響應曲面法優(yōu)化雞冠中透明質酸提取工藝條件

郭瑞琳,王 鑫，孟 穎，魏 靜，許丹丹，宋天雪

(哈爾濱商業(yè)大學 食品工程學院省高校食品科學與工程重點實驗室， 哈爾濱 150076)

透明質酸(Hyaluronic acid ,HA)是由N乙酰葡糖胺與D葡糖醛酸組成的黏多糖，是由肝間質細胞的儲脂細胞合成、并通過肝內皮細胞特異的透明質酸酶水解的多聚長鏈化合物[1-2].透明質酸分子在空間上呈剛性無規(guī)則卷曲的螺旋柱狀結構，由于其流體力學特點使透明質酸有高度黏彈性，良好的可塑性保濕性以及生物相容性，因此透明質酸既可以作為化妝品原料又可用于制作功能性食品，在美容手術及醫(yī)藥領域同樣發(fā)揮著重要作用，有著良好的發(fā)展前景[3-6].在人體和動物的機體組織及細胞基質中，透明質酸結合著膠原、纖黏連蛋白，顯示出多種重要的生理功能，例如對細胞運動、增殖、分化和穩(wěn)定細胞與組織的表現型等，均有重要作用[7].基于其特殊的保水性，可以維持自身千倍的水分子，使透明質酸擁有良好的保濕性，在皮膚的真皮和表皮之間發(fā)揮著特殊的生理作用，防止膠原蛋白失水硬化，從而使肌膚維持柔嫩，延緩衰老，除此之外，透明質酸還可以供給肌膚營養(yǎng)，加速受傷肌膚的愈合速度.透明質酸還可以清除體內由于紫外線照射產生的氧自由基，從而減慢機體衰老進程，防止產生炎癥，增強機體免疫力[8-9].近年來國內外對透明質酸保健食品進行了深入研究，發(fā)現透明質酸分子質量不同對機體吸收能力也不同，機體對大分子質量的透明質酸消化和吸收效果較差，食用降解后的小分子會在機體內合成為大分子質量的透明質酸，進而發(fā)揮其重要作用[10-11].

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞冠 市售，標準透明質酸 上海源葉生物科技有限公司，丙酮 天津市天新精細化工開發(fā)中心，正丁醇 天津市福晨化工試劑廠，氯仿 天津市天新精細化工開發(fā)中心，無水乙醇 天津市天力化學試劑有限公司，氯化鈉 天津市北方醫(yī)化學試劑廠.

TU-1900 紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；FZ102微型植物粉碎機、R-205 旋轉蒸發(fā)器 上海申勝生物技術有限公司； SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 浸泡

稱取20 g新鮮雞冠5份，用乙醇溶液浸泡雞冠至變硬并置于干燥箱中干燥，干燥后用植物型粉碎機將其粉碎.向粉碎的雞冠粉末加入6倍的去離子水于燒杯中，攪拌后靜置浸泡過夜.

1.2.2 除脂肪、蛋白

10%的固體氯化鈉加入濾液中，玻璃棒攪拌至氯化鈉完全溶解，加入等體積的氯仿、正丁醇溶液(氯仿∶正丁醇為4∶1)于分液漏斗中，攪拌3 h，取上層水相待用.以透明質酸得率作為檢測指標選擇最佳預處理溶液.

1.2.3 HA的單因素條件選擇

1)乙醇體積分數單因素實驗

量取5份預處理溶液，每份40 mL.將預處理的溶液按料液比1∶2 (g/mL)浸于80 %、85 %、90 %、95 %和100 %的乙醇溶液中，干燥24 h后沉淀物為HA粗品，計算HA得率，確定最佳乙醇體積分數.

2)料液比單因素實驗

量取5份預處理溶液，每份40 mL.將預處理的溶液按料液比1∶1、2∶3、1∶2、2∶5和1∶3 (g/mL)加入90 %乙醇溶液中，干燥24 h后沉淀物為HA粗品，計算HA得率，確定最佳乙醇體積分數.

3)靜置時間單因素實驗

量取5份預處理溶液，每份40 mL.將預處理的溶液按料液比1∶2 (g/mL)加入90 %乙醇中，二者混合分別靜置沉淀22、24、26、28、30 h，干燥后沉淀物即為HA粗品.計算HA得率，確定最佳乙醇體積分數.

1.2.4 HA最佳工藝條件的選擇

對乙醇浸泡雞冠實驗進行響應面設計，選取以下三因素為優(yōu)化自變量，根據Box-BenhnKen的中心組合試驗設計原理，綜合單因素結果，設計三元二次回歸正交旋轉組合的響應面分析試驗.見表1.

表1因素水平表

因素代碼編碼水平編碼值真實值-101時間/ hx1 X1242628料液比/ (g·mL-1)x2 X22∶32∶42∶5 乙醇體積分數/ %x3 X3859095

注：編碼值與真實值之間的關系為：x1=(X1-3)/1；x2=(X2-1.3)/0.1；x3=(X3-6)/1.

1.2.5 定性定量分析實驗

1)HA得率的測定

其中：W為HA得率，%；m為HA粗品量，g；M為雞冠干粉，g.

2) 驗證實驗

量取20 mL濾液，以乙醇作為提取溶劑，根據響應曲面法優(yōu)化雞冠中HA提取的最優(yōu)工藝條件，進行3次平行實驗.

3) HA 定性分析試驗

通過UV在OD值190～400 nm范圍內掃描HA標準品及提取物，根據吸收峰來確定最大吸收波長，進而比較HA標品與樣品圖譜的出峰位置及峰形是否一致.

2 結果與討論

2.1 提取HA單因素結果與分析

2.1.1 乙醇體積分數單因素的選擇結果與分析

由圖1可知，隨著乙醇體積分數的增加HA得率有所增加，當乙醇體積分數為90%時，HA得率達到最高點，繼續(xù)提高乙醇體積分數，HA得率呈現緩慢下降的趨勢.由于HA具有高水溶性，乙醇具有價格低廉、無毒無害，并且有較好的吸水性，所以使用乙醇對其進行沉淀，隨著乙醇體積分數的增大其吸水性增強，HA的得率增高，但乙醇體積分數達到90%時吸水達到飽和，所以隨著乙醇體積分數大于90% HA的得率逐漸降低.因此，確定最佳提取乙醇體積分數為90%.

圖1 乙醇體積分數對HA得率的影響

2.1.2 料液比單因素的選擇結果與分析

由圖2可知，料液比較小時HA的產量增加并不明顯，但是隨著料液比的增加HA的得率有了明顯的增高，這是由于隨著固相與液相比例加大時二者的接觸面積增大，使反應充分固相內物質得到有效釋放，且由于物料充足反應速度也大大提高，此時的實驗結果也最為明顯即為圖中料液比為2∶1點所示，HA得率達到最高值.隨后，隨著料液比的繼續(xù)增大HA的得率反而隨之減少，出現這種現象的原因是由于隨著液相高于固相過多導致反應產生的HA被多余的乙醇浸泡抑制了反應的進行，反應速率及產量都受到影響.隨著料液比增大HA得率出現嚴重下滑趨勢.可見再增加更多的乙醇并沒有提高HA的得率反而析出多余的雜質影響試驗準確性并增加了試驗成本.因此，確定最佳提取料液比為1∶2.

圖2 料液比對HA得率的影響

2.1.3 沉淀時間單因素的選擇結果與分析

由圖3可知，隨著反應時間的延長HA得率不斷增大.由于隨著反應時間增加，溶質在溶劑中得到充分溶解，使反應完全，當溶出的物質達到一定體積分數時反應趨于平衡，如果繼續(xù)增加反應時間則會使析出物質被溶解，導致HA得率下降.當反應時間較短時，HA產量呈現明顯上升趨勢；隨著反應時間的增加，HA產量上升趨勢逐漸減小，在沉淀時間26 h時HA產量達到最高點，若繼續(xù)延長時間，HA提取產量不在上升，并且呈下降趨勢.由此看出，靜置時間是影響HA得率的重要因素之一.但需要注意的是靜置時間過長也可能使HA的結構發(fā)生變化，生物活性遭到到破壞，其中的有效成分不再被溶解，與此同時雜質溶出的量也隨之增多，使實驗誤差增大.因此，當沉淀時間26 h，沉淀效果最佳.

圖3 時間對HA得率的影響

2.2 響應曲面優(yōu)化透明質酸提取工藝條件結果與分析

響應曲面二次多項式回歸模型設計及試驗結果見表2.

表2試驗結果表

組別時間/ h料液比/ (g·mL-1)乙醇體積分數/ %HA得率/ %1234567891011121314151617-1 1 0110000 -10-11-10000 -10 1001000-110-110-1-1 0001 0100110-10-10-124.6323.8927.4524.4824.1227.4525.2627.4527.4525.2623.4724.8925.1924.1324.6927.4525.12

乙醇浸泡法提取雞冠中HA的試驗結果見表3.利用Design Expert 7.1.3軟件對表的試驗數據進行優(yōu)化，獲得乙醇沉淀法提取雞冠中HA得率對提取時間(x1)、料液比(x2)和乙醇體積分數(x3)的二次多項方程為：

Y=27.45-0.15x1+0.34x2-0.19x3-0.043x1x2-0.43x1x3-0.56x2x3-1.47x12-1.63x22-1.18x32

其中：Y為雞冠中HA的提取率；x1為提取時間,min；x2為料液比, g/mL；x3為乙醇體積分數，%.

由表3可知，本試驗所建立的模型非常顯著(P<0.000 1).該模型中僅有變異約為0.09%不能通過此模型來解釋；相關系數為R=0.9984，該模型擬合程度非常好，試驗產生的誤差小，該模型是適用的.

表3模型方差分析表

變異源平方和自由度均方和F值P值模型失擬項純誤差總和32.560.0520.00032.61934163.620.0170.000488.69<0.0001R=0.998 4,R2=0.996 4,R2Adj=0.999 1

表4回歸方程系數顯著性檢驗表

系數估計自由度標準差平方和F值P值模型x1x 2x 3x12x22x32x1x2x1x3x2x 327.45-0.150.34-0.19-1.47-1.63-1.18-0.043-0.43-0.5611111111110.038 80.0300.0300.0300.0420.0420.0420.0430.0430.04332.560.190.920.299.0811.245.887.225E-0030.721.23488.6925.54124.0039.011 226.851 517.98793.560.9897.59166.42< 0.000 1< 0.000 10.279 30.000 4< 0.000 1< 0.000 1< 0.000 10.356 1< 0.000 1< 0.000 1

2.2.1 料液比和乙醇體積分數及其交互作用對提取透明質酸的結果與分析

由圖4等高線圖可明顯地看出，提取時間為最佳值25.71 h.乙醇提取體積分數和料液比兩個因素的交互作用比較顯著.在實驗水平范圍內，乙醇體積分數對HA產量的影響很大，隨著乙醇體積分數的增大，HA產量迅速增加，乙醇體積分數基本在85%～95%范圍內，HA產量可達到本次實驗中的最大值.料液比對HA產量也有很大的影響，但隨著料液比的增加，HA產量先增大后降低.觀察二者的等高線圖可以看出兩個因素的交互作用極顯著.在本次實驗水平范圍內，料液比和乙醇體積分數的值分別在2∶3 ～9∶5 (g/mL)和87%～90%的范圍內，HA的得率達到試驗最大值.

2.2.2 料液比和時間及其交互作用對提取透明質酸的結果與分析

由圖5可以直觀地看出，乙醇體積分數為最佳89.93%時，觀察等高線圖，提取時間與料液比兩個因素之間的交互效果不顯著.在本次試驗水平范圍內，提取時間對HA的得率影響不明顯，在22～30 h之間隨著濾液和乙醇體積分數兩者之間料液比的增加，得率并沒有明顯的改變，當提取時間較短時，HA的得率隨著時間的增加而增大，當時間超過26 h時，HA的得率隨著提取時間的增加并沒有明顯提高.料液比和時間處于實驗水平的中心點位置附近時，即料液比為1∶2 (g/mL)和時間約為26 h，HA得率最高．當二者的水平過高或過低時，都會使HA得率下降.由等高線的形狀可直觀地看出此兩因素的交互作用不顯著(P>0.05).

圖4 料液比、乙醇體積分數及其交互作用對提取透明質酸的響應曲面和等高線圖

圖5 料液比、時間及其交互作用對提取透明質酸的響應曲面和等高線圖

2.2.3 提取時間和乙醇提取體積分數及其交互作用對提取透明質酸的結果與分析

從圖6等高線圖可以直觀的看出，料液比為最佳100∶177 (g/mL)時，提取HA時間與乙醇提取體積分數兩個因素之間的相互交互作用顯著，在試驗水平范圍內，乙醇體積分數對HA的得率影響較大，隨著乙醇體積分數的增加HA的得率增大；提取時間較短時，HA得率隨時間的延長而增大，但當提取時間超過26 h時，HA得率隨時間的延長而減小的幅度明顯.在試驗水平范圍內，乙醇體積分數和提取時間的值分別在87%～92%和24～26 h的范圍內，此時HA的得率達到試驗最大值.

通過響應曲面分析，該模型確定提取HA的最佳工藝條件：提取時間為25.71 h、乙醇體積分數89.93%、料液比100∶177 (g/mL).

2.3 驗證實驗結果分析

從綜合實際角度考慮，采用優(yōu)化后的工藝提取HA，即提取時間為25.70 h、乙醇體積分數90.00%、料液比100∶177 (g/mL)，該工藝制備透明質酸得率為27.31%.

2.4 紫外光譜檢測結果分析

圖6 提取時間、乙醇體積分數及其交互作用對提取透明質酸的響應曲面和等高線圖

通過UV檢測確定標準HA在198 nm吸收波長處有穩(wěn)定的吸收峰.由圖7可知，確定HA最大的吸收波長為198 nm.在最大吸收峰198 nm處檢測HA樣品與HA標品的最大出峰位置及峰形是一致的，可確定該提取物質為HA.

圖7 透明質酸紫外光譜掃描圖

3 結 語

以市售新鮮雞冠為原料研究了HA提取的最佳提取方法.分別選用了丙酮和乙醇預處理提取HA，以HA得率為評價指標，采用響應曲面法優(yōu)化提取工藝.確定乙醇處理的HA得率更高為24.85%，選擇乙醇為預處理溶劑，通過響應曲面法分析，優(yōu)化HA提取工藝，確定條件為：提取時間為25.70 h、乙醇體積分數90.00%、料液比100∶177 (g/mL)，該工藝制備透明質酸得率為27.31%，通過定性試驗確定從新鮮雞冠中提取出的物質與HA標準品的波長及峰值相同.最大吸收波長為198 nm，確定雞冠中提取物質為HA.

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