杜香葉多糖的提取及抗氧化和抗腫瘤活性研究

李 雪， 王宏偉， 鄭東然， 張鴻宇， 王英逵

(東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

LI Xue

杜香葉多糖的提取及抗氧化和抗腫瘤活性研究

李 雪， 王宏偉*， 鄭東然， 張鴻宇， 王英逵

(東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

采用水提醇沉法從杜香(LedumpalustreL.)葉中提取得到多糖，通過硫酸苯酚比色法測定杜香葉多糖含量；在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行正交試驗優(yōu)化提取條件，采用試劑盒法和化學(xué)實驗法測定其體外總抗氧化活性以及DPPH·、·OH和H2O2清除能力；采用肝癌細胞HepG2為細胞模型，研究其對HepG2細胞的體外抗增殖活性。結(jié)果表明：杜香葉多糖提取的最佳條件為：液料比30∶1(mL∶g)，提取溫度80 ℃，提取時間3 h。在此條件下，多糖提取得率為7.86%±0.16%，純度為90.06%。在質(zhì)量濃度 1～5 g/L范圍內(nèi)，杜香葉多糖體外抗氧化活性和抗癌細胞增殖活性均呈現(xiàn)出量效關(guān)系趨勢。5 g/L杜香葉多糖總抗氧化能力為(10.27±0.2) U/mL，達到相同質(zhì)量濃度的Vc總抗氧化活性的95%以上；各濃度杜香葉多糖DPPH·、·OH清除能力均達到相同質(zhì)量濃度的Vc 90%以上，杜香葉多糖對H2O2清除能力在5 g/L時達到相同質(zhì)量濃度的Vc 60%以上；當(dāng)質(zhì)量濃度為5 g/L時，杜香葉多糖對HepG2細胞增殖抑制率達57.41%±0.02%。

杜香；多糖；抗氧化；抗腫瘤

杜香為杜鵑花科杜香屬的常綠灌木[1]，是大興安嶺林區(qū)的主要樹種，其分布面積約占大興安嶺林地面積的70%[2]。統(tǒng)計資料顯示[3]，大興安嶺杜香干葉年產(chǎn)量可達53萬噸以上。杜香所含化學(xué)成分豐富，含有多糖、熊果酸、揮發(fā)性精油等多種生物活性物質(zhì)[4- 10]。多糖廣泛存在于動物、植物和微生物中，由于其所具有的生物活性而得到廣泛關(guān)注。多糖的生物活性包括抗氧化、抗腫瘤、增強免疫能力、抗輻射等等[11- 15]。隨著相關(guān)研究的增多，越來越多具有生物活性的新的多糖資源不斷被發(fā)現(xiàn)，但未見杜香葉多糖抗氧化性及抗腫瘤活性的報道。因此，本研究通過水提醇沉法提取杜香葉中的多糖，并對其體外抗氧化和抗腫瘤活性進行考察，以期為杜香資源的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1原料、試劑與儀器

杜香(LedumpalustreL.)葉：由內(nèi)蒙古金河林業(yè)局提供，2015年8月采自大興安嶺山區(qū)；烘干后粉碎并過0.3 mm篩，放干燥器中備用。

總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；HepG2癌細胞株，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，美國Sigma公司；雙氧水、三氯甲烷、乙醇、正丁醇、苯酚、石油醚、濃硫酸、葡萄糖、抗壞血酸、水楊酸鈉、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉等均為分析純。

LL1500型凍干機，美國Thermo公司；UV-2800A型紫外可見分光光度計，尤尼柯上海儀器有限公司；HERA Cell 240型CO2細胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；Sorvall ST16型高速冷凍離心機，美國Thermo公司。

1.2杜香葉多糖的提取

采用水提醇沉法[16]提取杜香葉多糖：稱取20 g干燥的杜香葉粉末置于圓底燒瓶中，加入100 mL石油醚，80 ℃下水浴回流1.5 h，收集沉淀，加入一定量的水，于一定溫度下回流提取一定時間，收集提取液，離心，得上清液。將上清液濃縮后與 Sevage試劑(氯仿與正丁醇體積比5∶1)按4(體積比)∶1混合振蕩，離心，除去介于提取液與Sevage試劑交界處的變性蛋白，得上清液。加入等體積乙醇，放置過夜后離心得沉淀，用丙酮、乙醚各洗滌3次，干燥后即得杜香葉多糖，備用。提取得率=干燥后杜香葉多糖質(zhì)量/干燥杜香葉粉末質(zhì)量×100%。

1.3杜香葉多糖的含量測定

采用硫酸-苯酚法測定杜香葉多糖含量，以葡萄糖為參照制作標(biāo)準曲線。精確稱取1 g干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖，加水充分溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，定容得20 g/L葡萄糖標(biāo)準溶液。分別準確吸取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1 mL葡萄糖標(biāo)準溶液，用蒸餾水補足至1.0 mL再加入 6%的苯酚溶液0.5 mL以及2.5 mL濃硫酸，搖勻，反應(yīng)后冷卻至室溫于490 nm處測定吸光度。以吸光值為縱坐標(biāo)(Y)，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準曲線，得標(biāo)準曲線回歸方程為：Y=16.684X-0.025 7，R2=0.995 8。結(jié)果表明：葡萄糖在1～5 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.4杜香葉多糖的抗氧化和抗腫瘤活性測定

1.4.1總抗氧化能力的測定 采用總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒測定杜香葉多糖總抗氧化能力。

分別準確配制不同濃度的杜香葉多糖(最佳提取條件下獲得，下同)和抗壞血酸(Vc)溶液樣品，按照T-AOC測定試劑盒說明書進行操作。

混勻，放置10 min，在520 nm測定測定管樣品吸光度(A測定)和對照管吸光度(A對照)，根據(jù)式(1)計算杜香葉多糖及Vc的總抗氧化能力(η總)：

η總=(A測定-A對照)×N×n/(0.01×30)

(1)

式中：N—反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)(反應(yīng)液總量/取樣量)；n—樣品測試前稀釋倍數(shù)，1。

在37 ℃時，每分鐘每毫升樣品使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01時，為一個總抗氧化能力單位。

1.4.2DPPH自由基清除能力的測定 分別取不同濃度的杜香葉多糖和抗壞血酸(Vc)溶液2 mL加入等體積的DPPH乙醇溶液，混勻后室溫放置30 min 后，測定其在517 nm處的吸光度(A1)。同時測定不加DPPH的多糖溶液與乙醇混合后的吸光度(A2)，不加樣品的DPPH乙醇溶液作為空白對照的吸光度(A0)。根據(jù)式(2)計算杜香葉多糖及Vc的DPPH自由基清除率(ηDPPH·)：

ηDPPH·=(1-(A1-A2)/A0)×100%

(2)

1.4.3OH自由基清除能力的測定 取0.5 mL 2 mmol/L水楊酸鈉-乙醇溶液，加入0.5 mL 9 mmol/L硫酸亞鐵溶液，分別加入1.5 mL不同濃度多糖和抗壞血酸(Vc)溶液，最后加入0.5 mL 6 mmol/L雙氧水。37 ℃反應(yīng)1 h，在510 nm下測定吸光度(A1′)。同時測定用蒸餾水代替硫酸亞鐵溶液的吸光度(A2′)，蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照的吸光度(A0′)。根據(jù)式(3)計算杜香葉多糖及VC的OH自由基清除率(η·OH)：

η·OH=(1-(A1′-A2′)/A0′)×100%

(3)

1.4.4H2O2清除能力的測定 取2.8 mL由50 mmol/L pH值 7.4的磷酸緩沖液配制的5 mmol/L的H2O2溶液，分別加入1.0 mL不同濃度多糖和抗壞血酸(Vc)溶液，用蒸餾水補足至10.0 mL。25 ℃放置10 min后，在230 nm處測定吸光度(A1″)。同時測定不加H2O2溶液的樣品溶液的吸光度(A2″)，不加樣品的H2O2溶液吸光度(A0″)。根據(jù)式(4)計算杜香葉多糖及Vc的H2O2清除率(ηH2O2)：

ηH2O2=(1-(A1″-A2″)/A0″)×100%

(4)

1.4.5抗腫瘤活性的測定 HepG2肝癌細胞用含5%胎牛血清的培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2傳代培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HepG2細胞接于96 孔白板，使每孔細胞密度約為8×103個/mL，于37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)4 h后，移去殘余培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗1 次。其中，樣品孔中加入含100 μL不同濃度杜香葉多糖的培養(yǎng)基，對照孔中加入100 μL的培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h后開始測板，移去96 孔板內(nèi)殘余培養(yǎng)基，PBS清洗1 次，加50 μL/孔亞甲基藍溶液，于培養(yǎng)箱中放置1 h，然后移去染色液，并用去離子水清洗該96 孔板至清洗液無色，吸去板中多余水分并風(fēng)干2～3 min，加100 μL/孔由50%乙醇、49% PBS、1%醋酸配制成的洗脫液，然后置于搖床上振蕩20 min，使孔內(nèi)已染色的細胞形成均勻的細胞懸浮液，最后于570 nm波長讀取各孔中染色細胞懸浮液的吸光度A樣品組和A對照組。每個質(zhì)量濃度的杜香葉多糖做3次平行測定。根據(jù)式(5)計算杜香葉多糖的細胞增殖抑制率(y)：

y=(1-A樣品組/A對照組)×100%

(5)

2 結(jié)果與討論

2.1不同條件對杜香葉多糖提取得率的影響

2.1.1液料比 在提取溫度80 ℃、提取時間2 h條件下，液料比對杜香葉多糖提取的影響見圖1(a)。由圖1(a)可見，液料比由20∶1(mL∶g，下同)上升到30∶1時，多糖溶出增加，得率上升。然而，隨著液料比進一步增加，其他水溶性成分對多糖的溶解競爭可能增大，多糖得率降低?？紤]到液料比增加會使后續(xù)濃縮環(huán)節(jié)能耗增大，從而造成提取成本的增加。因此，液料比為30∶1時，提取效果最好。一般情況下，在保證提取率的前提下，液料比越小越好。本研究中嘗試過液料比為10∶1的情況，由于過篩后的干粉吸水性強，所以在液料比10∶1時幾乎無法得到溶液，導(dǎo)致無法進行有效的提取和后續(xù)的實驗測定。

2.1.2提取溫度 在液料比30∶1、提取時間2 h條件下，溫度對杜香葉多糖提取的影響見圖1(b)。由圖1(b)可見，提取溫度由60 ℃上升到80 ℃過程中，多糖溶出增加，得率上升。然而，隨著溫度進一步上升，多糖得率有所降低?？紤]到溫度升高可能引起多糖的降解和提取成本的增加。因此，提取溫度為80 ℃時，提取效果最好。

2.1.3提取時間 在液料比30∶1、提取溫度80 ℃下，時間對杜香葉多糖提取的影響見圖1(c)。由圖1(c)可見，提取時間由1 h上升到3 h過程中，多糖溶出增加。然而，隨著時間進一步增加，多糖得率基本不變。綜合考慮提取效率以及提取時間延長造成提取成本增加。因此，提取時間為3 h時，提取效果最好。

圖1 不同條件對杜香葉多糖提取得率的影響

2.2正交試驗優(yōu)化

正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析見表1。由表1可見，極差為C>A>B，即3因素對提取得率影響順序依

表1 正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析Table 1 The results of extraction orthogonal test

次為：浸提溫度>液料比>浸提時間。這與文獻[7]得出的結(jié)果一致。由正式試驗得到的最佳提取條件為：液料比30∶1，提取溫度80 ℃，提取時間3 h。在此條件下進行3次驗證實驗，得到杜香葉多糖提取得率為7.86%±0.16%，多糖純度為90.06%。

2.3杜香葉多糖的抗氧化及抗腫瘤活性

2.3.1總抗氧化能力 不同質(zhì)量濃度杜香葉多糖總抗氧化能力見圖2。由圖2可見，杜香葉多糖總抗氧化能力與Vc的總抗氧化能力接近，并且隨著質(zhì)量濃度增大，抗氧化能力增強。杜香葉多糖質(zhì)量濃度為5 g/L時，總抗氧化能力為(10.27±0.2) U/mL，達到相同質(zhì)量濃度的Vc總抗氧化能力(10.70±0.33)U/mL的95%以上。可以看出，杜香葉多糖總抗氧化能力較強。

2.3.2對DPPH自由基清除能力 不同質(zhì)量濃度杜香葉多糖DPPH自由基清除能力見圖3。由圖3可見，杜香葉多糖與Vc的DPPH自由基清除能力均隨著質(zhì)量濃度增大具有增強趨勢。各濃度杜香葉多糖DPPH自由基清除能力均達到相同質(zhì)量濃度的Vc 95%以上，說明杜香葉多糖對DPPH自由基清除能力較強。

圖2杜香葉多糖總抗氧化能力

Fig.2Totalantioxidantcapabilityofpolysaccharide

圖3杜香葉多糖對DPPH自由基清除能力

Fig.3ThescavengingeffectonDPPHfreeradicalofpolysaccharide

2.3.3對OH自由基清`葉多糖對OH自由基清除能力見圖4(a)。由圖4(a)可見，杜香葉多糖與Vc對OH自由基清除能力均隨著質(zhì)量濃度增大具有增強趨勢。5 g/L時杜香葉多糖對OH自由莖清除率為67.05%±0.20%。各濃度杜香葉多糖對OH自由基清除能力均達到相同質(zhì)量濃度的Vc 90%以上，說明杜香葉多糖對OH自由基清除能力較強。

2.3.4對H2O2清除能力 不同質(zhì)量濃度杜香葉多糖對H2O2清除能力見圖4(b)。由圖4(b)可見，杜香葉多糖與Vc對H2O2清除能力均隨著質(zhì)量濃度增大具有增強趨勢。杜香葉多糖質(zhì)量濃度為5 g/L時，對H2O2清除能力基本達到最大，清除率為47.78%±0.33%，達到Vc(79.16%±0.36%)的60%以上。

2.3.5抗腫瘤活性 杜香葉多糖的抗腫瘤活性見圖5。由圖5可見，杜香葉多糖對HepG2細胞具有抗增殖作用，并且隨著質(zhì)量濃度增大，抗增殖作用增強。杜香葉多糖質(zhì)量濃度為5 g/L時，HepG2細胞增殖抑制率可以達到57.41%±0.02%。

圖4杜香葉多糖對OH(a)和H2O2(b)清除能力

Fig.4ThescavengingeffectonOHfreeradical(a)andH2O2(b)ofpolysaccharide

圖5杜香葉多糖對HepG2細胞抗增殖作用

Fig.5AntiproliferativeofpolysaccharideonHepG2cells

3 結(jié) 論

3.1通過水提醇沉法從杜香葉中提取多糖，通過單因素和正交試驗考察了不同條件對杜香葉多糖提取得率的影響。結(jié)果表明：最佳提取條件為：液料比30∶1，提取溫度80 ℃，提取時間3 h。此條件下，多糖提取得率為7.86%±0.16%，純度為90.06%。

3.2通過試劑盒法、化學(xué)實驗法以及采用人肝癌細胞HepG2為細胞模型評價了杜香葉多糖的體外抗氧化能力及抗腫瘤活性。結(jié)果表明：在質(zhì)量濃度1～5 g/L范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度增加，抗氧化能力和抗癌細胞增殖能力增強。5 g/L杜香葉多糖總抗氧化能力為(10.27±0.2) U/mL，達到相同質(zhì)量濃度的Vc總抗氧化活性的90%以上；各濃度杜香葉多糖DPPH自由基清除能力、OH自由基清除能力均達到相同質(zhì)量濃度的Vc 90%以上；杜香葉多糖對H2O2清除能力在5 g/L時達到Vc的60%以上；當(dāng)質(zhì)量濃度為5 g/L時，杜香葉多糖對HepG2細胞增殖抑制率可以達到57.41%±0.02%。

3.3研究表明，杜香葉多糖具有一定的抗氧化、抗腫瘤活性，可對其資源進一步開發(fā)，作為一種新型的天然抗氧化劑和抗癌活性成分應(yīng)用于保健食品、化妝品和生物制藥等行業(yè)。特別是近年來中草藥提取物的癌癥輔助治療逐漸成為熱點，杜香葉有望成為新的有效的抗癌資源。

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Extraction and Antioxidant, Antiproliferative Activities of Polysaccharide from Ledum palustre L. Leaves

LI Xue, WANG Hongwei, ZHENG Dongran, ZHANG Hongyu, WANG Yingkui

(Life Science College, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

The polysaccharide fromLedumpalustreL. leaves was obtained by ethanol precipitation， and its content was determined by phenol-sulfuric acid assay. Based on the single-factor test, a orthogonal test was designed to optimize the extracting conditions．The total antioxidant activity and the scavenging effect on DPPH free radical, OH free radical and H2O2by the polysaccharide fromL.palustreleavesinvitrowere determined by the kit method and chemical method. The antiproliferative activity was evaluated on human liver cancer HepG2 cellsinvivo. The results showed that the best extracting conditions of the polysaccharide were: the liquid-solid ratio 30∶1(v/w), extraction temperature 80 ℃ and extraction time 3 h．Under these conditions，the extraction yield of the polysaccharide was 7.86%±0.16% and the purity reached 90.06%. In the range of 1-5 g/L, the antioxidant and antiproliferative activities increased with an increase of mass concentration. At the mass concentration of 5 g/L, the total antioxidant activity was(10.27±0.2) U/mL and reached more than that of 95% Vc with the same mass concentration. The scavenging effects on DPPH free radical and OH free radical in different concentration reached more than those of 90% of Vc with the same mass concentration. The scavenging effect on H2O2reached more than that of 60% Vc with the same mass concentration and the proliferation inhibitory rate of HepG2 cells was 57.41%±0.02% at the mass concentration of 5 g/L.

LedumpalustreL.; polysaccharide; antioxidant; anti tumor

2017- 02- 03

國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目資助(201510225154)

李 雪(1994— )，女，山東淄博人，本科生，研究方向為生物活性物質(zhì)的制備與應(yīng)用

*通訊作者：王宏偉，副教授，研究方向為生物活性物質(zhì)的制備與應(yīng)用；E-mail: 84970486@qq.com。

10.3969/j.issn.0253-2417.2017.05.018

TQ35；S789.4

A

0253-2417(2017)05- 0133- 06

李雪,王宏偉,鄭東然，等.杜香葉多糖的提取及抗氧化和抗腫瘤活性研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2017，37(5)：133 - 138.