竹葉總黃酮對脂肪酸合酶及人乳腺癌細胞的抑制作用

李夏冰， 金昭君， 荀 航， 湯 鋒， 馬曉豐， 岳永德

(1.國際竹藤中心 國家林業(yè)局竹藤科學與技術重點實驗室，北京 100102；2.中國科學院大學 生命科學學院，北京 101407)

LI Xiabing

竹葉總黃酮對脂肪酸合酶及人乳腺癌細胞的抑制作用

李夏冰1， 金昭君2， 荀 航1， 湯 鋒1， 馬曉豐2， 岳永德1*

(1.國際竹藤中心 國家林業(yè)局竹藤科學與技術重點實驗室，北京 100102；2.中國科學院大學 生命科學學院，北京 101407)

研究了毛竹、苦竹、闊葉箬竹、淡竹竹葉總黃酮對脂肪酸合酶(FAS)和人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)的體外抑制活性。通過紫外分光光度法測定竹葉總黃酮對FAS的抑制作用，CCK-8法檢測MDA-MB-231細胞的體外增殖抑制作用，流式細胞儀檢測MDA-MB-231細胞凋亡作用。結果表明：毛竹、苦竹、闊葉箬竹、淡竹竹葉總黃酮粗提物對FAS抑制活性顯著，其IC50依次為：112.43、153.29、161.32和 195.09 mg/L；4種竹葉總黃酮粗提物對MDA-MB-231細胞具有顯著體外抑制活性，且具有良好的量效關系。竹葉總黃酮的主要活性部位為大孔樹脂70%和95%乙醇相；苦竹竹葉95%乙醇相對MDA-MB-231細胞抑制活性最強，當質量濃度100、200、400 mg/L時對MDA-MB-231細胞增殖抑制率分別為25%、44%和70%；凋亡率分別為11.1%、23.1%和38.7%。

竹葉總黃酮；脂肪酸合酶；人乳腺癌細胞MDA-MB-231；細胞凋亡

脂肪酸合酶(EC.2.3.1.85，F(xiàn)AS)是生物體內能量代謝系統(tǒng)中一種重要的多功能復合酶，它催化乙酰輔酶 A和丙二酸單酰輔酶 A合成長鏈脂肪酸[1]。大量研究證明，F(xiàn)AS 在多種癌細胞，特別是以乳腺癌為代表的雌激素類癌細胞中呈高效表達，而在正常組織細胞中幾乎不表達，這種差異表明其可能是相關癌癥靶向治療的潛在靶點[2]。乳腺癌是女性群體中排名第一的常見惡性腫瘤[3]，目前有效的治療藥物仍然較少，以 FAS 為靶點尋找有抗腫瘤應用價值的 FAS抑制劑意義重大。2003年，Li等[4]發(fā)現(xiàn)首烏和高良姜根提取物具有較強的 FAS 抑制活性，是國內外較早的對藥用植物提取物進行 FAS抑制活性的研究報道。2004年張睿等[5]發(fā)現(xiàn)綠茶提取物具有顯著的 FAS抑制活性。另外，虎杖、銀杏葉、元寶楓、首烏藤、羅布麻等多種植物都被報道具有較好的 FAS抑制活性[6]。這些植物提取物大多是以 40%～60%乙醇作為提取溶劑，研究者們推測其表現(xiàn)出 FAS抑制活性的原因可能是提取物中含有黃酮類、多酚類化合物的原因。竹葉在我國具有悠久的藥用和食用歷史，是中醫(yī)一味著名的清熱解毒藥。《文經逢原》記載：“竹葉兼行肌表，能療瘡殺蟲”。竹葉總黃酮(BLF)是竹葉中一類重要的化學成分，具有優(yōu)良的生物活性，如：清除自由基、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒、抗脂質過氧化及保護心腦血管等[7- 8]。然而，竹葉總黃酮對FAS和乳腺癌細胞是否具有抑制活性的研究仍未見報道。因此，本研究選取毛竹、苦竹、闊葉箬竹、淡竹竹葉為原料，70%乙醇作為溶劑提取竹葉總黃酮，測定其對 FAS和人乳腺癌 MDA-MB-231細胞抑制活性，利用大孔樹脂分離純化追蹤活性部位，旨在為尋找高效、安全的抗腫瘤藥物提供理論依據。

1 實 驗

1.1原料、試劑與儀器

苦竹(Pleioblastusamarus(Keng) keng)、闊葉箬竹(Indocalamuslatifolius(Keng) McClure)、毛竹(Phyllostachysheterocycla(Carr.) MitfordPubescens)、淡竹(PhyllostachysglaucaMcClure)竹葉均采自四川宜賓長寧世紀竹種園，經李本祥工程師鑒定。竹葉經自然陰干后粉碎，于-20 ℃保存待用。

脂肪酸合酶(FAS)：由中國科學院大學生命科學院酶學課題組從新鮮雞肝中分離提純，其制備和儲存采用Tian報道的方法[9]。細胞株：人乳腺癌細胞株(MDA-MB-231)購于中國科學院上海細胞庫。

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清均購于Gibco公司；磷酸緩沖液(PBS)、0.25%胰酶-EDTA、青霉素、鏈霉素、二甲基亞砜(DMSO)和二硫蘇糖醇(DTT)購于Sigma公司；細胞培養(yǎng)板購于Corning公司；Annexin V-FITC試劑盒、CCK-8試劑盒購于Dojindo公司；石油醚、無水乙醇為分析純，購于北京化工股份有限公司；HP20大孔樹脂為分析級，購于三菱化學。

Free Zone型真空冷凍干燥儀，美國LABCONCO；KQ-500型超聲波清洗器，昆山超聲波儀器有限公司；BCN-1360型無菌操作臺，哈爾濱東聯(lián)電子技術公司；HF90型二氧化碳培養(yǎng)箱，上海力康；DM 500 ICC50 HD型倒置顯微鏡，德國萊卡；M5型多功能讀板機，美國分子儀器；細胞計數器，美國Invitrogen；CYTOMIC FC 500型流式細胞儀，美國貝克曼；UV1800型紫外分光光度計，日本SHIMADZU。

1.2實驗方法

1.2.1竹葉總黃酮樣品的制備 準確稱取竹葉粉末100 g置于具塞三角瓶中，以體積分數70%乙醇按料液比1∶20(g∶mL)于60 ℃下超聲波提取1 h，重復提取4次，合并提取液，減壓蒸餾，先經石油醚萃取，再依次用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)為9∶1、9∶2、9∶3、9∶6的混合溶液萃取，重復3次；用4%明膠水溶液進行沉淀，至沉淀完全，過濾，濾液減壓蒸餾至近干，加入3～5倍體積乙醇，使過量明膠沉淀，過濾去沉淀。將得到的溶液減壓蒸餾，冷凍干燥，得到竹葉總黃酮粗提物樣品，蘆丁法測定竹葉總黃酮含量[10]，待用。

竹葉總黃酮的純化：竹葉總黃酮粗品用少量的水溶解， 經HP-20大孔樹脂分離，分別用水相，體積分數15%、30%、50%、70%、95%乙醇500 mL依次洗脫，收集各系統(tǒng)相，濃縮凍干，待用。

1.2.2竹葉總黃酮對FAS的抑制活性 FAS活性測定采用分光光度法，以5 μmol/L乙酰輔酶A，10 μmol/L丙二酸單酰輔酶A，35 μmol/L NADPH為底物，在含有1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，100 mmol/L KH2PO4-K2HPO4緩沖液(pH值7.0)中37 ℃下溫育，加入15～20 μg FAS啟動反應，監(jiān)測340 nm波長處光密度變化，反應中NADPH氧化為NADP+，摩爾消光系數為6.02×103，由初速度得到酶反應速度計算FAS的酶活性，反應總體積為2 mL。

用磷酸緩沖液配制不同質量濃度竹葉總黃酮藥液，加入測活體系中，再加入FAS啟動反應，測定酶的活性為A，以磷酸緩沖液作空白溶劑測得結果A0為對照，A/A0為反應后的相對剩余酶活力。

1.2.3竹葉總黃酮對MDA-MB-231細胞體外增殖的抑制活性 MDA-MB-231用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在 37 ℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數生長期的MDA-MB-231 細胞制成濃度為5×104個/mL的細胞懸液，接種于96 孔板中。每孔體積為 200 μL，生化培養(yǎng)箱培養(yǎng) 12 h。待細胞貼壁后，吸去培養(yǎng)基，加入不含血清的培養(yǎng)基配置的竹葉總黃酮藥液200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸去藥液，每孔加入含10%的CCK-8的培養(yǎng)基200 μL，繼續(xù)孵化4 h，多功能讀板機 450 nm 下測定各孔吸光度值A。每組設3個復孔，同時設置空白組(加入不含藥液的培養(yǎng)基)，吸光度為A0，A/A0為反應后的相對細胞活力。

1.2.4竹葉總黃酮對MDA-MB-231細胞的凋亡作用 將對數生長期的細胞按5×104個/mL均勻接種于6孔板，讓細胞貼壁過夜，移去培養(yǎng)基，分別加入質量濃度為100、200和400 mg/L的竹葉總黃酮藥液的無血清培養(yǎng)基孵育24 h，收集細胞及其上清液進行1 500 r/min、4 ℃離心5 min；預冷PBS洗2次，加入500 μL 預冷的Annexin V結合緩沖液、5 μL Annexin V和5 μL PI染液輕輕振蕩混勻，避光孵育 15 min，過37 μm濾膜，30 min內進行流式細胞定量分析。

1.3統(tǒng)計學處理

2 結果與討論

2.1竹葉總黃酮對FAS的抑制作用

以500 nm下測定的蘆丁標準品溶液的吸光度值與質量濃度的關系，作線性回歸，得到回歸方程為

表1 4種竹葉總黃酮粗提物得率及其質量分數Table 1 Extract rate and contents of total flavonoids in bamboo leaves

y=7.243 4x-0.006 1，R2=0.999 5。表1為竹葉總黃酮粗提物得率及總黃酮質量分數。4種竹葉總黃酮粗提物中，苦竹竹葉總黃酮得率最高，為9.33%，總黃酮質量分數為17.27%；闊葉箬竹、毛竹、淡竹總黃酮得率依次為8.98%、8.52%和6.95%，其總黃酮質量分數依次為15.13%、15.02%和13.97%。

圖1 不同質量濃度竹葉總黃酮粗提物對FAS的抑制作用Fig.1 Inhibition to FAS with different BLF concentrations

將上述4種竹葉總黃酮粗提物配制成不同濃度藥液，加入測活體系測定其對FAS抑制作用，以相對剩余酶活力為縱坐標，測活體系中竹葉總黃酮質量濃度為橫坐標，結果如圖1所示。

由圖1可知，4種竹葉總黃酮對FAS均有顯著的抑制作用，抑制作用強弱依次為苦竹>毛竹>闊葉箬竹>淡竹，其IC50分別為112.43、153.29、161.32和195.09 mg/L。與竹葉總黃酮含量高低具有一定的相關性，這表明竹葉乙醇提取物中黃酮類化合物可能是抑制FAS的有效成分。

2.2對MDA-MB-231細胞體外增殖的抑制作用

2.2.1竹葉總黃酮粗提物 利用CCK-8法篩選4種竹葉總黃酮粗提物對MDA-MB-231細胞的體外增殖抑制活性，結果如表2所示。由表2可知，在不同質量濃度下，4種竹葉總黃酮均對MDA-MB-231細胞具有顯著的體外增殖抑制活性。

表2 竹葉總黃酮粗提物對人乳腺癌細胞的體外增殖抑制作用1)Table 2 The anti-proliferation effects of bamboo leavesflavonoids on MDA-MB-231 in vitro

1) 數值=平均值±標準誤(n=3)，采用鄧肯氏新復極差檢驗法(DMRT法)與空白對照進行比較，列中不同字母表示差異顯著(P=0.05)，下表同values are mean±S.E.(n=3), values in a line followed by different letters are significantly different according to duncan’s Multiple comparison(DMRT,P=0.05), the same as following table

由表2還可以看出，隨著竹葉總黃酮質量濃度的增加，MDA-MB-231細胞活力顯著下降，且呈良好的量效關系，在3個不同質量濃度下，4種竹葉總黃酮對MDA-MB-231細胞抑制活性強弱均為苦竹>毛竹>闊葉箬竹>淡竹，這與2.1節(jié)竹葉總黃酮對FAS的體外抑制實驗結果一致。竹葉總黃酮可能是通過抑制MDA-MB-231細胞內FAS活性來抑制癌細胞的生長，這為開發(fā)新型的抗腫瘤藥物提供了可能。

2.2.2竹葉總黃酮不同流分 利用HP-20大孔樹脂對4種竹葉總黃酮粗提物進行分離純化，得到竹葉總黃酮不同流分樣品，CCK-8檢測其對MDA-MB-231細胞體外增殖抑制作用，結果如表3所示。

由表3可知，質量濃度為100、200、400 mg/L 時，4種竹葉總黃酮主要活性部位均為70%和95%乙醇相，其他流分抑制活性不顯著。當質量濃度為100、200和400 mg/L時，苦竹竹葉總黃酮95%乙醇相對MDA-MB-231細胞增值抑制率分別為25%、44%和70%。

研究表明，竹葉總黃酮主要為芹菜素、苜蓿素和木犀草素等幾大類苷元和黃酮苷類化合物[11]。經大孔樹脂分離純化后，竹葉總黃酮主要活性部位為極性相對弱的70%和95%乙醇相，且95%乙醇相活性最強。推斷竹葉總黃酮苷元類化合物為主要活性成分，部分黃酮苷也可能具有強的抑制活性，值得進行深入研究。

表3 竹葉總黃酮不同流分對人乳腺癌細胞的體外增殖抑制作用Table 3 Inhibition of proliferation of MDA-MB-231 induced by different ethanolfraction of flavonoids from bamboo leaves

2.3竹葉總黃酮對MDA-MB-231的凋亡作用

苦竹竹葉總黃酮大孔樹脂70%乙醇相和95%乙醇相配制成質量濃度為100、200和 400 mg/L 的藥液孵育 MDA-MB-231細胞24 h，采用流式細胞儀分別檢測 MDA-MB-231細胞凋亡作用，結果如圖2和圖3所示。由圖可知，不同質量濃度竹葉總黃酮處理組細胞的凋亡率較空白對照組細胞明顯增加，且凋亡率隨竹葉總黃酮乙醇相濃度的增加而上升?？瞻讓φ战M的凋亡率為2.9%和3.9%。當質量濃度為100、200、400 mg/L時，苦竹竹葉總黃酮70%和95%乙醇相對MDA-MB-231細胞的凋亡率分別為 11.4%、23.3%、36.7%和11.1%、23.1%、38.7%。表明苦竹竹葉總黃酮 70%和 95%乙醇相能誘導MDA-MB-231人乳腺癌細胞凋亡。

圖2 苦竹竹葉總黃酮70%乙醇相對MDA-MB-231凋亡作用的影響

圖3 苦竹竹葉總黃酮95%乙醇相對MDA-MB-231凋亡作用的影響Fig.3 Effect of Pleioblastus amarus BLF 95% ethanol fractionon apoptosis of MDA-MB-231cells

3 結 論

3.1以苦竹、毛竹、闊葉箬竹和淡竹竹葉為原料，采用超聲波乙醇提取得到4種竹葉總黃酮，采用紫外分光光度法測定了竹葉總黃酮對脂肪酸合酶(FAS)體外抑制作用，CCK-8法測定了竹葉總黃酮對人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)的體外增殖抑制作用。結果表明：苦竹、毛竹、闊葉箬竹和淡竹4種竹葉總黃酮粗提物對FAS均具有顯著的抑制活性，IC50值分別為112.43、153.29、161.32和195.09 mg/L；4種竹葉總黃酮粗提物均對MDA-MB-231細胞具有顯著的體外抑制作用，且呈良好的量效關系。這表明竹葉總黃酮對MDA-MB-231細胞抑制作用可能是通過抑制細胞內FAS活性實現(xiàn)。

3.2利用HP-20大孔樹脂分離純化追蹤4種竹葉總黃酮有效活性部位，CCK-8法檢測4種竹葉不同流分對MDA-MB-231細胞體外增殖抑制作用。結果表明：4種竹葉總黃酮主要活性部位為70%和95%乙醇相，極性相對較弱；苦竹竹葉95%乙醇相對MDA-MB-231細胞抑制活性最強，當質量濃度為100、200和400 mg/L時對MDA-MB-231細胞增殖抑制率分別為25%、44%和70%。推斷竹葉總黃酮苷元類化合物為主要活性成分，部分黃酮苷也可能具有強的抑制活性。

3.3采用流式細胞儀檢測苦竹竹葉總黃酮70%和95%乙醇相對MDA-MB-231細胞凋亡作用，結果表明：苦竹竹葉總黃酮70%和95%乙醇相均能誘導MDA-MB-231凋亡，且與濃度成正比；當質量濃度為100、200和400 mg/L時，95%乙醇相對MDA-MB-231細胞的凋亡率分別為11.1%、23.1%和38.7%。

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Inhibitory Effects of Bamboo Leaves Flavonoids on Fatty Acid Synthase and Human Breast Cancer Cells

LI Xiabing1, JIN Zhaojun2, XUN Hang1, TANG Feng1, MA Xiaofeng2, YUE Yongde1

(1.International Centre for Bamboo and Rattan，Key Laboratory of Science and Technology of Bamboo and Rattan,State Forestry Administration,Beijing 100102, China; 2.College of Life Sciences,Univercity of ChineseAcademy of Sciences, Beijing 101407, China)

The inhibitory effects of bamboo leaves flavonoids (BLF) from the species ofPleioblastusamarus(Keng) keng,Indocalamuslatifolius(Keng) McClure,Phyllostachysheterocycla(Carr.) MitfordPubescensandP.glaucaMcClure on the fatty acid synthase (FAS) and human breast cancer cell MDA-MB-231invitrowere studied. The inhibitory effects of bamboo leaves flavonoids on FAS were determined by UV spectrophotometry, and the inhibitory effects of MDA-MB-231 were detected by CCK-8 assay. Flow cytometry was used to detect the apoptosis of MDA-MB-231. The results showed that all four bamboo leaves flavonoids had significant inhibitory effects on FAS and MDA-MB-231 cells. The IC50values of four flavonoids against FAS were 112.43, 153.29, 161.32 and 195.09 mg/L, respectively. The inhibition effects of flavonoids on MDA-MB-231 followed the dose-effect relationship. Further studies showed that the 70% and 95% ethanol fraction of bamboo leaves flavonoids exhibited the strongest cytotoxicity. The inhibition rates against MDA-MB-231 at the mass concentration of 100, 200, 400 mg/L of 95% ethanol fraction ofP.amaruswere 25%, 44% and 70%, and the apoptosis rates were 11.1%, 23.1% and 38.7%, respectively.

bamboo leaves flavonoids; FAS; human cacer cells MDA-MB-231; apoptosis

2017- 03- 06

國際竹藤中心基本科研業(yè)務經費(1632015012)

李夏冰(1987— )，男，安徽安慶人，博士生，主要從事竹藤化學研究工作

*通訊作者：岳永德，教授，博士生導師，研究領域為竹藤資源化學利用；E-mail: yueyd@icbr.ac.cn。

10.3969/j.issn.0253-2417.2017.05.015

TQ35

A

0253-2417(2017)05- 0113- 06

李夏冰,金昭君,荀航,等.竹葉總黃酮對脂肪酸合酶及人乳腺癌細胞的抑制作用[J].林產化學與工業(yè)，2017，37(5)：113 - 118.