五味子中殘留農(nóng)藥對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的毒性研究

姜丹丹，朗 朗，季宇彬

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱150076；2.國家教育部 抗腫瘤藥物工程研究中心，哈爾濱150076)

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis (Turcz.) Baill 的干燥成熟果實(shí).主產(chǎn)于黑龍江、遼寧、吉林、河北等地.其性酸、甘、溫，歸肺、心、腎經(jīng)，具有斂肺生津、補(bǔ)腎養(yǎng)心、收斂固澀之功效，主治久嗽虛喘、夢(mèng)遺滑精、心悸失眠等[1]，是常用中藥 .但由于在種植保存過程中施用大量農(nóng)藥，造成農(nóng)藥殘留，對(duì)中藥的開發(fā)利用產(chǎn)生限制，有研究人員針對(duì)不同地區(qū)的不同種類的中草藥進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)均有不同程度的農(nóng)藥殘留，對(duì)人體健康存在著潛在危害[2-4].

顆粒細(xì)胞是組成成熟卵泡的最大細(xì)胞群，為卵母細(xì)胞的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)，維持有利于卵母細(xì)胞生長和成熟的微環(huán)境[5]，并且是雌激素和孕激素的主要來源，只有顆粒細(xì)胞正常發(fā)育，才能保證卵母細(xì)胞成熟、卵泡發(fā)育.因此本實(shí)驗(yàn)選擇顆粒細(xì)胞作為殘留農(nóng)藥毒性研究的靶細(xì)胞，希望通過MTT和Western blot法對(duì)殘留農(nóng)藥的生殖毒性及其機(jī)制進(jìn)行研究，進(jìn)而明晰殘留農(nóng)藥的生殖危害，同時(shí)也為中藥種植中農(nóng)藥的使用提供警示.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

2周齡SPF級(jí)雌性小鼠，由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供.(生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK黑2008001)

1.2 藥物

中藥材樣品來源于大慶市讓湖路區(qū)銀浪江業(yè)中藥材種植合作社.實(shí)驗(yàn)通過超聲萃取的方法從五味子中提取出殘留農(nóng)藥.

1.3 主要儀器和試劑

CO2培養(yǎng)箱CO-150型(美國新布朗什維克科學(xué)公司)；超凈工作臺(tái)DL-CJ-1N醫(yī)用型(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；Anke TDL 80-2 B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Model 680 酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；高速低溫離心機(jī)(美國Beckman-Coulter公司)；電泳儀、垂直電泳轉(zhuǎn)印槽(Bio-Rad公司)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；雌二醇(大連美侖生物技術(shù)公司)；兔抗ERK、p-ERK多克隆抗體、堿磷酶標(biāo)記羊抗兔IgG(北京中杉金橋)；兔抗Actin多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；Western及IP細(xì)胞裂解液、堿磷酶顯色試劑盒(碧云天公司).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 卵巢顆粒細(xì)胞的分離

取潔凈級(jí)的雌性小鼠，腹腔注射孕馬血清30 u/只，24 h后頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡消毒.“V”字形切口剪開腹部皮膚，取出雙側(cè)卵巢，放入預(yù)冷的PBS中，去除其周圍的脂肪組織及表面包膜，放入新的PBS的培養(yǎng)皿中反復(fù)沖洗.將所有卵巢小心移入無菌的10 mL離心管中，加10倍于卵巢體積的0.2%胰蛋白酶- 0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)混合液，于37 ℃水浴消化30～50 min，期間從水浴鍋中取出用力振蕩2～3次，直至卵巢消化為絮狀懸浮，顆粒細(xì)胞團(tuán)塊分離為止.加入同等體積含有15%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化.1 000 r/min離心5 min，棄上清.收集的細(xì)胞加入5 mL含15%胎牛血清、5%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于玻璃培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱(5% CO2，37 ℃)中培養(yǎng).

2.2 MTT法檢測卵巢顆粒細(xì)胞活力

實(shí)驗(yàn)所分離提取的卵巢顆粒細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，加入適量的含15%血清及100 u/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基稀釋至5×104個(gè)/mL，然后按每孔5 000個(gè)接種于96孔板內(nèi)，放入含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細(xì)胞培養(yǎng)48 h后每孔給藥100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，吸凈每孔內(nèi)殘留的藥液，加入MTT培養(yǎng)2.5～4 h，吸凈MTT液，每孔加入150 μL DMSO溶解甲簪沉淀，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測各孔的光密度值(OD值).用下面公式計(jì)算作用物質(zhì)的細(xì)胞增殖率：

(1)

實(shí)驗(yàn)分組：1)陰性對(duì)照組(體積分?jǐn)?shù)0.1%正己烷)作用24、48、72 h；2)農(nóng)藥提取物(pesticide extract)作用24、48、72 h；3)陽性對(duì)照組(17β- E2)作用24、48、72 h，給藥濃度為1×10-8mol/L.

2.3 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測農(nóng)藥提取物對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞ERK，p-ERK蛋白表達(dá)水平的影響

提取分離的顆粒細(xì)胞，每瓶加入80 μL的細(xì)胞裂解液，于冰上裂解30 min，收集細(xì)胞至 EP 管.放入離心機(jī) 4 ℃、12 000 r /min，離心 10 min，取上清，根據(jù)蛋白含量測定上樣量.12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后將膠中的蛋白通過電轉(zhuǎn)槽轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，TBST 緩沖液振蕩洗滌3次，每次10 min，分別加入ERK，p-ERK過夜(4 ℃) ，TBST 緩沖液振蕩洗滌，加入堿磷酶標(biāo)記山羊抗兔IgG室溫孵育2 h，經(jīng)TBST 緩沖液振蕩洗滌后，用堿性磷酸酶顯色緩沖液室溫避光顯色，Tannon凝膠成像系統(tǒng)照相.掃描圖像在天能GIS凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行量化分析.

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

蛋白相對(duì)密度(Relative Density)

(2)

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 MTT法比較農(nóng)藥提取物對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞作用24、48、72 h增殖率的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥提取物作用24、48、72 h均可促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖(見圖1).其中農(nóng)藥提取物作用48 h卵巢顆粒細(xì)胞增殖率為124.8%，其結(jié)果與陰性對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01).農(nóng)藥提取物作用卵巢顆粒細(xì)胞24 h和72 h增殖率分別為117.7%、114.6%與陰性對(duì)照組比較有顯著性(P<0.05).

圖1 農(nóng)藥提取物對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞增殖率的影響注：與陰性對(duì)照組比較 *P<0.05 **P<0.01

4.2 Western Blot法檢測農(nóng)藥提取物對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞中ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平的影響

Western Blot法檢測農(nóng)藥提取物及陽性對(duì)照E2作用卵巢顆粒細(xì)胞48 h后ERK1/2蛋白表達(dá)水平的改變，結(jié)果如圖2所示，內(nèi)參蛋白β-actin條帶灰度基本一致，陰性對(duì)照組正己烷表達(dá)率為(51.0±2.22)%，(54.3±2.12)%， 陽性藥E2組表達(dá)率為(70.7±1.78)%，(72.5±2.89)%，農(nóng)藥提取物組 (90.2±2)%，(92.6±2.44)%.由此可見農(nóng)藥提取物可以顯著促進(jìn)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)ERK1/2蛋白表達(dá)(P<0.01).陰性對(duì)照組p-ERK1/2蛋白表達(dá)率為(40.4±2.0)%，(41.9±2.22)%， E2組(67.9±2.67)%，(71.0±1.78)%，提取物組 (95.2±3.30)%，(99.1±1.66)%，由此可見農(nóng)藥提取物組會(huì)顯著促進(jìn)p-ERK1/2蛋白表達(dá)，與陰性對(duì)照相比差異極顯著(P<0.01).

圖2 農(nóng)藥提取物和對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞中ERK1/2及 p- ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

5 討 論

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)是MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路中最具有代表性、研究最透徹的途徑之一，其為Raf-MEK-ERK途徑[6].ERK1/2受到細(xì)胞外的刺激而活化，激活ERK的標(biāo)志是 ERK 活化成p-ERK，然后p-ERK激活轉(zhuǎn)錄因子和一些絲氨酸/蘇氨酸激酶，并且具有特異性.激活的ERK主要是抑制細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和維持細(xì)胞存活[7-9].

農(nóng)藥提取物在誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞增殖過程中，ERK1/2通路處于激活狀態(tài)，同時(shí)促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞中磷酸化ERK1/2的表達(dá).該結(jié)果說明，ERK1/2激活是提取物促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖的分子機(jī)制之一.提示殘留農(nóng)藥促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的增殖作用與ERK途徑有關(guān)，而ERK1/2蛋白在防止分化和維持生殖細(xì)胞增殖潛能中起著重要作用，因此推斷殘留農(nóng)藥對(duì)顆粒細(xì)胞的增殖具有維持作用.細(xì)胞內(nèi)許多信號(hào)通路均能激活ERK通路，使ERK蛋白磷酸化，因此對(duì)于殘留農(nóng)藥ERK的激活還需進(jìn)一步研究.

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