利用Mega4.1軟件構建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。由圖2可以看出,系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類結果與序列比對結果相一致,所有供試菌株均與其相應模式菌株聚為一枝,11株供試菌株共聚為2大主枝3個分枝。其中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)與葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)聚在一個主枝上,其bootstrap支持率為99%,具有很高的同源性。綜上,11株代表菌株分別歸屬于已知的3個不同的酵母屬和3個不同的酵母菌種群。

    圖2 11株供試菌株基于26S rDNA D1/D2區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 11 tested strains based on 26S rDNA D1/D2 domain gene

    2.6 討論

    CAVAZZA A等[15]發(fā)現,可以使用WL培養(yǎng)基來區(qū)分葡萄酒相關酵母的種類;ROMANCINO D P等[16]用WL培養(yǎng)基對意大利西西里島染菌葡萄醪中分離的酵母菌進行了形態(tài)學的鑒定,效果明顯。本實驗在鑒定酵母菌種的過程中,首先使用WL培養(yǎng)基進行酵母菌落的分類,并配合酵母細胞光學顯微鏡觀察進行形態(tài)學鑒定,共歸為4種類型,再從每一種類型挑選代表性菌株(共11株)進行分子生物學鑒定。此方法不需要對全部菌株都進行基因片段的PCR擴增和測序,因此具有一定的實用性。

    葡萄酒裝瓶以后,釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)能夠利用殘?zhí)窃俅螁影l(fā)酵[4]。因此,為防止殘?zhí)呛扛叩钠咸丫蒲b瓶后再發(fā)酵,灌裝之前要對葡萄酒進行嚴格的除菌處理。ROJAS V等[17-18]的研究表明,葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)能夠產生乙酸乙酯從而影響葡萄酒的風味。因此,在接種發(fā)酵啟動后,要盡快促使釀酒酵母占據優(yōu)勢,并合理使用SO2控制部分野生酵母的數量。一些隱球酵母屬(Cryptococcus)酵母也屬于葡萄酒敗壞性酵母[19-20],能夠使葡萄酒變黏稠[4]。本實驗從一款有焦化味并且酒液黏稠的葡萄酒樣品中分離獲得了乳酪隱球酵母(Cryptococcus friedmannii),而王曉昌等[12,21-22]均未從賀蘭山東麓葡萄酒產區(qū)分離出該種酵母。因此,本實驗發(fā)現的乳酪隱球酵母(Cryptococcus friedmannii)具有一定的研究價值。

    3 結論

    本實驗從賀蘭山東麓產區(qū)發(fā)生葡萄酒病害的5款酒樣中共分離鑒定出3種酵母:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)和乳酪隱球酵母(Cryptococcus friedmannii)。所使用的3種分離方法和3種培養(yǎng)基中,采用稀釋涂布法在YPD固體培養(yǎng)基上接種適當稀釋濃度的酒樣,于25~26℃條件下培養(yǎng)5~7d進行活菌計數效果最佳。結合使用WL培養(yǎng)基與細胞顯微鏡觀察的形態(tài)學分類方法和26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析的分子生物學方法來鑒定酵母菌種,結果可信度高。

    [1]楊潞芳,郭紅珍.葡萄酒釀造中的微生物及現代科學技術的應用和展望[J].山西食品工業(yè),2003(1):26-28.

    [2]李 棟.葡萄酒有害微生物的篩選鑒定及拜耳接合酵母培養(yǎng)條件的優(yōu)化與應用[D].烏魯木齊:新疆農業(yè)大學,2014.

    [3]RODRIGUEZ S B,THORNTON M A,THORNTON R J.Raman spectroscopy and chemometrics for identification and strain discrimination of the wine spoilage yeastsSaccharomyces cerevisiae,Zygosaccharomyces bailii,andBrettanomycesbruxellensis[J].Appl Environ Microbiol,2013,79(20):6264-6270.

    [4]張春暉,李 華.葡萄酒微生物學[M].西安:陜西人民出版社,2003:11-17.

    [5]王衛(wèi)國,胡曉偉.葡萄酒中多酚及多酚氧化酶研究現狀與展望[J].中國釀造,2017,36(8):16-19.

    [6]高曉航,李雪雁,孫春麗.賀蘭山東麓葡萄酒產區(qū)釀酒酵母的分離及其主要特性研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2016,42(6):62-66.

    [7]王志恒,劉雅琴,馮翠娥,等.賀蘭山東麓葡萄酒產區(qū)酵母生物多樣性研究進展[J].現代農業(yè)科技,2016,45(22):253-254,256.

    [8]張春芝,莫寅斌.寧夏產區(qū)釀酒葡萄酵母菌初步分類鑒定及多樣性研究[J].中國釀造,2014,33(10):49-54.

    [9]曹培鑫,馬 濤,楊凱迪,等.我國葡萄酒中布魯塞爾酒香酵母的檢測和鑒定[J].食品科學,2015,36(23):172-177.

    [10]王 華.葡萄酒分析檢驗[M].北京:中國農業(yè)出版社,2011:37-41.

    [11]任曉鏷,李明楊,陳勝慧子,等.慕薩萊思中乳酸菌分離及混菌培養(yǎng)對釀酒酵母乙醇發(fā)酵的影響[J].農業(yè)機械學報,2016(8):1-7.

    [12]王曉昌.寧夏賀蘭山東麓非釀酒酵母的分離鑒定與發(fā)酵特性研究[D].銀川:寧夏大學,2016.

    [13]KURTZMAN C P,ROBNETT C J.Identification and ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit(26S)ribosomal DNA partial sequences[J].Anton Leeuw,1998,73:331-371.

    [14]謝俊云,姚 笛,郭 瑜,等.貝達葡萄酒中酵母菌的分離鑒定[J].農產品加工,2016,15(1):19-21.

    [15]CAVAZZA A,GRANDO M S,ZINI C.Rilevazione della flora microbica di mosti e vini[J].Vignevini,1992,(9):17-20.

    [16]ROMANCINO D P,DI MAIO S,MURIELLA R,et al.Analysis of non-Saccharomycesyeast populations isolated from grape musts from Sicily(Italy)[J].J Appl Microbiol,2009,105(6):2248-2254.

    [17]ROJAS V,GIL J V,PI?AGA F,et al.Studies on acetate ester production by non-Saccharomyceswine yeasts[J].Int J Food Microbiol,2002,70(3):283-289.

    [18]MOREIRA N,MENDES F,GUEDES P,et al.Heavy sulphur compounds,higher alcohols and esters production profile ofHanseniaspora uvarumandHanseniaspora guilliermondiigrown as pure and mixed culturesingrapemust[J].Int J Food Microbiol,2008,124(3):231-238.

    [19]ENRIQUE M,MARCOS J F,YUSTE M,et al.Antimicrobial action of synthetic peptides towards wine spoilage yeasts[J].Int J Food Microbiol,2007,118(3):318-325.

    [20]ENRIQUE M,IBANEZ A,MARCOS J F,et al.Beta-glucanases as a tool for the control of wine spoilage yeasts[J].J Food Sci,2010,75(1):41-45.

    [21]劉愛國,劉延琳,王澤舉,等.寧夏葡萄自然發(fā)酵過程中酵母菌的分子生物學鑒定[J].西北農林科技大學學報:自然科學版,2008,36(11):203-207.

    [22]王國平,宋育陽,裴穎芳,等.寧夏御馬葡萄酒廠野生酵母菌株的分離篩選及分子鑒定[J].中國釀造,2009,28(8):38-41.

    Isolation and identification of yeasts related to wine spoilage

    ZHANG Zhong1,GU Peiwen1,ZHANG Junxiang1,2*,JIN Gang2
    (1.School of Agriculture,Ningxia University,Yinchuan 750021,China;2.School of Wine,Ningxia University,Yinchuan 750021,China)

    Using 3 culture mediums and 3 isolation methods,23 yeast strains were isolated from 5 spoiled wine samples collected from Helan Mountain East Wine Region.These yeast strains were initially classified into 4 cultured types based on morphological identification.The sequence analysis for 26S rDNA D1/D2 domain gene showed that representative strains from these 4 cultured types belonged to 3 genus and 3 species:Saccharomyces cerevisiae,Hanseniaspora uvarumandCryptococcus friedmannii.

    wine spoilage;yeast;morphological identification;26S rDNA D1/D2

    TS261.1

    0254-5071(2017)10-0056-05

    10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.013

    2017-04-11

    寧夏自治區(qū)“十三五”重大科技項目(2016BZ06)

    張 眾(1995-),男,碩士研究生,研究方向為葡萄與葡萄酒工程。

    *通訊作者:張軍翔(1971-),男,教授,博士,研究方向為葡萄栽培和葡萄酒釀造。

    猜你喜歡
    酒樣酵母菌葡萄酒
    膜孔徑及過濾條件對濃香型白酒過濾效果研究
    中國釀造(2023年10期)2023-11-06 09:05:16
    超高壓處理對低醇沙棘蜂蜜酒品質的影響
    自制的葡萄酒為啥愛“上頭”?
    為什么酵母菌既能做面包也能釀酒?
    避雨栽培對“桂葡6號”葡萄酒花色苷組成及含量的影響
    十款葡萄酒與十塊石頭
    收藏界(2018年3期)2018-10-10 05:34:08
    法國葡萄酒何以譽滿天下
    中國商界(2017年4期)2017-05-17 04:36:48
    讓面包變“胖”的酵母菌
    利用Zeta電位分析蝎酒穩(wěn)定性
    中國釀造(2015年7期)2015-04-12 09:35:56
    蜂蜜中耐高滲透壓酵母菌的分離與鑒定
    成人漫画全彩无遮挡| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产成人aa在线观看| av女优亚洲男人天堂| 亚洲人与动物交配视频| 免费看av在线观看网站| 国产久久久一区二区三区| 一级毛片aaaaaa免费看小| 大陆偷拍与自拍| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲av福利一区| videossex国产| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美高清成人免费视频www| 寂寞人妻少妇视频99o| 免费av毛片视频| 免费观看无遮挡的男女| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产成人freesex在线| 久久久午夜欧美精品| 床上黄色一级片| 日本欧美国产在线视频| 国产综合懂色| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 欧美bdsm另类| 一区二区三区免费毛片| 国产大屁股一区二区在线视频| 伦理电影大哥的女人| 久久国产乱子免费精品| 卡戴珊不雅视频在线播放| 女人被狂操c到高潮| 91精品一卡2卡3卡4卡| 身体一侧抽搐| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲在线观看片| 九九在线视频观看精品| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久久久久九九精品二区国产| av免费在线看不卡| 97在线视频观看| 欧美另类一区| 欧美丝袜亚洲另类| 嫩草影院入口| 美女内射精品一级片tv| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 免费黄色在线免费观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产成人一区二区在线| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产成人精品久久久久久| 中文字幕av成人在线电影| 精华霜和精华液先用哪个| 激情 狠狠 欧美| 大香蕉97超碰在线| 欧美高清性xxxxhd video| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产亚洲最大av| 午夜爱爱视频在线播放| 精品国内亚洲2022精品成人| 蜜臀久久99精品久久宅男| av一本久久久久| 最近2019中文字幕mv第一页| 人妻一区二区av| 国产av在哪里看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 最近的中文字幕免费完整| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲色图av天堂| 精品一区二区三卡| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲一区高清亚洲精品| 又爽又黄a免费视频| a级一级毛片免费在线观看| 国产黄片美女视频| 精品午夜福利在线看| 大香蕉97超碰在线| 国产伦精品一区二区三区四那| 男的添女的下面高潮视频| 国国产精品蜜臀av免费| 久热久热在线精品观看| 精品不卡国产一区二区三区| 久久久国产一区二区| av女优亚洲男人天堂| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日韩一本色道免费dvd| 搡老乐熟女国产| 国产乱来视频区| 尾随美女入室| 久久久成人免费电影| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产高清三级在线| 永久免费av网站大全| 少妇的逼好多水| 久99久视频精品免费| 国产淫语在线视频| av国产免费在线观看| 久久韩国三级中文字幕| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲自拍偷在线| 一夜夜www| 中文字幕免费在线视频6| 一个人看的www免费观看视频| 99久久精品热视频| 最近的中文字幕免费完整| 尾随美女入室| 久久99热这里只有精品18| 日韩欧美精品免费久久| 国产精品人妻久久久久久| 国产亚洲5aaaaa淫片| 一级毛片久久久久久久久女| 九九爱精品视频在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲欧洲日产国产| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 精品少妇黑人巨大在线播放| 看非洲黑人一级黄片| 97热精品久久久久久| 天堂网av新在线| 午夜福利高清视频| 成人午夜高清在线视频| 国产一区有黄有色的免费视频 | 亚洲18禁久久av| 久久久久网色| 在线播放无遮挡| 久久国产乱子免费精品| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产综合懂色| 国产精品福利在线免费观看| 午夜老司机福利剧场| 免费观看精品视频网站| 欧美日韩精品成人综合77777| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 九九爱精品视频在线观看| 全区人妻精品视频| 搡老乐熟女国产| 女的被弄到高潮叫床怎么办| av在线蜜桃| 男女国产视频网站| 欧美日韩亚洲高清精品| 精品熟女少妇av免费看| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产探花在线观看一区二区| 国产三级在线视频| 性色avwww在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 午夜福利在线在线| 午夜免费激情av| 成年女人在线观看亚洲视频 | 一级二级三级毛片免费看| 欧美 日韩 精品 国产| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲内射少妇av| 亚洲一区高清亚洲精品| 国内精品美女久久久久久| 精品一区在线观看国产| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 久久综合国产亚洲精品| 色哟哟·www| 国产亚洲一区二区精品| 天堂中文最新版在线下载 | 国产免费视频播放在线视频 | 嫩草影院精品99| 久久久久久久大尺度免费视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 精品久久久久久成人av| 男女边摸边吃奶| 日本爱情动作片www.在线观看| videos熟女内射| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 边亲边吃奶的免费视频| 在线观看免费高清a一片| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产乱人视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| av在线亚洲专区| 精品一区二区免费观看| a级毛色黄片| 免费av不卡在线播放| 国产成人精品婷婷| 亚洲精品国产av蜜桃| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产精品女同一区二区软件| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲乱码一区二区免费版| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 日韩欧美一区视频在线观看 | 国产一区有黄有色的免费视频 | 国产精品一区www在线观看| 特级一级黄色大片| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产乱来视频区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 床上黄色一级片| 午夜精品国产一区二区电影 | 91av网一区二区| 国产亚洲精品久久久com| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲国产av新网站| 国产一级毛片在线| 国产成人精品久久久久久| 搡老妇女老女人老熟妇| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲av免费在线观看| 国产乱来视频区| 精品国产露脸久久av麻豆 | 国产免费又黄又爽又色| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲最大成人手机在线| 大香蕉久久网| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲国产成人一精品久久久| 午夜日本视频在线| 一本一本综合久久| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 色哟哟·www| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 久久草成人影院| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 九色成人免费人妻av| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美潮喷喷水| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产成人福利小说| 99热全是精品| 18+在线观看网站| 日本与韩国留学比较| 视频中文字幕在线观看| 嘟嘟电影网在线观看| 国内精品一区二区在线观看| 久久99热这里只有精品18| 亚洲最大成人手机在线| 成人美女网站在线观看视频| av线在线观看网站| 不卡视频在线观看欧美| av免费观看日本| 成人午夜高清在线视频| 又爽又黄a免费视频| 成人毛片60女人毛片免费| 日韩三级伦理在线观看| 老司机影院成人| 免费观看精品视频网站| 久久精品人妻少妇| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲精品成人久久久久久| 乱系列少妇在线播放| 亚洲欧美日韩东京热| 久久久久久国产a免费观看| 日日啪夜夜爽| 亚洲欧洲国产日韩| 免费看av在线观看网站| av在线观看视频网站免费| 禁无遮挡网站| .国产精品久久| 搡老乐熟女国产| 亚洲人成网站高清观看| 99热网站在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 久久99精品国语久久久| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲av日韩在线播放| 丝袜美腿在线中文| 99re6热这里在线精品视频| 国产精品三级大全| 成人美女网站在线观看视频| 高清日韩中文字幕在线| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲精品国产成人久久av| 国产成人a区在线观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 91aial.com中文字幕在线观看| 成人性生交大片免费视频hd| 精品一区二区三区人妻视频| 一本久久精品| 伦理电影大哥的女人| 深爱激情五月婷婷| 国产精品人妻久久久久久| 国产成人精品婷婷| 日韩视频在线欧美| 精品午夜福利在线看| 亚洲精品一区蜜桃| 搡女人真爽免费视频火全软件| 人妻系列 视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 日韩欧美精品免费久久| 国产老妇女一区| 免费观看性生交大片5| 18+在线观看网站| 天堂√8在线中文| 伊人久久国产一区二区| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲美女搞黄在线观看| 热99在线观看视频| 久久久亚洲精品成人影院| 久久久久九九精品影院| 久久久久久久久久人人人人人人| 卡戴珊不雅视频在线播放| 99re6热这里在线精品视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产成人精品一,二区| 亚洲av成人精品一二三区| 成人鲁丝片一二三区免费| 午夜日本视频在线| 99热全是精品| 国产亚洲5aaaaa淫片| 最近2019中文字幕mv第一页| 最近中文字幕2019免费版| 国产免费视频播放在线视频 | 一级a做视频免费观看| 亚洲国产精品国产精品| 国产伦精品一区二区三区视频9| 美女高潮的动态| 1000部很黄的大片| 成人性生交大片免费视频hd| 国产精品综合久久久久久久免费| 精品人妻熟女av久视频| 久久精品人妻少妇| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲欧美精品专区久久| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久久久网色| 国产爱豆传媒在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 午夜福利高清视频| 97精品久久久久久久久久精品| 边亲边吃奶的免费视频| 国产成人aa在线观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 在线天堂最新版资源| 一级毛片我不卡| 免费av不卡在线播放| 国产精品久久久久久av不卡| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久韩国三级中文字幕| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 男女视频在线观看网站免费| 老司机影院毛片| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 岛国毛片在线播放| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产精品.久久久| 国精品久久久久久国模美| 天天一区二区日本电影三级| 91在线精品国自产拍蜜月| 99re6热这里在线精品视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 日韩成人伦理影院| 日本免费a在线| 在线播放无遮挡| 最近视频中文字幕2019在线8| 波多野结衣巨乳人妻| 久久久精品94久久精品| 91精品一卡2卡3卡4卡| 最近视频中文字幕2019在线8| 97超碰精品成人国产| 中国国产av一级| 色5月婷婷丁香| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 尾随美女入室| 久久99热这里只频精品6学生| 日韩国内少妇激情av| 91在线精品国自产拍蜜月| 九草在线视频观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产精品一区二区在线观看99 | 欧美人与善性xxx| 最近视频中文字幕2019在线8| 中国美白少妇内射xxxbb| 欧美一区二区亚洲| 亚洲欧美日韩东京热| 成人午夜高清在线视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产亚洲精品久久久com| 寂寞人妻少妇视频99o| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 久久久久久久久久黄片| 久久久a久久爽久久v久久| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 欧美潮喷喷水| 一级二级三级毛片免费看| 欧美+日韩+精品| 超碰av人人做人人爽久久| 免费看光身美女| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久久久国产网址| 午夜老司机福利剧场| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲人与动物交配视频| 欧美日韩在线观看h| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 欧美成人午夜免费资源| 一级毛片 在线播放| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 国产伦理片在线播放av一区| 成人午夜高清在线视频| 人体艺术视频欧美日本| 简卡轻食公司| 国产精品综合久久久久久久免费| 插阴视频在线观看视频| 国产色婷婷99| 97超碰精品成人国产| xxx大片免费视频| 国产一级毛片在线| av在线蜜桃| 91在线精品国自产拍蜜月| 中文资源天堂在线| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲久久久久久中文字幕| 久久99精品国语久久久| 一区二区三区乱码不卡18| 国产伦在线观看视频一区| 高清av免费在线| 乱码一卡2卡4卡精品| 男女下面进入的视频免费午夜| 精品人妻熟女av久视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 精品午夜福利在线看| 成人亚洲精品av一区二区| 男人舔奶头视频| 亚洲四区av| 三级国产精品欧美在线观看| 97精品久久久久久久久久精品| 黄片无遮挡物在线观看| 久久久久久久久久久丰满| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产午夜精品论理片| 偷拍熟女少妇极品色| 久久鲁丝午夜福利片| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲人与动物交配视频| 日本午夜av视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 午夜激情久久久久久久| 国产精品不卡视频一区二区| 国产av国产精品国产| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 秋霞在线观看毛片| 亚洲自拍偷在线| 高清毛片免费看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美激情在线99| 国产av码专区亚洲av| 精品一区二区三区视频在线| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 极品教师在线视频| 亚洲精品乱久久久久久| 97超碰精品成人国产| 免费观看无遮挡的男女| 大话2 男鬼变身卡| 久久精品久久久久久久性| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 99热这里只有是精品50| 舔av片在线| 九草在线视频观看| 午夜精品在线福利| 国产极品天堂在线| 亚洲久久久久久中文字幕| 五月玫瑰六月丁香| 色5月婷婷丁香| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 免费看av在线观看网站| 色综合亚洲欧美另类图片| 成人综合一区亚洲| 亚洲av一区综合| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲国产色片| 久久国产乱子免费精品| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 亚洲色图av天堂| 国产精品熟女久久久久浪| 午夜日本视频在线| 国产久久久一区二区三区| 高清av免费在线| 亚洲在久久综合| 午夜免费激情av| 国产黄色免费在线视频| 99久久人妻综合| 免费人成在线观看视频色| 国产精品精品国产色婷婷| 日本熟妇午夜| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲精品,欧美精品| 内地一区二区视频在线| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 精品少妇黑人巨大在线播放| 毛片女人毛片| 久久99精品国语久久久| 午夜久久久久精精品| 国产亚洲最大av| 成人亚洲精品一区在线观看 | 夫妻午夜视频| 大香蕉久久网| 国产人妻一区二区三区在| 免费观看a级毛片全部| 乱码一卡2卡4卡精品| 激情 狠狠 欧美| 波野结衣二区三区在线| 成人av在线播放网站| 日韩中字成人| 成人一区二区视频在线观看| 免费观看无遮挡的男女| ponron亚洲| 午夜福利成人在线免费观看| 2018国产大陆天天弄谢| 日本熟妇午夜| 国产淫片久久久久久久久| 日本午夜av视频| 国产色婷婷99| 国精品久久久久久国模美| 两个人的视频大全免费| 午夜精品国产一区二区电影 | 校园人妻丝袜中文字幕| 日本黄大片高清| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲av.av天堂| 少妇的逼水好多| 国产成人a∨麻豆精品| 精品人妻偷拍中文字幕| 99热这里只有精品一区| 久久久精品94久久精品| 波野结衣二区三区在线| 久久久久性生活片| 99热网站在线观看| 91狼人影院| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲精品成人久久久久久| 啦啦啦韩国在线观看视频| 一夜夜www| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲国产欧美人成| 波野结衣二区三区在线| 国产乱来视频区| 日韩大片免费观看网站| 欧美人与善性xxx| 一本一本综合久久| 看非洲黑人一级黄片| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久韩国三级中文字幕| 神马国产精品三级电影在线观看| 天堂影院成人在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲电影在线观看av| 国产v大片淫在线免费观看| 国产成人福利小说| 亚洲av二区三区四区| 最近的中文字幕免费完整| 国产成人91sexporn| 中文资源天堂在线| 国产精品熟女久久久久浪| 久久精品国产自在天天线| 午夜视频国产福利| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 中文欧美无线码| 亚洲三级黄色毛片| 六月丁香七月| 亚洲真实伦在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 在线观看人妻少妇| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 成年女人看的毛片在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 97在线视频观看| 人体艺术视频欧美日本| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲国产欧美人成| 精品国产露脸久久av麻豆 | 婷婷色麻豆天堂久久| 男女那种视频在线观看| 69人妻影院| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产大屁股一区二区在线视频| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久热精品热| 国产 一区 欧美 日韩| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 男女啪啪激烈高潮av片| 精品久久久久久久久久久久久| 成人漫画全彩无遮挡| 1000部很黄的大片| 国产乱人偷精品视频| 深爱激情五月婷婷| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产久久久一区二区三区| 免费大片18禁| 久久久久久九九精品二区国产| 乱码一卡2卡4卡精品| 成人午夜高清在线视频| 国产精品国产三级专区第一集| 日韩视频在线欧美| 久久午夜福利片| av免费观看日本| 国产又色又爽无遮挡免|